Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Summary

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Abstract

De Xenopus oöcyt als een heteroloog expressiesysteem voor eiwitten, werd eerst beschreven door Gurdon et al. ¹ en is op grote schaal gebruikt sinds zijn ontdekking (referenties 2-3, en referenties daarin). Een kenmerk dat de eicel aantrekkelijk voor buitenlandse kanaal expressie maakt is de slechte overvloed van endogene ionkanalen ^4. Het expressiesysteem is nuttig voor het karakteriseren van verschillende proteïnen, waaronder ligand-gated ionkanalen bewezen.

De expressie van _{GABAA-receptoren} in Xenopus oocyten en hun functionele karakterisatie wordt beschreven, inclusief isolatie oöcyten, micro-injecties met cRNA, de verwijdering van folliculaire cellagen en snelle oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten. De procedures werden geoptimaliseerd in dit laboratorium ^5,6 en afwijken van die welke routinematig gebruikt ^7-9. Traditioneel worden ontdaan oöcyten bereidmet een verlengde collagenase behandeling van ovarium lobben bij kamertemperatuur en deze blootgelegde oöcyten gemicroinjecteerd met mRNA. Met de geoptimaliseerde methoden hebben verschillende membraaneiwitten tot expressie gebracht en onderzocht met dit systeem, zoals recombinante GABA _A-receptoren ^10-12, menselijk recombinant chloride kanalen ^13, Trypanosoom kaliumkanalen ¹⁴ en een myo-inositol transporter ^{15, 16.}

De hier beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast voor de expressie van een eiwit van keuze in Xenopus oöcyten, en de snelle verandering oplossing kan worden gebruikt om andere ligand-gated ionkanalen bestuderen.

Introduction

Xenopus oöcyten worden veel gebruikt als een expressiesysteem (referenties 2-3, en referenties daarin). Ze kunnen goed assembleren en op te nemen functioneel actief multisubunit eiwitten in de plasmamembranen. Met dit systeem is het mogelijk om functioneel onderzoek membraaneiwitten alleen of in combinatie met andere proteïnen, teneinde de eigenschappen van gemuteerde chimere of aaneengeschakelde proteïnen, en potentiële geneesmiddelen te screenen.

Voordelen van oöcyten opzichte van andere heterologe expressiesystemen omvatten de eenvoudige bediening van de reuscellen, het hoge aandeel van cellen die vreemde genetische informatie, de eenvoudige besturing van de van eicel middels bad perfusie en de controle van de membraanpotentiaal .

Het nadeel van dit expressiesysteem is de seizoensgebonden variatie waargenomen in veel laboratoria ^17-20. De reden voor deze variatieis verre van duidelijk. Bovendien wordt de kwaliteit van de oöcyten waargenomen vaak sterk variëren. Traditionele methoden ^7-9 hebben de isolatie van eierstok lobben, de blootstelling van eierstok kwabben om collagenase voor een aantal uur, de selectie van de blootgelegde eicellen en de eicel micro-injectie opgenomen. Hier wordt een aantal alternatieve, snelle procedures gerapporteerd die konden we met dit expressiesysteem meer dan 30 jaar zonder seizoensgebonden variatie en weinig variatie in kwaliteit van de oöcyten.

De gewijzigde en verbeterde werkwijzen beschreven voor het isoleren van oöcyten, micro-injectie met cRNA en verwijdering van folliculaire lagen kunnen worden gebruikt voor de expressie van een eiwit van keuze in het Xenopus oöcyt. De eenvoudige werkwijze voor snelle oplossing verandert van het medium rond de eicel kan worden toegepast op de studie van elke ligand-gated ionkanaal en dragers.

Protocol

Dierproeven zijn goedgekeurd door de plaatselijke commissie van het kanton Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).

1. Bereiding van Xenopus Eicellen

1. Handhaven kikkers (Xenopus laevis) op een 12 uur / 12 uur licht / donkercyclus in water die strikt bij 20 ° C wordt gehouden.
2. Verwijder de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers ^9.
   Opmerking: Het verwijderen van de lobben is een stimulans voor regeneratie en vaak de kwaliteit van de oöcyten verbetert met chirurgie. De eicel wordt onder een vitelline laag, een laag van follikel cellen en bindweefsel die de bloedvaten ^21. Het geheel wordt aangeduid als de "follikel."
3. Plaats de lobben van de eierstokken die dicht zijn verpakt met de follikels die de oöcyten in steriele Barth's zoutoplossing ⁷ (MBS) aangevuld met penicilline en streptomycine (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2,4 mM_NaHCO3, 0,82 mM MgSO _4, 0,41 mM _CaCl2, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine).
4. Single-out fase V-VI ²¹ follikels. Houd de eierstok kwab met een tang. Laat de platina lus (figuur 1) via follikels en voorzichtig terugtrekken van de lus om het bindweefsel dat de follikel van eierstokweefsel verstoren.
   OPMERKING: Fase V-VI ²¹ follikels worden gekenmerkt door hun grootte (1,0-1,2 mm diameter) en de goed contrast tussen de donkere gepigmenteerde dier halfrond en de gelige plantaardige halfrond.
5. Transfer alleen gezond ogende follikels (dwz perfect sferisch en met intacte pigmentatie) een 35 mm petrischaal met behulp van een kunststof pasteurpipet (knip terug naar een openingsdiameter van 1,5 mm).

2. Micro-injectie van mRNA in het cytoplasma

Opmerking: Het micro- injectie systeem beschreven wordt afgeleid van het door Kressmann en Birnstiel ²² gerapporteerd.

1. Bereid cRNA's van de respectievelijke cDNA's coderend voor de subeenheden van de α β _{4 2} δ _{GABAA-receptor} in vitro transcriptie, toevoeging van een poly (A ⁺⁾ staart en RNA kwantificering door ²³ gelelektroforese.
2. Bereid micro-injectie pipetten van borosilicaatglas capillairen (1,0 mm buitendiameter (OD), 0,58 mm binnendiameter (ID), 100 mm lengte) met behulp van een micropipet trekker. Breek de uiteinden van de glazen capillairen onder een microscoop met een micromanipulator en microvezel een tip diameter van 12 creëren - 15 urn met een afgeschuinde punt.
3. Backfill de micro-injectie pipetten met paraffine olie met behulp van een 10 ml spuit en vervolgens monteer de micro-injectie pipet op een zelfbouw MICRoinjection inrichting (figuur 2).
   Attentie: de zelfbouw olie hydraulische injectie apparaat bestaat uit een grill motor bestuurd door een voetpedaal schakelaar. Een extra schakelaar wijzigt de stand draaien van de motor. Deze motor drijft een micrometer schroef (0,5 mm / turn) die voorschotten of trekt de zuiger van een 10 pi glazen spuit. De injectie met een snelheid van ongeveer 3 rpm en 0,5 beurt overeenkomt met een 50 nL injectie in een follikel. Het uiteinde van de spuit is verbonden met dikwandige polytetrafluorethyleen buis die zich aan de injectienaald verbonden door een kort stuk Tygon-buis. De injectie capillair wordt gehouden door een boorkop, dat wordt gecontroleerd door een micromanipulator. Het gehele systeem is gevuld met paraffineolie. Eventuele luchtbellen moeten worden vermeden, aangezien zij het injectiesysteem zal schaden. De setup is verlicht met een koude lichtbron. Een stereomicroscoop vereist voor optische controle. Follikels worden gevisualiseerd onder koud licht met een stereomicroscope (40x vergroting). Prestaties van de injectie opstelling wordt getest door het injecteren van radioactieve tracer in Xenopus oocyten. Een volume van 45 - 55 nL moet per injectie worden geleverd.
4. Met behulp van een pipet met steriele plastic tip, test de opstelling door een druppeltje steriel water op de schone binnenkant van een vochtbestendige thermoplast (2 x 2 cm). Dompel de punt van de injectie pipet in dit druppeltje, en zet de motor aan de zuiger (negatieve druk in de injectie pipet) intrekken.
   OPMERKING: Water moet de pipet te geven en een zichtbare interface met olie.
5. Trek de punt van de pipet uit de druppel en positieve druk aan op de binnenzijde van de injectiepipet. Een waterdruppeltje dient de punt van de injectiepipet vormen.
6. Voorbereiden op de injectie van de follikels door voering ze met vegetatieve polen naar boven gericht in de tussenruimten van een nylon mesh (G: 0,8 mm) vastgelijmd aan de bodem van een Petri schaal (60 mm) bedekt met MBS.
7. Verdeel 2 pl mRNA met een pipet met steriele plastic tip op de schone binnenkant van een thermoplast. Neem het mRNA tot in de injectiepipet door toepassing van negatieve druk op de binnenkant van de injectiepipet.
8. Plaats de injectie pipet over een individuele follikel met behulp van de micromanipulator.
9. Steek de injectienaald in het midden van de vegetatieve pool en injecteer 50 nL van mRNA met een stroomsnelheid van 0,6 ul / min door het toepassen van positieve druk aan de binnenkant van de pipet. Wacht 5-10 s voor het verwijderen van de injectie pipet tip van de follikel tot mRNA ontsnapping te voorkomen.
   Opmerking: Het mRNA worden geïnjecteerd in de vegetatieve (geel) pool injectie in de kern, die is gelegen in het dier halfrond voorkomen.
10. Breng de geïnjecteerde follikels een nieuwe petrischaal (35 mm) gevuld met 2 ml MBS. Plaats de schotel in een wijnkoeler ingesteld op 18 ° C. Incubeer de geïnjecteerde follikels voor 1 -7 d voor de opname, afhankelijk van de identiteit van de nieuw tot expressie gebrachte eiwit.

3. Strippen van de follikels (figuur 3)

OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, de eicel onder een vitelline laag, follikel cellen en bindweefsel, die de bloedvaten ²⁴ bevat, is bekend als een "follikel." Alle lagen behalve de vitelline laag die mechanische stabiliteit verricht zonder beperking van de toegang van oplossingen aan het celoppervlak moet worden verwijderd voordat elektrofysiologische experimenten. De follikel zonder het omringende cellagen eerder werd aangeduid als een "Denuded" eicel ^25. Deze stap wordt gewoonlijk uitgevoerd op dezelfde dag als de elektrofysiologische experimenten.

1. Transfer tien geïnjecteerd follikels een borosilicaatglas met 0,5 ml MBS, 1 mg / ml collagenase en 0,1 mg / ml trypsineremmer. Dompel de buis in een waterbad gehandhaafd op 36 ° C. Incubeer defollikels gedurende 20 min en schud de buizen af ​​en toe.
2. Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s.
3. Breng de follikels een derde buis met 0,5 ml dubbel geconcentreerde MBS met 4 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) en incubeer ze gedurende 4 minuten bij RT. Schud de buis af en toe.
   OPMERKING: De hypertone oplossing (dubbel geconcentreerde MBS) gebruikt om krimp van de oöcyten in follikel cellagen, waardoor folliculaire cellagen van de eicel los te induceren; EGTA toegevoegd om collagenase te remmen.
4. Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s.
5. Breng de eicellen naar een petrischaal (35 mm diameter) met 2 ml MBS. Onder een stereomicroscoop, scheiden de buitenste enveloppen uit de follikels doorgewoon druk op de naakte eicel weg met behulp van de platina lus.
   OPMERKING: De buitenste omhulsels van de oöcyten goed zitten aan de kweekschaal en kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de oöcyten. Sommige eicellen spontaan verliezen hun buitenste enveloppen en zullen worden verhaald als blootgelegde eicellen. Deze procedure leidt tot een relatief stabiel preparaat dat de sferische uiterlijk van de oöcyten houdt.

4. Snel Oplossing Verander rond de eicel

1. Voer een voltage clamp experiment, zoals beschreven ^9,26.
2. Verander de oplossing van de zwaartekracht perfusie systeem door de perfusie schakelaars zoals vereist door het experiment.
   1. Breng de perfusie-oplossing bij 6 ml / min door een glazen capillair met een binnendiameter van 1,35 mm, waarvan de mond wordt geplaatst ongeveer 0,4 mm vanaf het oppervlak van de eicel, om snelle veranderingen in de concentratie agonist rond de eicel mogelijk maken.
      LET OP: De snelheid van verandering heeft eerder raming geweestd 70% in minder dan 0,5 s ^27.

Results

Xenopus oocyten werden mechanisch aangeduid met een platina lus (figuur 1). De eicellen werden gemicroinjecteerd met mRNA coderend voor de _{GABAA-receptor} subunits _a4, p _2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / eicel (figuur 2). Na 4 d, werden folliculaire cel lagen verwijderd (figuur 3). Oöcyten spanning geklemd bij -80 mV en blootgesteld aan toenemende concentraties van γ-aminoboterzuur (GABA) in aanwezigheid...

Discussion

De in dit artikel beschreven methoden afwijken van die van oudsher ^7-9 gebruikt. Standaard worden de lobben van de eierstok blootstellen aan een 1-2 uur collagenase behandeling ^8; isoleren onbeschadigd, ontdaan eicellen; en injecteren mRNA met gebruik van commerciële injecteerinrichtingen. Deze klassieke werkwijze heeft de volgende nadelen: 1) Eicellen waarschijnlijk beschadigd door langdurige blootstelling aan hoge concentraties collagenase. 2) De onstabiele blootgelegde oöcyten worden opgeslagen ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilin/streptomycin	Gibco	15140-148	100 μg penicillin/mL en 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop	zelf gemaakt
Micropipette puller	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton syringe	Hamilton	80300	10 μL, Type 701N
Polytetrafluorethyleen buis met dikke wanden	Labmarket GmBH		1,0 mm OD
Paraffine olie	Sigma	18512
Nylon net, G: 0,8 mm	ZBF Zürcher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicaat glasbuis	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Standard Grade	SERVA	17454
Trypsine inhibitor type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Glas capillair	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1,35 ID mm (voor perfusie), alternatieve leverancier: Harvard Apparatus Limited
Borosilicaat glas capillair	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1,0 OD x  0,58 ID x 100 Lengte mm (voor microinjectie)
Borosilicaat glas capillair	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1,2 OD x 0,69 ID x 100 Lengte mm (voor voltage clamp met twee elektroden)
γ-aminoboterzuur (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-on (THDOC)	Sigma	P2016
grill motor	Faulhaber		DC micromotor Type 2230 met tandwieloverbrenging Type 22/2
Micrometerschroef	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Steriele kunststof transfer pipetten	Saint-Amand  Mfg.	222-20S