Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Samenvatting

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Samenvatting

De Xenopus oöcyt als een heteroloog expressiesysteem voor eiwitten, werd eerst beschreven door Gurdon et al. ¹ en is op grote schaal gebruikt sinds zijn ontdekking (referenties 2-3, en referenties daarin). Een kenmerk dat de eicel aantrekkelijk voor buitenlandse kanaal expressie maakt is de slechte overvloed van endogene ionkanalen ^4. Het expressiesysteem is nuttig voor het karakteriseren van verschillende proteïnen, waaronder ligand-gated ionkanalen bewezen.

De expressie van _{GABAA-receptoren} in Xenopus oocyten en hun functionele karakterisatie wordt beschreven, inclusief isolatie oöcyten, micro-injecties met cRNA, de verwijdering van folliculaire cellagen en snelle oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten. De procedures werden geoptimaliseerd in dit laboratorium ^5,6 en afwijken van die welke routinematig gebruikt ^7-9. Traditioneel worden ontdaan oöcyten bereidmet een verlengde collagenase behandeling van ovarium lobben bij kamertemperatuur en deze blootgelegde oöcyten gemicroinjecteerd met mRNA. Met de geoptimaliseerde methoden hebben verschillende membraaneiwitten tot expressie gebracht en onderzocht met dit systeem, zoals recombinante GABA _A-receptoren ^10-12, menselijk recombinant chloride kanalen ^13, Trypanosoom kaliumkanalen ¹⁴ en een myo-inositol transporter ^{15, 16.}

De hier beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast voor de expressie van een eiwit van keuze in Xenopus oöcyten, en de snelle verandering oplossing kan worden gebruikt om andere ligand-gated ionkanalen bestuderen.

Inleiding

Xenopus oöcyten worden veel gebruikt als een expressiesysteem (referenties 2-3, en referenties daarin). Ze kunnen goed assembleren en op te nemen functioneel actief multisubunit eiwitten in de plasmamembranen. Met dit systeem is het mogelijk om functioneel onderzoek membraaneiwitten alleen of in combinatie met andere proteïnen, teneinde de eigenschappen van gemuteerde chimere of aaneengeschakelde proteïnen, en potentiële geneesmiddelen te screenen.

Voordelen van oöcyten opzichte van andere heterologe expressiesystemen omvatten de eenvoudige bediening van de reuscellen, het hoge aandeel van cellen die vreemde genetische informatie....

Protocol

Dierproeven zijn goedgekeurd door de plaatselijke commissie van het kanton Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).

1. Bereiding van Xenopus Eicellen

1. Handhaven kikkers (Xenopus laevis) op een 12 uur / 12 uur licht / donkercyclus in water die strikt bij 20 ° C wordt gehouden.
2. Verwijder de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers ^9.
   Opmerking: Het verwijderen van de lobben is een stimulans voor regeneratie en vaak de kwaliteit van de oöcyten verbetert met chirurgie. De eicel wordt onder een vitelline laag, een laag van follikel cellen en bindweefsel ....

Resultaten

Xenopus oocyten werden mechanisch aangeduid met een platina lus (figuur 1). De eicellen werden gemicroinjecteerd met mRNA coderend voor de _{GABAA-receptor} subunits _a4, p _2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / eicel (figuur 2). Na 4 d, werden folliculaire cel lagen verwijderd (figuur 3). Oöcyten spanning geklemd bij -80 mV en blootgesteld aan toenemende concentraties van γ-aminoboterzuur (GABA) in aanwezigheid.......

Discussie

De in dit artikel beschreven methoden afwijken van die van oudsher ^7-9 gebruikt. Standaard worden de lobben van de eierstok blootstellen aan een 1-2 uur collagenase behandeling ^8; isoleren onbeschadigd, ontdaan eicellen; en injecteren mRNA met gebruik van commerciële injecteerinrichtingen. Deze klassieke werkwijze heeft de volgende nadelen: 1) Eicellen waarschijnlijk beschadigd door langdurige blootstelling aan hoge concentraties collagenase. 2) De onstabiele blootgelegde oöcyten worden opgeslagen .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilin/streptomycin	Gibco	15140-148	100 μg penicillin/mL en 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop	zelf gemaakt
Micropipette puller	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton syringe	Hamilton	80300	10 μL, Type 701N
Polytetrafluorethyleen buis met dikke wanden	Labmarket GmBH		1,0 mm OD
Paraffine olie	Sigma	18512
Nylon net, G: 0,8 mm	ZBF Zürcher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicaat glasbuis	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Standard Grade	SERVA	17454
Trypsine inhibitor type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Glas capillair	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1,35 ID mm (voor perfusie), alternatieve leverancier: Harvard Apparatus Limited
Borosilicaat glas capillair	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1,0 OD x  0,58 ID x 100 Lengte mm (voor microinjectie)
Borosilicaat glas capillair	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1,2 OD x 0,69 ID x 100 Lengte mm (voor voltage clamp met twee elektroden)
γ-aminoboterzuur (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-on (THDOC)	Sigma	P2016
grill motor	Faulhaber		DC micromotor Type 2230 met tandwieloverbrenging Type 22/2
Micrometerschroef	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Steriele kunststof transfer pipetten	Saint-Amand  Mfg.	222-20S