ADSC-sheet transplantatie ter voorkoming Strictuur na Extended slokdarmkanker Endoscopische Submucosale Dissection

Samenvatting

Deze studie meldt een succesvolle methode van endoscopische vetweefsel afgeleide stromale cellen (ADSC)-plaat transplantatie voor oesofageale vernauwing preventie na een verlengde endoscopische submucosale dissectie (ESD) in een varkens model.

Samenvatting

In de afgelopen jaren, heeft de cel-sheet construct brede interesse in de regeneratieve geneeskunde gestimuleerd, in het bijzonder voor reconstructieve chirurgie procedures. De ontwikkeling van gediversifieerde technologieën combineren vetweefsel afgeleide stromacellen (ADSCs) met verschillende biomaterialen heeft geleid tot de bouw van talrijke soorten weefselengineering substituten, zoals bot, kraakbeen en vetweefsel van knaagdieren, varkens of menselijke ADSCs. Extended slokdarm endoscopische submucosale dissectie (ESD) is verantwoordelijk voor de slokdarm strictuurvorming. Vernauwing preventie blijft uitdagend, zonder efficiënte behandelingen beschikbaar. Vorige studies de effectiviteit van mucosale cel vel transplantatie in een hond model en bij mensen. ADSCs toegeschreven anti-inflammatoire eigenschappen, lokale immuunmodulerende effecten, neovascularisatie inductie en differentiatie vaardigheden in mesenchymale en niet-mesenchymale lineages. Deze originele studie beschrijft de endoscopische transplantation van een ADSC-tissue engineered construct oesofageale vernauwing in een varkens model te voorkomen. De ADSC construct bestond uit twee allogene ADSC bladen lagen op elkaar op een papieren drager membraan. De ADSCs werden gelabeld met de PKH67 fluorofoor to-probe gebaseerde confocale laser endomicroscopy (PCLE) controle mogelijk te maken. Op de dag van transplantatie, een 5-cm en hemi-omtrek ESD bekend oesofageale vernauwing te induceren werd uitgevoerd. Dieren werden onmiddellijk endoscopisch getransplanteerd met 4 ADSC constructen. De volledige hechting van de ADSC constructen werd verkregen na 10 min zachte toepassing. Dieren werden opgeofferd op dag 28. Alle dieren werden met succes getransplanteerd. Transplantatie werd bevestigd op dag 3 met een positieve PCLE evalueren. Vergeleken met getransplanteerde dieren, controle dieren ontwikkelde ernstige vernauwingen, met de belangrijkste fibrotisch weefsel ontwikkeling, vaker voedings- problemen, en verminderde gewichtstoename. In ons model, de transplantatie van allogenic ADSCs, georganiseerd in de dubbele cel vellen, na langere ESD was succesvol en sterk geassocieerd met een lagere oesofageale vernauwing tarief.

Inleiding

De behandeling van oppervlakkige oesofageale tumoren veranderd met de ontwikkeling van nieuwe endoscopische technieken. Tegenwoordig endoscopische resectie is de eerste-lijnsbehandeling. Het is inderdaad geassocieerd met een lagere morbiditeit en mortaliteit dan chirurgie met gelijke oncologische resultaten ^{1, 2, 3.} Endoscopische mucosale resectie (EMR) en endoscopische submucosale resectie (ESD) zijn de meest gebruikte technieken. Bij langere oppervlakkige tumor is ESD voorkeur. Vergeleken met EMR, ESD maakt en bloc resectioning, ongeacht de laesie en maat ^{4, 5, 6.} De belangrijkste complicatie van vertraagde ESD oesofageale vernauwing, die meestal optreedt tussen een en twee weken na resectie. Recent gepubliceerde studies hebben aangetoond dat de vorming strictuur houdt verband met degrootte van de resectie. De Japanse Endoscopische Society beveelt het vermijden van ESD maten groter dan ¾ van de slokdarm omtrek, omdat ze worden geassocieerd met vernauwing ontwikkeling in meer dan 90% van de gevallen en zijn verantwoordelijk voor ernstige voeden problemen en grote verslechtering van de kwaliteit van leven.

Het voorkomen van slokdarmkanker strictuur blijft uitdagend. Mechanismen betrokken bij de vorming van vernauwing slechts gedeeltelijk bekend. Vernauwing formaties lijkt voort te vloeien uit de vereniging van twee verschillende mechanismen: (1) pro-inflammatoire cellulaire werving en (2) excessieve ontwikkeling fibrose ^7. Verscheidene preventieve behandelingen zijn voorgesteld. Echter, de resultaten waren onbevredigend, met weinig voordeel en ernstige bijwerkingen ^{8, 9.} Onlangs heeft een Japans team, Ohki et al. , Voorgesteld om een ​​single-layer cellaag in autologe mondslijmvlies cellen te transplanteren naar de esophageal litteken. Transplantatie werd onmiddellijk na ESD ^{10, 11.} Zij toonden de doeltreffendheid van deze innovatieve aanpak, eerst in een hondenmodel en bij patiënten.

Vetweefsel afgeleide stromale cellen (ADSCs) zijn veelbelovend in de regeneratieve geneeskunde. De toepassing ervan op verschillende gebieden heeft aangetoond interessante resultaten, vooral in het wondgenezingsproces. ADSC therapie biedt verschillende voordelen, omdat de cellen eenvoudig geïsoleerd en worden geassocieerd met anti-inflammatoire eigenschappen, lokale immunomodulerende effecten, neovascularisatie inductie en differentiatie vaardigheden in mesenchymale en niet-mesenchymale lijnen ^{12, 13, 14.}

In een eerdere studie, het team aangetoond dat de effectiviteit van de dubbele ADSC-sheet endoscopische transplantatie voor oesofageale vernauwing prevention na langdurig EDO in een varkens model ^15. In dit artikel worden meldingen van ADSC-sheet bouw en endoscopische transplantatie techniek gepresenteerd.

Protocol

Alle dieren werden behandeld volgens de Animal Research Ethics Committee (richtlijnen van het Franse ministerie van Landbouw). Het protocol kreeg de goedkeuring van de lokale ethische commissie bevoegd voor dierlijke experimenten op de Paris Descartes University (registratienummer MESR 2.035,02, Faculteit der Geneeskunde Paris Descartes, Parijs, Frankrijk).

1. ADSC Cultuur en Labeling

1. Verkrijgen bevestigde ADSCs uit een privé-instelling. Cultuur allogene ADSCs bij 37 ° C en _5% CO2 met alfa-minimaal essentieel medium dat 10% foetaal kalfs- serum en 1% antibiotica (penicilline en streptomycine).
2. Verkrijgen ongeveer 24 x 10 ⁶ ADSCs per dier onder toepassing van standaard procedures celexpansie (37 ° C en _5% CO2). Oogst de ADSCs met een standaard trypsine-oplossing (10 ml voor T150 schotel). Voer cel tellen met een hemocytometer.
3. Voer cel labelen van de dag vóór de transplantatie met behulp van de PKH67 kleuring procedure hieronder beschreven.
   Opmerking: Het doel van de kleuring procedure te cell tracking mogelijk na transplantatie.
   1. Om 2 x 10 ⁶ ADSCs labelen bereiden Oplossing A (2 x 10 ⁶ cellen met 100 pl verdunningsmiddel C) en oplossing B (4 pl PKH67 met 1 ml Diluent C).
   2. Incubeer Oplossingen A en B gedurende 2 min. Voeg vervolgens 100 ul foetaal kalfs- serum gedurende 1 min.
   3. Spoel de oplossing met 300 pl gecitreerd RPMI (298,5 pl RPMI en 1,5 pl citraat) en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze handeling 2 keer. Handhaving van de gelabelde cellen en hen te beschermen tegen licht tot blad bouw.

2. Dubbelklik ADSC-sheet Construct

1. De dag voor transplantatie, stelt een 12-well temperatuur reagerende celkweekschaal met 4 ml per putje van het celkweekmedium, hierboven beschreven, voor PKH-labeling. Het zaad van de schotel met 1,5 x 10 ⁶ PKH-labeled cellen per putje en incubeer gedurende 12 uur (37 ° C en _5% CO2).
2. Op de dag van de transplantatie, maak de confluente cellaag door incuberen van de schotel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
3. Zuig voorzichtig één ADSC blad met een pipet en combineer het op een hydrofoob papier (1,5 cm diameter). Gebruik dit document als een ondersteuning membraan.
4. Pak een andere ADSC vel en voorzichtig deponeren het op de top van de andere om een ​​double-layer constructie te verkrijgen.
5. Herhaal deze procedure zo nodig (4 per dier) zoveel ADSC-sheet constructies te verkrijgen.

3. Oesofageale endoscopische submucosale dissectie (ESD)

1. Op de dag van de transplantatie, pre-medicijnen de dieren 10 mg / kg ketamine intramusculair en induceren ze met 8 mg / kg intraveneus propofol. Voer vervolgens intubatie en de anesthesie met isofluraan 2,5% inademing te handhaven.
2. Zodra het dier onder narcose Voer ESD met gastroscope een videoscope en een elektrochirurgische eenheid.
   1. Gebruik een endoscopische mes en zachte coagulatie hemi-omtrek dorsale merken variëren van 40 cm tot 45 cm van de tandboog verkrijgen.
   2. Injecteer glycerol oplossing die indigokarmijn kleurstof in de submucosa van de scheiding van de slijmvlieslaag van de spierlaag.
   3. Gebruik een endoscopische mes met endocut I-modus om de omtrek incisies te verkrijgen.
   4. Gebruik een endoscopische mes gedwongen coagulatiemodus de submucosale dissectie uitvoeren, zich van het proximale naar het distale insnijding incisie.
3. Aan het einde van de ESD procedure, observeert de hemi-omtrek, 5 cm lang oesofageale litteken blootstellen van de spierlaag.

4. Endoscopische Transplantatie

1. Onmiddellijk na de ESD, endoscopisch transplantatie dieren met 4 dubbele ADSC-sheet constructies.
   1. Pak een ADSC vel construct met endoscopische tang enbeschermen tijdens het vervoer naar de wond met behulp van een grote, transparante endoscopische cap.
   2. Breng het gehele oppervlak van het vel ADSC construct aan de zweer bed.
   3. Voorzichtig toepassen ADSC vel construct voor 10 minuten om een ​​complete en stabiele engraftment verkrijgen. Voor toepassing, gebruik endoscopische tang of een endoscopische dop en breng het hele oppervlak van de ADSC bouwen op de slokdarm submucosale laag.
2. Herhaal deze procedure vier keer voor elk dier met het oog op vier getransplanteerde en hechtende dubbele cel-sheet constructies te verkrijgen.
   NB: Het doel is om bij benadering de helft van de gewonde gebied te dekken.

5. Postoperatieve evaluatie en follow-up

1. Voor elk dier, zorgen na ESD analgesie met intramusculaire injectie van 0,2 mg / kg morfine drie keer per dag gedurende de eerste dag en 28 dagen tegen zuurbehandeling van esomeprazol (40 mg / dag). Voer profylactisch antibiotica met amoxicillin (1 g / dag) gedurende 7 dagen. Machtigen vloeistoffen op dag 1 en vaste stoffen op de volgende dag.
2. Follow-up met dieren voor 28 dagen. Het verkrijgen van de dagelijkse klinische evaluaties met behulp van Mellow Pinkas dysphagia scores ¹⁶ en gewichtsverschil tussen metingen.
3. Multimodaal stricture evaluatie: onder algemene verdoving, op geregelde dagen 3, 14 en 28, het uitvoeren van een multimodale evaluatie van de vernauwing optreden.
   1. Voer een endoscopische evaluatie met behulp van litteken beschrijving, vernauwing meting, en papier ondersteuning membraan detectie. Meet de vernauwing met de gastroscope te steken door de vernauwing (de diameter van de gastroscope is 8 mm). Let op het litteken, met aandacht voor de inflammatoire aspect (mucosale erythema, mucosale oedeem, en mucosale spontane bloeden) en de aan- of afwezigheid van de papiersteun membraan binnen het litteken.
   2. Solliciteer PCLE groene sonde door het gastroscope operator kanaal direct in het litteken bed. Zoeken naar een spontaneen georganiseerde groene signaal compatibel met PKH67-gelabelde ADSC-sheet construct aanslaan.
   3. Voer 2 orthogonale incidenties van bariet esophagography met een radiologische hoepel (voorzijde en links-zijdig incidentie). Houd het kleinste incidentie van strictuur evaluatie (mate van vernauwing (%) = [1- (lengte van de korte as onder stenose / lengte van de normaalas onder stenose) x 100)]) ^{17, 18.}
4. Dierenoffers.
   1. Op dag 28, aan het einde van de follow-up periode, voert het dier offeren. Terwijl het dier nog onder narcose injecteren 100 mg / kg intraveneus fenobarbital. Zorg ervoor dat dieren dood met behulp van klinisch onderzoek voor de afwezigheid van een hartslag en de ademhaling beweging.
   2. Na een sternotomie en orgel blootstelling, verwijder de slokdarm uit elk opgeofferd dier (met 10% gebufferde formaline fixatie, inbedden in paraffine, en 4 urn dikke secties). Vlekken op de dia'smet Hematoxylin en saffraan ^15. Digitaliseren van de dia's voor geautomatiseerde analyse en vergelijk de diergroepen ^15.

Resultaten

De cultuur van ADSCs en de procedure voor de ADSC vel te verkrijgen wordt getoond in figuur 1. Figuur 2 toont de constructie van het implantaat, bestaande uit twee bladen ADSC lagen op elkaar uit papier dragermembraan. ADSCs waren eerder gemerkt met de PKH67 fluorofoor om in vivo graft toezicht met PCLE. Figuur 3 toont de verschillende stappen van uitgebreide slokdarm endoscopische submucosale dissectie, wat resulteert in een 5 ...

Discussie

In dit varken model, de ADSC vel transplantatie was technisch succesvol, en de in vivo PCLE evaluatie toegestaan cel innesteling monitoring. Klinische, endoscopische, radiologische en histologische evaluatie getoond van de werkzaamheid van de endoscopische ADSC vel oesofageale vernauwing voorkomen na langdurig ESD.

De endoscopische transplantatie van een ADSC glycerol oplossing die een indigokarmijn kleurstof sheet is een innovatieve aanpak in de regeneratieve geneeskunde. Ohki ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Transparent endoscopic cap Q180 compatible	Olympus Optical Co
GIF-Q180 gastroscope	Olympus Optical Co
Videoscope System Exera II	Olympus Optical Co
Injection needle 18 G	Olympus Optical Co
Electrosurgery unit ERBE ICC 350	ERBE Technology
Indigo carmin 1%	Life
Endoscopic hybrid knife	Life
Minisonde Z pCLE green probe	Mauna Kea Technology		Je moet leren hoe je de sonde moet gebruiken. De manipulatie kan moeilijk zijn.
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	12105C
Trypsin	Sigma Aldrich	T146
Alpha minimum essential medium	Thermo Fisher	22561-021
Phosphate-Buffered Salines	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 dye kit	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12-well temperature responsive cell culture dish	Upcell Thermo Scientific	174900	Voel de weel met 4 mL standaard mediumcultuur 30 min voor het zaaien van cellen
Esomeprazole 40 mg	Biogaran
Moprhine sulfate 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicilline 1 g	Biogaran
Ketamine 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Hydrophobic paper	Carrefour