High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

Summary

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

Abstract

Een hoge-resolutie oxygraaf is een apparaat voor het meten van cellulair zuurstofverbruik in een gesloten-kamersysteem met zeer hoge resolutie en gevoeligheid in biologische monsters (intacte en gepermeabiliseerde cellen, weefsels of geïsoleerde mitochondriën). Het hoge-resolutie oxygraafapparaat is uitgerust met twee kamers en gebruikt polarografische zuurstofsensoren om de zuurstofconcentratie te meten en het zuurstofverbruik binnen elke kamer te berekenen. Zuurstofverbruikscijfers worden berekend met behulp van software en uitgedrukt als picomol per seconde per aantal cellen. Elke hoge-resolutie oxygraafkamer bevat een stop met injectiepoorten, wat het ideaal maakt voor substraat-ontkoppelingsremmer titraties of detergent titratie protocollen voor het bepalen van effectieve en optimale concentraties voor plasmamembraan permeabilisatie. De techniek kan worden toegepast om ademhaling te meten in een breed scala van celtypen en biedt ook informatie over mitochondriale kwaliteit en integriteit, en maximale mitochondriale ademhalingselektrontransportsysteemcapaciteit.

Introduction

Mitochondriën vervullen een belangrijke rol in de cellulaire energiemetabolisme, vooral door toepassing van zuurstof aan adenosine trifosfaat (ATP) te produceren. Ze zijn betrokken bij celdood en in verschillende humane ziekten. Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) combineert elektron transport langs de elektronen transportketen met zuurstofverbruik en ATP synthese. De mitochondriale tricarbonzuur (TCA) cyclus is betrokken bij de omzetting van eiwitten, koolhydraten en vetten in energierijke verbindingen nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en flavineadeninedinucleotide (FADH _2). Elektronen van NADH en FADH ₂ worden vervolgens overgebracht naar de luchtwegen elektronentransportketen eiwitcomplexen (I tot IV) in het binnenste mitochondriale membraan. Bovendien kunnen twee andere redox pathways elektronen overdragen aan elektronen transportketen: i) mitochondriale elektron overbrengende flavoproteïne (ETF) dat zich op het vlak van de matrix binnenste mitochondrial membraan en levert elektronen van vetzuur β-oxidatie; en ii) mitochondriale glycerofosfaatdehydrogenase die glycerofosfaat oxideert tot dihydroxyacetonfosfaat en voedt elektronen de mitochondriale elektronentransportketen. Complex IV (de uiteindelijke elektronenacceptor) kan de elektronen een zuurstofmolecuul omzetten zuurstof twee moleculen water. Verplaatsen van de elektronen van respiratoire elektronentransportketen complex I tot IV wordt gekoppeld proton stroom vanaf de mitochondriale matrix intermembrane de ruimte die een elektrochemische gradiënt over de mitochondriale binnenmembraan vaststelt. Daarna mitochondriale complex V (ATP synthase) shuttles waterstofionen terug in de mitochondriale matrix en synthetiseert ATP moleculen. OXPHOS functie in vivo en in vitro gebruik van verschillende technieken en verschillende mitochondriale respiratie toestanden kunnen worden verkregen worden beoordeeld. In geïsoleerde mitochondria de volgende respiratory toestanden kunnen worden gemeten: i) basaal mitochondriale respiratie (stand 1), ii) zuurstofverbruik na toevoeging van specifieke substraten van de mitochondriale ademhalingsketen complexen (stand 2), iii) maximale mitochondriale zuurstofconsumptie na toevoeging van verzadigende concentraties adenosine difosfaat (ADP) (toestand 3) en, iv) rusten ademhaling na ADP verbruik (omgerekend naar ATP) (staat 4). In intacte cellen kan de volgende luchtwegen toestanden worden gemeten: i) basale cellulaire zuurstofverbruik in aanwezigheid van endogene substraten en ADP, ii) basale cellulaire zuurstofverbruik in aanwezigheid van oligomycin (oligomycin ongevoelige ademhaling) en oligomycine-gevoelige ademhaling (ATP omzet), iii) FCCP ontkoppeld ademhaling, en iv) niet-mitochondriale respiratie na toevoeging van antimycin A en rotenon. In gepermeabiliseerde cellen kunnen specifieke substraten van de elektronentransport keten complexen en ADP toegevoegd en maximale complexe afhankelijke ademhalingssnelheid such zo complex I, II en IV-afhankelijke respiratoire tarieven kunnen worden gemeten.

Metingen van cellulaire ademhaling belangrijke inzichten in mitochondriale ademhalingscapaciteit specifieke complexen I-IV, mitochondriale integriteit en energiemetabolisme ^{1, 2, 3.} Een van de hulpmiddelen die metingen van mitochondriale zuurstofverbruik met een hoge nauwkeurigheid, resolutie en gevoeligheid in staat is de hoge-resolutie oxygraph ^4. De hoge resolutie oxygraph apparaat bevat twee kamers met injectiepoorten en elke kamer is voorzien van een polarografische zuurstofsensor. Cellulair of geïsoleerde mitochondriële schorsingen worden continu in de respirometer geroerd. Mitochondriale functie, substraten en remmers beoordelen op mitochondriale complex activiteit worden toegevoegd volgens standaard protocollen. Substraten en remmers kunnen worden getitreerd door injectie into de kamers van de oxygraph en zuurstofverbruik tarieven worden berekend met behulp van software en uitgedrukt als picomol per seconde per aantal cellen. Hoge-resolutie respirometrie biedt verschillende voordelen vergeleken met traditionele en gebruikelijke polarografische zuurstofelektrode inrichtingen waaronder verhoogde gevoeligheid en kunnen werken met kleine hoeveelheden biologische monsters zoals intacte of gepermeabiliseerde cellen. Bovendien, elke inrichting bevat twee kamers en ademfrequentie tegelijk worden opgenomen voor vergelijkingen van zuurstofconcentraties. De hoge-resolutie oxygraph heeft ook het voordeel van verminderde lekkage van zuurstof uit het apparaat kamers in vergelijking met traditionele polarografische zuurstof stroomdraden. Een ander apparaat recent ontwikkelde cellulaire zuurstofverbruik te meten, is de 96-well extracellulaire flux analyzer ^5. Het extracellulaire flux analysator voorzien van fluorescentie in plaats van polarografische sensoren. De voordelen van de extracellulaireflux analyzer vergelijking met de hoge-resolutie oxygraph zijn i) het is een grotendeels geautomatiseerd middel, ii) kan zuurstofconsumptie meten 24- en 96-well platen voor high-throughput screening, daarvoor zijn kleinere hoeveelheden biologische monsters, en iii) aanvullende meting van cellulaire glycolytische flux mogelijk. De nadelen van de extracellulaire flux analysator in vergelijking met de hoge-resolutie oxygraph zijn i) de hoge kosten van het apparaat en verbruiksartikelen zoals fluorescerende platen, die niet herbruikbaar zijn en ii) slechts vier verbindingen per assay / putje injecteerbare daarom is het systeem niet haalbaar substraat-ontkoppelaar-inhibitor titratie protocollen.

In de huidige studie, maken we gebruik van een hoge resolutie respirometrie mitochondriale ademhaling te bepalen. Voor cellulaire zuurstofverbruik experimenten worden de cellen permeabel gemaakt om de invoer van exogene ADP en mitochondriale oxideerbare substraten mogelijk maken toevoeren elektronen in complexes van de luchtwegen. Deze aanpak maakt het ontleden van afzonderlijke complexen mitochondriale respiratoire capaciteit, hetgeen een duidelijk voordeel in vergelijking met intacte cellen (vele substraten cel-impermeant). Echter celmembraan permeabilisatie de barrière tussen het cytosol en extracellulaire ruimte en medium (wassen cytosolisch opgeloste stoffen) en de samenstelling van de intracellulaire ruimte is geëquilibreerd met de extracellulaire ruimte verstoren. Een van de nadelen van gepermeabiliseerde cellen over intacte cellen die de mitochondriale buitenste membraan kan beschadigd raken als grote hoeveelheden reinigingsmiddel worden gebruikt tijdens cel permeabilisatie. In intacte cellen, basale, gekoppeld en ontkoppeld ademhaling van intacte cellen kan worden gemeten. Deze methode evalueert zuurstofverbruik van intacte cellen zonder toevoeging van exogene substraten en ADP, reproduceren de ademhalingsfunctie in de geïntegreerde cel en het leveren van gegevens over maximale mitochondriale electron transport capaciteit ^{6, 7.} Een van de voordelen van intacte cellen in gepermeabiliseerde cellen die cellulaire omgeving niet verstoord en mitochondria in contact met de gehele componenten van de cellen. Om de cellulaire plasmamembraan permeabel zijn detergentia, zoals digitonine ⁸ gebruikt. Echter, mitochondriale buitenste membraan integriteit in het gedrang komen als grote hoeveelheden digitonine worden toegepast. Dat mitochondriale buitenste membraan integriteit niet in gepermeabiliseerde cellen aangetast bevestigen, wordt digitonine titratie uitgevoerd om de optimale concentratie voor mobiele permeabilisatie bepalen. Voor deze experimenten worden cellen opnieuw gesuspendeerd in medium ademhaling en digitonine concentratie wordt getitreerd met respirometrie in aanwezigheid van mitochondriale substraten en ADP en ademhalingssnelheden gemeten. Ademhaling van intacte, niet- gepermeabiliseerde cellen niet gestimuleerd in aanwezigheid van mitochondrial substraten en ADP. Toch zou daaropvolgende stapsgewijze digitonine titratie geleidelijke permeabilisatie van plasmamembranen opbrengst en optimale digitonine concentratie verkregen. Dit blijkt uit de toename van de ademhaling tot volledige permeabilisatie. Mitochondriale kwaliteit en buitenste membraan kunnen worden geverifieerd door het toevoegen van exogeen cytochroom c ^{2, 9.} Cytochroom c is een 12 kDa eiwit elektronen uitvoering van de mitochondriale elektronentransportketen ^{10, 11, 12.} Het is gelokaliseerd in het mitochondriaal intermembrane ruimte, en is betrokken bij zuurstofverbruik, dragende elektronen van complex III complex IV. Zodra de mitochondriale buitenste membraan beschadigd wordt cytochroom c vrijgegeven en mitochondriale zuurstofverbruik wordt verlaagd. Na toevoeging van exogene cytochroom c, geen verhoging in mitochondriale respiratie is indicatief voor eenverstoorde mitochondriale buitenmembraan.

In gepermeabiliseerde cellen, substraten en remmers van mitochondriale complexe activiteit worden toegevoegd na diverse protocollen ^{3, 9.} Bijvoorbeeld om mitochondriale complex aangedreven ademhalingssnelheid onderzoeken, kan het volgende protocol worden gebruikt. Na permeabilisatie van de cellen, wordt eerst complex I gestimuleerd door de substraten malaat en glutamaat, die NADH genereren als substraat om de ademhalingsketen en de activering van complexe I. Daarna ADP toegevoegd voor omzetting in ATP (state 3, actieve provoceren complex I-afhankelijke ademhaling). Nadat een stabiel signaal bereikt wordt rotenon (mitochondriale complex I-remmer) toegediend complexe I. Rotenone volgt succinaat tot FADH ₂ remmen en complexe II (state 3, actieve complex II-afhankelijke ademhaling) activeren. Om complexe IV-afhankelijke ademhaling, eerste complex III metenafhankelijke ademhaling wordt geremd door toevoeging antimycin A (mitochondriale complex III inhibitor). Daarna wordt complex IV-afhankelijke ademhaling gestimuleerd door toediening van ascorbaat en tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kunnen auto-oxideren in de ademhaling buffer derhalve de maximale complex IV-afhankelijke ademhalingssnelheid (State 3) wordt berekend door ademhaling voor en na de toevoeging van natriumazide, een remmer van mitochondriale complex IV. De ademhaling experimenten uitgevoerd in twee kamers van een oxygraph parallel-één dient als een controle (niet-gestimuleerde cellen), de andere met de gestimuleerde cellen worden uitgevoerd. Uiteraard kunnen de cellen worden voorbehandeld verschillende wijzen, bijvoorbeeld met geneesmiddelen beïnvloeden mitochondriale functies voor hun zuurstofverbruik wordt gemeten in de kamer oxygraph. Dit protocol maakt functionele onderzoek van de individuele mitochondriale ademhalingsketen complexen. Bovendien kan men meten maximale ADP-gestimuleerdeademhaling (toestand 3) van gepermeabiliseerde cellen, middels exogeen vetzuur in de vorm van palmitaat. In dit protocol wordt geconcentreerd voorraden natriumpalmitaat geconjugeerd met ultra vetzuurvrij runderserumalbumine (BSA) (6: 1 molverhouding palmitaat: BSA). Daarna cellen eerst worden gepermeabiliseerd met digitonine en mitochondriale ademhaling wordt bepaald door het toevoegen van carnitine en palmitinezure gevolgd door toevoeging van ADP (state 3, maximale ademhaling). Vervolgens wordt oligomycin toegevoegd aan toestand 4 (state 4o) en respiratoire controle ratio (RCR-waarde) na te bootsen wordt berekend als toestand 3 / staat 4o. β-oxidatie bevordert de productie van acetyl CoA (die gaat in de TCA cyclus) en het genereren van FADH ₂ en NADH, waarvan de elektronen aan de elektronentransport keten voorbij elektronen overdracht flavoproteïne en β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase. Mitochondriën zijn in het centrum van vetzuurmetabolisme en beschreven palmitaat-BSA protocol kan worden gebruikt door onderzoekers onderzoeken fatty zuur oxidatie. In intacte cellen, activatoren en remmers van mitochondriale complexe activiteit worden toegevoegd naar aanleiding van een ander protocol ^{6, 9.} Voor deze experimenten wordt eerst zuurstofverbruik van niet-gepermeabiliseerde cellen in de afwezigheid van exogene substraten gemeten (fosforyleert ademhaling). Vervolgens wordt de niet-fosforylerende ademhalingssnelheid gemeten na toevoeging van oligomycin, dat een remmer van mitochondriale ATP synthase. Daarna wordt de protonophore carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) toegediend in verschillende concentraties en de maximale mitochondriale ontkoppelde ademhalingsfrequentie wordt gemeten. Protonophores zoals FCCP kan een verhoging in proton permeabiliteit van het binnenste membraan te induceren, waardoor passieve beweging van protonen aan de chemiosmotic verloop verdwijnen. Een toename van permeabiliteit proton ontkoppeld oxidatieve respiratie (geen ATP productie) en veroorzaakt een toename oxygen consumptie. Daarna rotenon en antimycin A toegevoegd aan mitochondriale ademhaling remmen en non-mitochondriale ademhaling wordt afgetrokken van alle andere ademhalingssnelheid.

Het zuurstofverbruik kan worden uitgedrukt als IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 cellen] (zuurstofstroom per miljoen cellen) die wordt berekend door het volume-specifieke zuurstofstroom (in de gesloten zuurstofkamer), JV, o ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1] van cel-concentratie in de cel kamer (aantal cellen per volume [10 ⁶ cellen ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-mass specifieke zuurstof flux, JO ₂ [pmol x sec ^-1 x mg ^-1], is stroom per cel, IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 cellen], gedeeld door de massa per cel [mg ∙ 10 ⁶ cellen]; of het volume-specifieke flux, JV, O ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1], gedeeld door de massa per volume [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ is de zuurstof flux per cel eiwit, drooggewicht of cell volume.

In de huidige studie met behulp van hoge-resolutie respirometrie beschrijven we protocollen bij i te bepalen) optimum digitonine concentratie voor complete cellulaire plasmamembraan permeabilisatie (digitonine titratie assay), ii) mitochondriale buitenste membraan integriteit met behulp van exogene cytochroom c, iii) mitochondriale ademhalingsketen complexen I , II en IV maximale ademfrequentie in digitonine gepermeabiliseerde HepG2-cellen in de aanwezigheid van exogeen ADP en mitochondriale ademhalingsketen substraten, en iv) basale, gekoppeld en maximaal ontkoppeld ademhaling (maximale elektronentransport capaciteit) van intacte cellen zonder toevoeging van exogene substraten en ADP, reproduceren de ademhalingsfunctie in de geïntegreerde cel.

Protocol

1. Cultuur van de Cel

1. Cultuur humane lever HepG2 cellen ⁶ in 25 ^cm2 celkweekkolven in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een incubator (5% CO _2, 95% lucht) (zaaien dichtheid: 1 x 10 ⁶ cellen per 25 cm ² celkweek kolf, incubatietijd in de 37 ° C incubator: 48 uur, mobiele dichtheid bij confluentie: 4-5 x 10 ⁶ cellen per 25 cm ² celkweek kolf).
2. Voer de experimenten wanneer cellen 90% tot 95% confluent.

2. Hoge-resolutie respirometrietest kalibratie van Polarografische Zuurstof Sensors

1. Pipetteer 2,1 ml van de ademhaling buffer in een oxygraph kamer en roer de buffer continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur totdat een stabiele zuurstofflux signaalpolarografische de zuurstofsensor wordt verkregen.
   LET OP: Polarografische zuurstof elektroden binnen elke oxygraph kamer maatregel zuurstofconcentratie en bereken zuurstofverbruik (flux) in elke kamer. De zuurstofconcentratie en zuurstofverbruik (flux) worden real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse.
2. Voer een lucht kalibratie van het polarografische zuurstofsensor volgens de protocollen van de fabrikant ^14.
   LET OP: De kalibratie van polarografische zuurstofsensoren in ademhaling media en zuurstofconcentratie in de media in de lucht verzadiging experimentele temperatuur wordt slechts eenmaal per dag in de ochtend uitgevoerd. Daarna kunnen de media uit de kamers en de cellen opnieuw gesuspendeerd in een frisse ademhaling media worden verwijderd worden toegevoegd aan een oxygraph kamer en luchtwegen tarieven worden gemeten. Na het eerste experiment kan de kamer worden gewassen en reeksen experimenten kunnen worden uitgevoerd in thij dezelfde kamer zonder verdere kalibraties.

3. trypsine van hechtende cellen, Counting Cells

1. Op de dag van het experiment, zuig het DMEM van 25 cm ² celkweek kolf.
2. Spoel de monolaag celcultuur in de kolf met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Pipetteer 0,5 ml van 25 mg / ml trypsine-oplossing (voorverwarmd tot 37 ° C in een 37 ° C waterbad) in de cel monolaag in de kolf en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een incubator _(5% CO2 , 95% lucht).
4. Pipetteer 5 ml DMEM dat 10% FBS in de losgemaakte cellen in de celkweek kolf en suspendeer de cellen door pipetteren.
5. Overdracht geresuspendeerde cellen om een ​​15 ml centrifugebuis en centrifugeer 5 min bij 350 xg bij kamertemperatuur en decanteer het supernatant.
6. Resuspendeer de celpellet in 1 ml ademhaling buffer ¹³ (T abel 1).
i> Tel de cellen met een celteller en resuspendeer ze in de ademhaling buffer tot een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen / ml. Sinds cellulaire ademhaling tarieven worden genormaliseerd naar het aantal cellen, de telling van de cellen met een accurate en nauwkeurige cel teller.

4. Hoge-resolutie respirometrietest

1. Na kalibratie lucht (eenmaal daags uitgevoerd, de stappen 2.1-2.2), zuigen de ademhaling medium van een kamer van het oxygraph en voeg 2,1 ml van de celsuspensie (1 x 10 ⁶ cellen / ml) van stap 3,7 naar de kamer.
2. Sluit de oxygraph kamer door het inbrengen van de stop.
3. Roer de cellen continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
   LET OP: De zuurstofconcentratie en zuurstof flux signaal worden weergegeven in real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyses = "xref"> 14.
4. Daarna injecteren substraten en remmers voor mitochondriële ademhaling via titanium injectieopeningen van de stoppen met behulp van de volgende protocollen.

5. Digitonine Titratie in intacte cellen door respirometrietest

1. Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 ⁶ / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
2. Injecteer 2 ui 0,2 mM rotenon (0,2 uM) "PAS" in de kamer die oxygraph celsuspensie door titanium injectiepoort van de kamer stop met een injectiespuit en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt .
   Opmerking: Alle injecties in de volgende stappen worden uitgevoerd door het titanium injectieopeningen van stoppers via spuiten. Toevoeging van rotenon facultatief (het voorkomt reverse elektronenstroom) en kan worden weggelaten digitonine titratie experimenten, ziestap 6.3.
3. Injecteer 20 pi 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
4. Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
5. Injecteer 2 pl 2 mM digitonine (2 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 minuten totdat een stabiele zuurstof-signaal wordt verkregen.
6. Met injecteren 2 pl 2 mM digitonine in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 minuten totdat een stabiele zuurstof-signaal wordt verkregen.
   OPMERKING: Stapsgewijze toevoeging van digitonine aan de cellen tot een toename in cellulaire zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal toeneemt induceren.
7. Doorgaan injecteren van 2-4 pl van 2 mM digitonine stapsgewijs (2-4 uM elke stap) in de kamer. Na elke stap opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 mtotdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
   OPMERKING: Stop met het injecteren van digitonine wanneer de zuurstof flux signaal een maximaal niveau bereikt en de verdere injecties met digitonine niet verhoging van de ademhaling. De lezer moet digitonine optimale concentratie kan worden bepaald in de laboratoria die eigen reagentia en het gebruik verkregen digitonine optimale concentratie in de stappen 6.2 en 7.2 van de volgende protocollen voor hun experimenten.

6. Evaluatie van de mitochondriale Outer Membrane Integriteit: cytochroom c

1. Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 ⁶ / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
2. Injecteer 2 pl 8 mM digitonine (8 uM) in de oxygraph cupje met de celsuspensie (1 x 10 ⁶ / ml) en permeabilize de cellen gedurende 5 min.
3. Injecteer 20 pi 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire respiration gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
4. Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
   OPMERKING: Toevoeging van ADP aan de cellen complex I stimuleren en veroorzaken een toename van het zuurstofverbruik en zuurstofstroom signaal zal toenemen en te stabiliseren.
5. Injecteer 5 ul van 4 mM cytochroom c (10 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
6. Tenslotte Injecteer 1 ul van 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) en cellulaire ademhaling opnemen totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.

7. Maximale ADP-gestimuleerde Ademhaling (State 3) van permeabel HepG2 cellen

1. Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 ⁶ / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
2. Injecteer 2 pl 8 mM digitonine (8 uM) in de oxygraph cupje met de celsuspensie en permeabilize de cellen gedurende 5 min.
3. Injecteer 12,5 gl 0,8 M van malaat (5 mM) en 10 ui 2 M glutamaat (10 mM) in de oxygraph kamer. Neem cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
4. Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert.
   OPMERKING: Toevoeging van ADP aan de cellen tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal toeneemt induceren.
5. Injecteer 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal af en stabiliseert.
6. Daarna injecteer 20 gl 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemten stabiliseert.
7. Vervolgens injecteren 2 pl van 5 mM antimycin A (5 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal af en stabiliseert.
8. Injecteer dan 2,5 ui 0,8 mM ascorbaat (1 mM) en direct na injecteer 2,5 ul 0,2 mM TMPD (0,25 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert.
9. Tenslotte Injecteer 10 pi van 1 M natrium azide (5 mM) PAS "in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal af en stabiliseert.

8. Oxygen Consumptie van intacte cellen

1. Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 ⁶ / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
2. Injecteer 1 gl 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) in de oxygraph kamer die een celsuspensied opnemen cellulaire ademhaling tot een stabiele zuurstof flux signaal wordt bereikt.
3. Daarna injecteren 1 pi van 0,2 mM van FCCP (0,1 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal toeneemt en stabiliseert.
4. Injecteer 3 ul van 0,2 mM van FCCP (0,4 uM) in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal verder toeneemt en stabiliseert.
5. Titreer FCCP in 0,1 tot 0,3 uM stappen inspuiten 1-3 pl 0,2-1 mM FCCP (0,1 tot 2 uM eindconcentratie in de kamer) in de kamer totdat het oxygraph zuurstofstroom signaal zijn maximale niveaus niet verder toeneemt en bereikt vervolgens begint af.
   OPMERKING: Stop met het injecteren van FCCP wanneer de zuurstof signaal een maximale niveau bereikt en begint te dalen.
6. Vervolgens injecteert 2 ui 0,2 mM rotenon (0,2 pM) en 2 gl 5 mM antimycin A (5 uM) in de kamer. Record ademhaling tot tHij zuurstofstroom signaal af en stabiliseert.

Results

Bepaling van Optimum Digitonine Concentratie voor Cellular Permeabilisatie: Digitonine titratie Experiment

Digitonine titratie uitgevoerd om de optimale concentratie voor permeabilisatie van HepG2-cellen te bepalen. Voor deze experimenten wordt digitonine getitreerd in intacte cellen in aanwezigheid van rotenon, succinaat (mitochondriale complex II substraat) en een verzadigende hoeveelheid ADP (induceren complex II-afhankelijke ...

Discussion

Het doel van de onderhavige protocol was een hoge resolutie respirometrie om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te meten.

Er zijn een aantal kritische stappen in het huidige protocol. Eerst worden cellen zuurstofverbruik meestal genormaliseerd naar het aantal cellen (pmol / [sec x aantal cellen]). Daarom voordat bewaken cellulaire zuurstofconsumpti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemisch
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemisch, opgelost in ethanol
Ascorbaat	Merck	1.00127	Chemisch
BSA	Sigma	A 6003	Chemisch
FCCP	Sigma	C 2920	Chemisch, opgelost in ethanol
Countess geautomatiseerde celteller	Thermo Fisher Scientific	n/a	Geautomatiseerd celtellingsinstrument
Cytochroom c	Sigma	C 7752	Chemisch
Digitonine	Sigma	D 5628	Chemisch, opgelost in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemisch
FBS	Gibco	26010-074	Mediumcomponent
Glutamaat	Sigma	G 1626	Chemisch
Hepes	Sigma	H 7523	Chemisch
KCl	Merck	1.04936	Chemisch
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemisch
K-lactobionaat	Sigma	L 2398	Chemisch
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemisch
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Hoge resolutie respirometrie instrument
Oligomycine	Sigma	O 4876	Chemisch, opgelost in ethanol
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140122	Chemisch
Natriumaziet	Sigma	S2002	Chemisch
Rotenon	Sigma	R 8875	Chemisch, opgelost in ethanol
Succinaat	Sigma	S 2378	Chemisch
Taurine	Sigma	T 8691	Chemisch
TMPD	Sigma	T 3134	Chemisch
Trypsine	Sigma	T 4674	Chemisch