De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Samenvatting

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

Samenvatting

Ons laboratorium onderzoek naar menselijke myeloproliferatieve ziekten veroorzaakt door dergelijke oncogenen als Bcr-Abl of groeifactor receptor-afgeleide oncogenen (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.). We zijn in staat om het model en een mens-achtige ziekte te bestuderen in ons muismodel, door het transplanteren van beenmergcellen die eerder geïnfecteerd met een retrovirus uiting van de oncogen van belang. Replicatie-defecte retrovirus dat codeert voor een menselijk oncogen en een marker (GFP, RFP, antibiotica-resistentie-gen, enz.) wordt geproduceerd door een transiënte transfectie protocol met behulp van 293T-cellen, een menselijke nier epitheel cellijn getransformeerd door het adenovirus E1A genproduct. 293 cellen hebben de bijzondere eigenschap dat zeer transfectable door calciumfosfaat (Capo _4), met maximaal 50-80% transfectie-efficiëntie gemakkelijk haalbaar. Hier hebben we co-transfecteren 293 cellen met een retrovirale vector uiting van de oncogen van belang en een plasmide die de gag-pol-env verpakking functies, zoals de single-genoom verpakking kat of PCL, bouwt in dit geval de Ecopak plasmide uitdrukt. De initiële transfectie wordt verder verbeterd door het gebruik van chloroquine. Voorraden ecotropic virus, verzameld als cultuur supernatant 48 uur. post-transfectie, kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C en worden gebruikt voor infectie van cel-lijnen in het licht van transformatie en in vitro studies, of primaire cellen zoals beenmergcellen van de muis, die vervolgens kunnen voor transplantatie worden gebruikt in ons muismodel .

Protocol

1. De avond voor transformatie, plaat 293T cellen in 3-5x10 ⁶ cellen / 6 cm weefsel cultureplate.
   
   Opmerking: Wij gebruiken 293T-cellen voor hun gemak van transfectie en efficacyas virus producerende cellen. Deze cellen zijn deficiënt in de verpakking van het virus, tenzij een helper plasmide wordt geïntroduceerd.
   
   
2. De eerste ochtend, voorzichtig verwijderen medium en te vervangen door 4 ml 293T-cellen med die 25 mM Chloroquine. Zet in de incubator gedurende 1 uur.
   
   Let op: de plaat moet ongeveer 80% confluent.
   
   
3. Ondertussen bereiden virus-maken mengsel voor 2 borden tegelijk, in 5 ml buizen:
   1. 2 x 10 mg retrovirale plasmideconstruct
   2. 2 x 5 mg verpakking construct (Ecopak),
   3. 2 x 62 ml CaCl
   4. compleet tot 1 ml met een steriele DDH ₂ O
      
      Opmerking: Als het retrovirale plasmide codeert voor het oncogen van belang en een marker, Ecopak codeert gag-pol-env. Samen met de 293T cellen, zullen zij een ecotropic retrovirus (RV) die specifiek zijn voor muizen cellen, maar niet besmettelijk voor de menselijke cellen. Zowel Chloroquine en CaCl ₂ is aangetoond dat transfectie-efficiëntie te verhogen.
      
      
4. Voeg 1 ml 2x sterileHBS druppelsgewijs aan het mengsel, terwijl zachtjes vortexen de buis.
5. Onmiddellijk toevoegen deze oplossing tot en met 2 platen, 1 ml per stuk, zachtjes, druppel voor druppel.
6. Zet in incubator voor 7 tot 11 uur.
7. In de avond (7 tot 11 uur. Later), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 5 ml vers 293T medium. Zet in incubator tot het middaguur, de volgende dag.
   
   Let op: deze stap is belangrijk, als je nodig hebt om op te stijgen van de chloroquine van de cellen. Indien gedurende langere tijd, chloroquine is giftig. De oplossing in de platen ziet er vaag, als gevolg van een zeer fijne, stof-achtige neerslaan van de transfectie mengsel.
   
   
   Opmerking: Het is belangrijk om te doen alle media veranderingen met extreme zachtheid, zoals de cellen zijn gesensibiliseerd door de chloroquine, en kan gemakkelijk los van de plaat.
   
   
8. De volgende dag, 18 tot 24 uur. voor het ophalen van het virus (rond de middag), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 3 ml vers 293T medium. Vervang in de incubator O / N.
9. De derde morgen (18 tot 24 uur. Later) voorzichtig zuigen het medium vormen de platen met een 10 ml injectiespuit voorzien van een 18 G naald. Dit supernatant bevat het retrovirus.
10. Vervang de naald een 45 mm spuitfilter, omkeren spuit een paar keer om de oplossing goed te mengen, passeren supernatant door het filter, en aliquot in cryotubes
    
    Opmerking: Als alternatief, als u het maken van 3 + platen van virus, zwembad de hele supernatanten van hetzelfde virus in een 5 0 ml conische buis. Meng goed, dan hoeveelheid supernatanten die het retrovirus in cryotubes door te filteren.
    
    
11. De buizen met het virus vol supematanten worden gehouden in -80 ° C tot gebruik.

Discussie

Vier kritieke punten zullen verzekeren het succes van een goede viral voorraad:

1. De 293T-producerende cellen moeten zijn erg gezond, wat betekent dat ze zijn gesplitst op een zeer regelmatig schema, werden nooit overwoekerd, en zijn vergulde bij de optimale dichtheid van 3.5-5 miljoen per 6 cm weefselkweek bord, zodat ze een dichtheid te bereiken van 80% van de plaat op de ochtend van de transfectie.
   
2. Toevoeging van chloroquine verbetert de transfectie-efficiëntie en de daaropvolgende virustiter, ongeveer 3 ...

Materialen

Alle gebruikte reagentia in de transfectie moeten steriel gefiltreerd (CaCl _2, 2x HBS, miliQ H ₂ O) en bleef steriel.