Methodenartikel

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

9.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55020

⸱

25 januari 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Intercellular Interactions, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

In dit artikel

Samenvatting

Virussen of extracellulaire blaasjes werden immunogevangen met 15 nm magnetische nanodeeltjes gekoppeld aan antilichamen die oppervlakte-antigenen herkennen. De gevangen virionen of blaasjes werden gelabeld met fluorescente antilichamen tegen andere oppervlakte-antigenen. De resulterende complexen werden gescheiden in een hoog magnetisch veld en geanalyseerd met conventionele flowcytometers die werden geactiveerd door fluorescentie.

Samenvatting

Cellen geven kleine extracellulaire blaasjes (EV's) vrij in de omgeving. Bij een virusinfectie geven cellen ook virionen vrij die dezelfde grootte hebben als sommige EV's. Zowel virionen als EV's dragen eiwitten van de cellen die ze hebben gegenereerd en zijn antigenetisch heterogeen. Ondanks hun diversiteit werden zowel virussen als EV's voornamelijk gekarakteriseerd door bulkanalyse. Hier beschrijven we een originele nanotechnologie-gebaseerde hoog-doorvoermethode die de karakterisering van antigenen op individuele kleine deeltjes mogelijk maakt met behulp van reguliere flowcytometers. Virussen of extracellulaire blaasjes werden geïmmunogevangen met 15 nm magnetische nanodeeltjes (MNP's) gekoppeld aan antilichamen die een van de oppervlakte-antigenen herkennen. De gevangen virionen of blaasjes werden geïncubeerd met fluorescerende antilichamen tegen andere oppervlakte-antigenen. De resulterende complexen werden gescheiden op magnetische kolommen van ongebonden antilichamen en geanalyseerd met conventionele flowcytometers die op fluorescentie werden geactiveerd. Deze methode heeft brede toepassingen en kan worden gebruikt om de antigene samenstelling van elke virale- en niet-virale kleine deeltjes te karakteriseren die door cellen worden gegenereerd in vivo en in vitro. Hier geven we voorbeelden van het gebruik van deze methode om de verdeling van gastheercelmarkers op individuele HIV-1-deeltjes te evalueren, om de rijping van individuele Dengue-virionen (DENV) te bestuderen en om extracellulaire blaasjes te onderzoeken die in de bloedbaan worden vrijgegeven.

Inleiding

Cellen in meercellige organismen vele verschillende elementen die ofwel uniek zijn voor een bepaalde cel of althans tot unieke groepen cellen. Zelfs gekweekte gekloonde cellen vertonen individuele kenmerken, zoals blijkt uit hun diverse morfologie. Ook is een cel individualiteit terug in de producten hij scheidt. In het geval van virale infecties, kunnen virusdeeltjes eiwitten uit de cellen waarin ze ontstonden dragen. Bijvoorbeeld, HIV vele gastheerceleiwitten zijn ingebed in de virale envelop en virussen die zijn gegenereerd door verschillende cellen kunnen deze karakteristieke eiwitten dragen 1, 2 of "cel handtekeningen".

Zelfs zonder infectie, cellen vrijkomen in de omringende media kleine extracellulaire blaasjes (EV's). Biogenese van deze vesicles en de structuur vaak lijken op die van virussen, met name retrovirussen. In de afgelopen jaren is duidelijk gewordendat EV, die aanvankelijk werden beschouwd "bloedplaatjes dust" 3, zijn een belangrijk fysiologisch systeem van cel-cel communicatie. Samen met twee andere systemen van intercellulaire communicatie, namelijk de cel-cel contact interacties en vrijgelaten oplosbare moleculen, EV's coördineren normale fysiologie en worden veranderd in verschillende pathologieën 4, 5 met inbegrip van virale infecties 6, 7.

Hoewel beide vrijgegeven virusdeeltjes en extracellulaire vesicles zijn zeer divers, worden ze voornamelijk gekenmerkt door bulkanalyse waarin de individuele kenmerken verloren gaan. Werkwijze verwant aan flowcytometrie, die cellen op basis van hun verschillende oppervlakteantigenen fenotypen, nodig om individuele virale en virusachtige partikels te karakteriseren. Helaas, EV's of kleine virions niet kan worden geanalyseerd met behulp van standaard stroming cytometrie methoden omdat zij te klein om de lichtverstrooiende signaal waarop de meeste cytometers rekenen voor triggering genereren. Om deze beperking te omzeilen, kan fluorescentie triggering worden toegepast. Indien EV of virions worden gekleurd met fluorescente antilichamen moeilijk te onderscheiden van vrije antilichamen en aggregaten vanwege hun vergelijkbare fluorescentie en vergelijkbare afmetingen.

Onlangs hebben we een op nanotechnologie gebaseerde high throughput methode die de karakterisering van antigenen op de individuele kleine deeltjes met behulp van reguliere flowcytometers 8, 9 toelaat. We gebruiken MNP's op immunocapture deeltjes plaats, zoals is beschreven door andere groepen voor uiteenlopende toepassingen 10, 11, 12, 13; maar onze nieuwe techniek maakt het vangen van afzonderlijke speciFIC targets gevolgd door fenotypering van deze gevangen deeltjes door middel van flowcytometrie met behulp van fluorescentie triggeren plaats van lichtverstrooiing, zonder inmenging van vrij zwevende antilichamen. Deze methode heeft brede toepassingen en kan worden gebruikt om de antigene samenstelling volgens viral- en niet-virale kleine deeltjes gegenereerd door cellen in vivo te karakteriseren en in vitro verschaft de beschikbaarheid van specifieke fluorescente antilichamen tegen oppervlakteantigenen. We hebben al deze techniek een aantal biologische problemen te bestuderen toegepast.

Met name evalueerden wij de verdeling van de gastheercel merkers op afzonderlijke HIV-1 deeltjes 9, hebben we de rijping van individuele Dengue virus (DENV) gebaseerd op een analyse van hun oppervlakte-eiwitten 14 en onderzocht EV vrijkomen in de bloedstroom van gezonde vrijwilligers en patiënten met een acuut coronair syndroom (ACS). Hoewel gebaseerd op een soortgelijk principe, detoepassing van de nieuwe techniek vereiste ontwikkeling van specifieke protocollen die hieronder worden beschreven.

Protocol

1. Koppeling van magnetische nanodeeltjes (MNP)

  1. Gebruik commerciële koppelingsprocedure en reagentia te koppelen MNP's met antilichamen (Abs) (gewoonlijk 1 mg). Ijzeroxide nanodeeltjes met carbonzuur als reactieve groepen worden gebruikt.
    1. Wanneer antilichamen in een volume groter dan 0,5 ml, concentraat met een 100K concentrator. Spin bij 2000 xg gedurende 3-5 min.
  2. Aan het einde van de procedure, na toevoeging van 10 pi van de buffer quenching, MNP's dragen een 12 mm x 75 mm buis en voeg 3 ml was / opslagbuffer. Plaats de buis in het gat van een magnetische scheider en laat overnacht bij 4 ° C.
  3. Controleer of MNP hebben alle verzamelde aan de zijkant van de buis, en vervolgens zorgvuldig pipet alle vloeistof. Voeg 3 ml vers was / opslagbuffer en plaats terug in de magneet.
  4. Na een aantal uur, controleer dan of MNP worden verzameld aan de zijkant van de buis en vervolgens pipet uit de vloeistof. Gebruik 2 ml was / opslagbuffer aanresuspendeer de MNP's en bewaar bij 4 ° C.
  5. Controleer of Abs aan MNP worden gekoppeld door ze te labelen met een relevante fluorescerende Fab antilichaamfragment (bv geit anti-muis als het gebruiken van een muis monoklonaal Ab voor het vastleggen zoals beschreven in hoofdstuk 2) en draaien op een flowcytometer.

2. Labeling Antilichamen Gekoppeld aan MNP

  1. Combineer 60 gl (3,9 x 10 12 deeltjes) van MNP's (per conditie) en 5 pl (van een 200 ug / ml handelsoplossing) gelabeld Fab-fragmenten, specifiek voor het isotype van de vangst Ab in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende 30 minuten onder continu mengen.
  3. Pre-nat een 100K concentrator met 300 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en draaien in een microcentrifuge bij 1500 xg gedurende 5 minuten.
  4. Zuiver gelabelde complexen op 100K kolom. Spin het mengsel uit stap 2.2 in een microcentrifuge bij 1500 g gedurende 5 minuten, wassen met 200 pl PBS, en terug in deaanvankelijke volume.

3. Gebruik van gemerkte Ab-MNP Complexen Capture Deeltjes of Interest (virussen of EV)

  1. Incubeer gelabelde MNP's 60 gl (3,9 x 10 12 deeltjes) met HIV (60 pl) of EV preparaat (100 ui).
    1. Bereid EV voorbereidingen op verschillende manieren. Hier, te zuiveren EVs op sucrose gradiënten, verzamelen van bloedplaatjes arm plasma met behulp van exosome neerslag reagentia of direct te isoleren uit plasma 8.
      OPMERKING: Optimale verhoudingen moeten worden bepaald voor elk experiment en afhankelijk virusconcentratie / EV in het preparaat. MNP-Ab fractie moet 10 ~ 6 boven opzichte virusconcentratie / EV fractie.
  2. Incubeer 40 min bij 37 ° C onder zachtjes mengen virussen of 1 uur bij 4 ° C voor EV.
  3. Voeg 2,5% muis IgG / humaan IgG te blokkeren Fc binden, zachtjes vortex, incubeer 3-5 min bij RT.
  4. Voeg fabrikant aanbevolen of getitreerde concentraties van elk detectie Abs en incubeer additionele 20 minuten bij kamertemperatuur.

4. Scheiding van het MNP-gevangen Virions (of EV's) uit geconsolideerd antilichamen met behulp van magnetische Columns

  1. Bereid magnetische scheidingskolom voor gebruik door het in een scheidingsmagneet.
  2. Pre-nat de kolom met 500 ui wasbuffer (2 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5% runderserumalbumine (BSA) in PBS). Laat de wasbuffer door de kolom stromen.
  3. Voeg de MNP-virus / MNP-EV-complexen aan de kolom en laat alle vloeistof doorheen kan stromen. Voeg 500 ul wasbuffer aan de kolom, waardoor het gehele volume passeren.
  4. Herhaal wassen met wasbuffer 2 keer.
  5. Verwijder de kolom uit magneet en plaats in 12 mm x 75 mm buis voor het verzamelen van de ingehouden MNP-virus / MNP-EV complexen. Laat de kolom staan ​​in de buis van de magneet voor 3 min. Voeg 200 pl PBS en laatde kralen naar beneden stromen door de zwaartekracht, voeg nog eens 200 pl PBS, en bevestig met 200 pi 4% paraformaldehyde na elutie.
    LET OP: Paraformaldehyde is een verdacht carcinogeen en moet in een geventileerde kap worden behandeld en handschoenen moeten worden gedragen.
  6. Om enkele virions kwantificeren / EV's gebruiken volumetrische instellingen op High Throughput Sampler (HTS) of juist vóór de verwerving toe te voegen goed gemengde flowcytometrie tellen kralen.

5. Analyse van de MNP-gevangen Virussen / EV's met een flowcytometer

  1. Warmen flowcytometer gedurende 30 min.
  2. Run kwaliteitscontrole kralen.
  3. Stel drempel op de fluorescentie van beide MNP of geëtiketteerd virussen / EV's. Gebruik 0,22 urn gefiltreerd PBS drempel om de achtergrond "ruis" te verminderen. Stel de drempel door aanpassing van de PMT spanning op het niveau waar gefilterde PBS geen geeft, of zeer weinig, evenementen.
  4. Run samples op laag. (Gebruik een extra 0,04 um inline-filter voor omhullingfluïdum in serie geplaatste achter destandaard 0,2 pm schede filter om verder uit te bannen valse evenementen).

6. Evaluatie van de Capture Efficiency

  1. Leg fluorescent gelabelde EVs of HIV met MNP-Abs, zoals beschreven in 3.1, 3.2. (EV's kunnen worden gelabeld ofwel met een membraan kleurstof of door middel van hun lading 15; HIV codeerbaar hetzij door gen-gecodeerde 16 kleurstof of kleurstof met een membraan 12, 17).
  2. Bereid magnetische scheidingskolom zoals beschreven in (4,1-4,2).
  3. Voeg de MNP-virus / MNP-EV-complexen aan de kolom en laat alle vloeistof stromen door (doorstromen fractie). Verzamel de stroom door fractie buis.
  4. Doorgaan met fractie op de kolom vastgehouden, zoals beschreven in (4,4-4,5).
  5. Herhaal de procedure vast te leggen op de doorstroming fractie van 6,3 met nascheiding (4,1-4,5).
  6. Analyseer de ingehouden fracties uit eerste capture en tweede vastleggen door ze op cytometer die is ingesteld op triggering op fluorescent label van EV's of HIV. Om de efficiëntie te evalueren, vergelijken het aantal gebeurtenissen in beide fracties.

7. Aanpassing van het protocol voor specifieke taken

Opmerking: Als het protocol kan worden toegepast op de analyse van HIV en EV zoals hierboven beschreven, voor de analyse van DENV de volgende wijzigingen worden aangebracht:

  1. Virions incuberen met 1 uM Dil in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie zuiver lood virus door centrifugatie in dichtheidsgradiënt medium (10%, 20%, 25% en 35%) bij 240.000 xg gedurende 1,5 uur bij 4 ° C zonder rem. Verzamel fractie tussen 20% en 25% dichtheidsgradiënt medium 14 lagen.
  2. Incubeer Dil gelabelde DENV 1 x 10 7 (60 ui) met fabrikant aanbevolen of getitreerde concentraties detectie Ab in aanwezigheid van 2,5% muis IgG gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Incubat mengsel met gelabelde 60 gl (3,9 x 10 12 deeltjes) MNP-capture Ab complexen gedurende 40 min bij 37 ° C onder zachtjes mengen.
  4. Gescheiden resulterende complexen van ongebonden Abs op magnetische kolommen zoals hierboven beschreven en geanalyseerd op de stromingscytometer.

Resultaten

Selectieve vangen van cellulaire antigenen door HIV-1 virions

Met "flow virometry" is het nu mogelijk om cellulaire antigenen op afzonderlijke virusdeeltjes visualiseren. Als voorbeeld hebben we ons gericht op twee mobiele antigenen van HIV-1, LFA-1 en HLA-DR uitgevoerd. Eerder deze twee antigenen werden in HIV-1 preparaten in bulk 1 geanalyseerd. We bereidden MNP's in combinatie met één van de antilichamen tegen HIV Env-eiwit, VRC01 en vastgelegd met deze MNP HIV-1 virions (HIV-1 LAI.04 of HIV-1 SF162 geproduceerd in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's)). Daarnaast hebben we deze gekleurd virions met 2G12, een ander anti-Env-antilichaam. Flow virometry toonde een hoge heterogeniteit van HIV-1 virions over de aanwezigheid van LFA-1 en HLA-DR. Gemiddeld 16,7 ± 2,0% (n = 6) en 8,6 ± 0,3% (n = 3) van HIV-1 virions uitgevoerd LAI.04 LFA-1 en HLA-DR,respectievelijk. Slechts 4,8 ± 0,6% (n = 3) van virions waren positief voor beide antigenen. Aan de andere HIV-1-stam, HIV-1 SF162, waren deze antigenen aanwezig op 20,0 ± 4,4% (n = 6) en 10,8 ± 1,3% (n = 6) van virions respectievelijk, terwijl beide antigenen werden door 6,5 ± 0,4% (figuur 1).

De verdeling van de cellulaire eiwitten afhankelijk was van de cellen die het virus gerepliceerd. HIV-geïnfecteerde Jurkat-cellen geproduceerde virions antigeen verschillend van die geproduceerd door geïnfecteerde PBMC's. Virions van HIV-1 LAI 0,4 door Jurkat cellen uitgevoerd 1,6 ± 1,4% (n = 3) respectievelijk 1,6 ± 0,7% (n = 4) LFA-1 en HLA-DR. Voor HIV-1 SF162 virions geproduceerd in Jurkat cellen, deze parameters waren 7,2 ± 2,5% (n = 3) en 5,6 ± 2,7% van de (n = 4). Aldus antigene samenstelling (althans voor HLA-DR en LFA-1) verschilde HIV-1 LAI.04 door twee andere celtype (p <0,02).

Flow virometry zoals toegepast op de evaluatie van Dengue virus

DENV rijping is geassocieerd met de expressie van prM eiwit op de virions. We pasten stroom virometry om te evalueren wat fractie van DENV geproduceerd in BHK-1 en in LoVo cellen volwassen virussen vormt. Virionen werden gekleurd met een lipide kleurstof DII. Analyse van individuele gevangen virions geopenbaard prM op 48,2 ± 5,3% (n = 8) van DENVs. Daarentegen 84,5 ± 3,4% (n = 4) van DENV geproduceerd in LoVo cellen uitgevoerd prM. De rest van de virions respectievelijk 51,8 ± 5,3% (n = 8) en 15,5 ± 3,4% (n = 4) waren negatief prM (figuur 2). Zo kan stroom virometry worden gebruikt om volgroeid individuele DENV van onrijpe (of gedeeltelijk volwassen) DENV virions te onderscheiden.

Extracellulaire blaasjes vrijgegeven in de bloedstroom van gezondevrijwilligers en patiënten met acuut coronair syndroom (ACS)

Met het oog op verschillende EV subsets bij patiënten met ACS en gezonde controles te onderzoeken, we gevangen EVs van bloedplaatjes arm plasma (PPP) door TL-MNP-in combinatie met antilichamen tegen CD31, CD41a of CD63. EV's gevangen genomen door CD31-MNP werden gekleurd voor CD41a en CD63, EV's gevangen genomen door CD41a-MNP werden gekleurd voor CD31 en CD63, en EV's gevangen genomen door CD63-MNP werden gekleurd voor CD31 en CD41a (figuur 3).

De hoeveelheid van EV gefotografeerd door CD31-positieve MNP's en één of twee van de detectie-antilichamen bij patiënten met ACS is 3359 [2328; 5472] EV / ul ten opzichte van 1272 [714; 2157] EV / ul in gezonde vrijwilligers (p = 0,001). Het totale bedrag van EV's gevangen genomen door CD63 in ACS-patiënten in vergelijking met gezonde vrijwilligers was 3541 [1318; 5173] EV / ul vs. 806 [488; 2112] EV / ul (p = 0,007). Er waren 4752 [3238; 7173] EV / ul in het plasma van patiënten met ACS gevangen genomen door CD41a-MNP, terwijl in het plasma van gezonde vrijwilligers dit aantal beduidend lager, 2623 [1927; 4188] EV / ul (p = 0,015). In het algemeen geven de resultaten aan dat, hoewel EV bedragen meestal in ACS-patiënten verhoogd, de grootte van de toename verschillend in verschillende subpopulaties van EV was.

figure-results-1
Figuur 1: Selectieve opname van cellulaire antigenen in HIV-1 virions repliceren in verschillende celtypen. HIV (HIV-1 LAI.04 of HIV-1-SF162) virions vrijgegeven door PBMCs of Jurkat cellen werden vastgelegd met VRC01-MNP en gekleurd met tweede anti-gp120 antilichaam 2G12 en met specifieke antilichamen tegen HLA-DR en LFA-1. De gebrandschilderde voorbereidingen werden onderworpen aan analyse vloeien voor HLA-DR (witte balken) en LFA-1 (zwart bars). Gemiddelden ± SEM van 3-6 experimenten 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Rijping staat van DENV virions. DENV geproduceerd in BHK-21-cellen (A, B) of LoVo cellen (C, D) werden gelabeld met de lipide kleurstof DII en na ultracentrifugatie in dichtheidsgradiënt medium, gekleurd voor prM eiwit met 2H2 antilichamen (A, C) of met isotype controle IgG2a (B, D). De gelabelde virusdeeltjes werden vervolgens vastgelegd met 3H5-1-MNP en onderworpen aan analyse 14 stromen. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

figure-results-3
Figuur 3: Analyse van EV's van ACS-patiënten en gezonde controles. Plasma EV's werden gevangen met CD31-MNP, CD63-MNP of CD41a-MNP en gekleurd met antilichamen tegen CD41a en CD63, tegen CD31 en CD41a en tegen CD31 en CD63, respectievelijk. Gevangen EV, gekleurd met ten minste één van de detectie Abs werden gevisualiseerd en geteld in flow-analyse. De gegevens gepresenteerd als dot plot met mediaan en interkwartielafstand (IQR). Groen symbolen: gezonde vrijwilligers (controles), bruin symbolen: ACS-patiënten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Evaluatieen van de fractie van stroom gebeurtenissen die individuele virions vertegenwoordigen. (A) HIV-1. Opschorting van virions werd verdeeld in twee delen en gekleurd, ofwel met DiD (linker paneel) of DIO (middelste paneel). Na het mengen, de vering, dat twee verschillend lood virusdeeltjes bevatte, werd gevangen met VRC01-MNP en onderworpen aan virometry (rechter paneel) stromen. Aggregaten (dual-gekleurde evenementen) vormden minder dan 10% van de totale gebeurtenissen. (B - D) DENV. Suspensie van Dii gekleurde virions werd serieel tweevoudig verdund van 1: 2 tot 1: 256 en verworven met HTS op een flowcytometer (B). Dil-DENVs werden gemerkt met 2H2 antilichamen (C) of Dil-DENVs werden gevangen met 3H5-1-MNP's (D). Preparaten C en D werden vervolgens serieel verdund tweevoudig van 1: 2 tot 1: 256 en verworven met HTS 14. Virionen lijken niet te aggregeren, omdat in alle gevallenis een lineaire correlatie tussen de verdunningsfactor en het aantal van de gebeurtenissen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Detectie van enkele deeltjes door flowcytometer. Dil-gekleurde DENV suspensie werd serieel tweevoudig verdund van 1: 2 tot 1: 2048 en verkregen met behulp van een HTS op een flowcytometer. (A) Aantal virussen gedetecteerd als een functie van de verdunningsfactor. (B) Mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) van DII gelabelde DENV 14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Evaluatie van de fractie van virions en extracellulaire blaasjes opgenomen met MNP's gekoppeld aan specifieke antilichamen. Gemerkte HIV-1 virions of EV werden opgenomen met MNP's gekoppeld aan specifieke antilichamen en onderworpen aan virometry stromen. Na scheiding op magnetische kolommen werden de flow-through (niet behouden) fracties geanalyseerd op de aanwezigheid van virions of EV's van belang die werden gemist in de eerste run. (A) gelabelde HIV-1 BaL virions werden gevangen met 2G12-MNP (linker paneel). De doorstroomfractie werd teruggewonnen en onderworpen aan virometry (rechterpaneel) stromen. In de eerste cyclus was ongeveer 95% van de virions plaats veroverd. (B) gemerkt EV's werden gevangen met anti-CD81 MNP en geïsoleerd op magnetische kolommen (linker paneel). De doorstroomfractie werd opnieuw opgevangen en geanalyseerd (rechter paneel). In de eerstecyclus ongeveer 99% van de vesicles plaats werden gevangen 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Conventionele flowcytometers blijven belangrijk instrument voor het analyseren van de cellen op basis van hun fysische en chemische eigenschappen op individueel niveau 18. De basisprincipes van flowcytometrie zijn niet veranderd sinds de ontwikkeling ervan: een cel die door de laserstraal passeert en verstrooit licht vormt een gebeurtenis die de opname van de fluorescerende spectra uitgezonden door celgebonden fluorescerende antilichamen triggers. Kleinere deeltjes van minder dan 300 nm kan niet worden gedetecteerd door zijwaartse verstrooiing van een cytometer als ze meer licht verstrooien onder grotere hoeken waarop de meeste flowcytometer niet licht 18 te verzamelen. De hier beschreven techniek, maakt de identificatie en de analyse van veelvoudige antigenen op tal van individuele virussen of EV's met conventionele flowcytometers met fluorescentie triggering.

De kritische stappen in het protocol zijn de koppeling van antilichamen tegen MNP. Onze experimenten werden Performed middels 15 nm ijzeroxide nanodeeltjes met carbonzuur als een reactieve groep zoals eerder beschreven 9. Volgens de fabrikant, kan elke 15 nm MNP maximaal 20 antilichamen binden; we binden ongeveer 10 antilichamen per 15 nm MNP. Deze schatting is gebaseerd op de hoeveelheid antilichamen voor en na koppeling en het aantal kralen / ml zoals gemeten door karakterisering van nanodeeltjes en dimensionering instrumentatie. In principe kunnen koppelen aggregatie van deeltjes veroorzaken en is ongewenst. Om te controleren dat de samenvoeging gebeurt niet met ons protocol, geverifieerd we dit met karakterisering van nanodeeltjes en dimensionering instrumentatie. Dit instrument meet de hydrodynamische diameter van de deeltjes die de coating en antilichaam lagen en niet alleen de kern 15 nm omvat. We vonden dat het merendeel van de gekoppelde kralen bevinden zich op een enkele piek (gemiddelde piek bij 64,7 ± 4,2 nm met 90% van alle gebeurtenissen onder 73 ± 7.3 nm). Het mengen van Ab-MNP complexes met virionen of EV in de juiste verhouding is belangrijk, zodat MNP's in de concentratie van enkele orden hoger dan EV / virions. Dit is essentieel om te verzekeren dat enkel EV / virionen geanalyseerd. Vermijd toevalligheden van de gebeurtenissen door het uitvoeren van cytometer bij lage flow. Zorgen voor de verwerving ter fluorescentie activeren en gebruiken volumetrische controles om de concentratie van de gevangen entiteiten meten.

Echter, MNP's EV of virions aggregeren door verknoping of door de binding van twee of meer virionen dezelfde nanodeeltjes. Om dit te controleren, een test voor aggregatie zoals beschreven in figuur 4 moet worden uitgevoerd. Zelfs individueel gevangen virionen of EV's kunnen gelijktijdig voer de laserstraal van de flowcytometer. Dit zou valse positiviteit maken twee verschillende antigenen. Om dit te voorkomen, dient de flowcytometer worden ingesteld zoals beschreven en de preparaten worden verdund. Men kan controleren of het toeval gebeurt door gebruik te maken van dezelfdestrategie zoals beschreven in het vorige punt. Ook zou het ontbreken van coïncidentie worden gecontroleerd door analyse van seriële verdunningen van het preparaat en bewijzen dat het aantal gebeurtenissen neemt lineair met de verdunning terwijl de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een fluorescerend gekleurd antigeen constant verdunningen (figuur 5) blijft. Een ander probleem is dat er te weinig virussen / EV's kunnen worden vastgelegd. Dit kan te wijten zijn aan de werkelijke schaarste van virussen / EV die antigenen waardoor deze vastlegt specifieke MNP's dragen. Als alternatief kan de efficiëntie van opname laag is om verschillende redenen (bijvoorbeeld inefficiënte koppeling van antilichamen tegen MNP's, afwijking van de verhoudingen van MNP's op virions / EV's ontwikkeld voor dit protocol, etc.). Om deze mogelijkheid te voorkomen, moet de efficiëntie van opname specifiek geëvalueerd. Gewoonlijk moet de efficiëntie ongeveer 90% als in figuur 6.

Verschillende antilichamen kunnen verstoren doorsterische hindering met elkaar of met de antilichamen gekoppeld aan MNP's. Om te controleren dat dit niet gebeurde een reverse capture protocol moet worden getest (zoals beschreven in hoofdstuk 7. In het kort, virionen of EV's moet eerst worden gekleurd met fluorescerende detectie Abs en vervolgens gevangen genomen door Ab-MNP complexen met nascheiding van vrije drijvende Abs op magnetische kolommen.

Flow virometry heeft belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden van de analyse van de antigene samenstelling van virions of EV's. Routinematige biochemische werkwijzen rapporteren over de algemene aanwezigheid van bepaalde eiwitten in de preparaten, maar geven geen informatie over de heterogeniteit van de virions of EV. Dit omvat immunocapture van virions of EV's op grote handel verkrijgbare deeltjes. Dergelijke deeltjes zijn typisch van enkele microns in diameter en elk van hen kan honderden of duizenden virions of EV vangen. Daarom is elke latere analyse gemiddelden de eigenschappen van de virions / EVgevangen genomen door één deeltje. Daarentegen stroom virometry gebruikt MNP's van 10-15 nm in diameter en met de beschreven protocol ten minste 90% van gebeurtenissen een enkelvoudige virion of één EV.

De voornaamste beperking is dat de volledige populatie van virions of EV in de bereiding niet kan worden geanalyseerd, maar alleen die wordt opgepikt. Zo is de keuze van het antigeen waardoor virionen of EV worden opgevangen kritiek wordt. Ook is in tegenstelling tot flowcytometrie het aantal verschillende antigenen (het aantal fluorescerende antilichamen tegen verschillende antigenen) beperkt door het kleine oppervlak van virionen of EV. Tenslotte kunnen verschillende antilichamen sterisch hinderen elkaar weer vanwege de kleine (vergeleken met de cellen) oppervlak.

Het huidige protocol kan worden aangepast voor analyse van virussen of EV van elke oorsprong, mits de specifieke antilichamen waardoor ze kunnen worden opgenomen zijn. Analyse van de antigenen op individuele virions vergunnings onderzoekers aan de pathogenese van verschillende fracties van virale populaties pakken. Bovendien kan identificatie van individuele EV in plasma het mogelijk de oorsprong van EV om bepaalde cellen te traceren en bericht normale of pathologische omstandigheden van deze cellen en de organen waar zij verblijven.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk van AA, SZ, WF, J-C.G en LM werd ondersteund door het NICHD Intramural Programma. Het werk van MV werd ondersteund door de Russische Federatie overheidssubsidie #14.B25.31.0016.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugatie KitsOcean NanotechICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugaalfilterunit met Ultracel-100 membraanMilliporeUFC810024
5 ml Ronde Bodem PP Testbuis, zonder DopFalcon352002
DEPC behandeld waterQuality Biological 351-068-131
SuperMAG-01 magnetische separator Ocean NanotechSuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Muis IgG1 Labeling KitThermo Fisher ScientificZ25055
Nanosep Centrifugaalapparaten met Omega Membraan 100kPall CorpOD100C34
EDTA 0.5 MCorning Cellgro46-034-CI
Rund Serum Albumine oplossingSigma-AldrichA9576-50ML
PBSGibco10010-23
Paraformaldehyde, EM Kwaliteit, GezuiverdEMS15710
123 tellen eBeads eBioscience01-1234-42
CytoCount kralenDakoS2366
AccuCheck tellen kralenInvitrogenPCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST)BD Bioscience642412
Vybrant DiI Cell-Labeling SolutionThermo Fisher ScientificV22885
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting
µMACS kolom Miltenyi Biotec130-042-701
OctoMACS Separator magneetMiltenyi Biotec130-042-108
NanodropThermoFishergeen
NanoSight NS300Malverngeen
BD LSRII flow cytometerBD Biosciencegeen
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
Flowjo softwareFlowjo
BD FACSDiva softwareBD

Referenties

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65(2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17 (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029(2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Virionanalysemagnetische nanodeeltjesflowcytometriecapture van virusdeeltjesenkelvoudige deeltjesanalyseHIV 1 virionenrijping van het denguevirus
Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.