Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Summary

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Abstract

Transcriptionele coregulators zijn essentieel voor de efficiënte transcriptionele regulatie van de structuur van nucleair chromatine. Co-regulators spelen een verscheidenheid aan rollen bij het reguleren van transcriptie. Deze omvatten de directe interactie met transcriptiefactoren, de covalente modificatie van histonen en andere eiwitten, en de incidentele verandering van chromatine-conformatie. Daarom is het vaststellen van relatief snelle methoden voor het identificeren van eiwitten die binnen dit netwerk interageren, cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van de onderliggende regulatorische mechanismen. LC-MS/MS-gemedieerde identificatie van eiwitbindingspartners is een gevalideerde techniek die wordt gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te analyseren. Door immunoprecipitatie van een eerder geïdentificeerd lid van een eiwitcomplex met een antilichaam (soms met een antilichaam voor een getagd eiwit) is het mogelijk om de onbekende eiwitinteracties via massaspectrometrie-analyse te identificeren. Hier presenteren we een methode voor eiwitvoorbereiding voor de LC-MS/MS-gemedieerde high-throughput identificatie van eiwitinteracties die nucleaire cofactoren en hun bindingspartners betreft. Deze methode zorgt voor een beter begrip van de transcriptionele regulatorische mechanismen van de beoogde nucleaire factoren.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties een belangrijke rol in vele biologische functies. Als zodanig zijn deze interacties betrokken bij signaaltransductie; eiwit transport over celmembranen; celstofwisseling; en verschillende nucleaire processen, waaronder DNA-replicatie, DNA schade herstel, recombinatie en transcriptie ^{1, 2, 3, 4.} Het identificeren van de eiwitten die betrokken zijn bij deze interacties is daarom van cruciaal belang voor onze kennis van deze cellulaire processen.

Immunoprecipitatie (IP) is een gevalideerde techniek om eiwit-eiwit interacties analyseren. Om de identificatie van co-immunogeprecipiteerd eiwitten vergemakkelijken, wordt vaak gebruikt massaspectrometrie ^{5, 6, 7, 8,9.} Door zich te richten een bekend lid van een eiwitcomplex met een antilichaam, is het mogelijk om het eiwitcomplex te isoleren en vervolgens de onbekende componenten identificeren via massaspectrometrie analyse. ARIP4 (androgeen-receptor interactie eiwit 4), een transcriptie coregulator samenwerkt met nucleaire receptoreiwitten voor het activeren of onderdrukken zijn doel promotors in een context-afhankelijke wijze ^{9, 10.} Om beter te begrijpen van de transcriptie regulerende mechanismen die deze nucleaire factoren beschrijven we een uitgebreide methode te zuiveren en te identificeren ARIP4 interagerende eiwitten met behulp van de LC-MS / MS-systeem.

Protocol

1. Transfectie

1. Zaad HEK293 cellen in 100 mm kweekplaten (2 x 10 ⁶ cellen / schaal). Cultuur van de cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum, 100 ug / ml streptomycine en 100 eenheden / ml penicilline. Incubeer de cellen in een vochtige incubator bij 5% _CO2 en 37 ° C.
2. De volgende dag transfecteren de cellen met 10 ug-FLAG tag ARIP4 plasmide middels 40 gl transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant ^11.

2. Eiwitextractie

1. Ongeveer 36 uur na transfectie, was de cellen met ijskoude PBS en oogst de cellen met behulp van een schraper. Breng de cellen in een 1,5 mltube en Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5x het volume pellet van 0,4 M KCl-buffer (met hoge zout buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteaseremmer cocktail). Draai het mengsel gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
2. Centrifugeer de buis bij 17.700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
3. Breng de bovenstaande (whole-cell extract) naar een nieuwe 2 ml buis en voeg 3x het beginvolume van 0 M KCl-buffer (verdunning buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail).
4. Maak een andere centrifugatie (17.700 g gedurende 10 min bij 4 ° C) en giet het supernatant (cellulair extract) naar een nieuwe 2 ml buis.

3. Immunoprecipitatie

1. Tijdens de centrifugatie (2,4), was 50 pl anti-FLAG kralen met PBS, 0,1 M glycine-hydrochloride, en vervolgens 1 M Tris-hydrochloride, gevolgd door tweemaal wassen met 0,1 M KCl-buffer (lage zout buffer: 20 mM Tris HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail). De centrifugatie gedurende dit wasproces wordt uitgevoerd bij 2000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
2. Meng 50 pl FLAG kralen met de gehele celextracten en voorzichtig zwenken het mengsel gedurende 4 uur bij 2-4 ° C (1% van het gehele celextract uit stap 2.4 moeten ook bij -80 ° C voor toekomstig gebruik bewaard als ingang).
3. Breng het monster op een micro-spin-kolom (zwaartekracht drop). Houd het doorstroomkanaal in een 1,5 ml buis, bevriezen met vloeibare stikstof, en het op -80 ° C (controleer de eiwit niveaus van zowel de input en doorstroming via Western blot analyse).
4. Voeg 1 ml 0,1 M KCl-buffer (laag zout buffer) aan de FLAG parels (zwaartekracht drop) wassen.
5. Herhaal stap 3,4 ten minste vier keer (voor een totaal van vijf wassingen).

4. Elutie

1. Plaats de kolom in een 1,5 ml buis en centrifugeer het op 2000 g gedurende 1 min; de korrels droogt.
2. Cap de onderkant vande kolom.
3. Voeg 50 ul (gelijk aan het volume van FLAG parels) van 0,1 M glycine-HCl (pH 2,5).
4. Schud het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml buis en centrifugeer bij 2000 xg deze gedurende 1 min.
6. De geëlueerde oplossing wordt geneutraliseerd met 10 pi 1 M Tris-HCl (pH 8,0); Meng goed door pipetteren of met een vortexmachine.

5. Alkylering en trypsine

1. Voeg 50 ul van 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 pl _CH3CN en 2 pl dithiothreitol aan het mengsel (112 ui totaal volume).
2. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 56 ° C.
3. Het monster wordt bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
4. Voeg 10 ul van 333 mM joodaceetamide om het monster en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
5. Voeg 10 ul trypsine (33 ng / ul) aan het mengsel en incubeer deze overnacht bij 37 ° C.

6. LC-MS / MS Analysis

1. Na 's nachts trypsine, vervoeren het eindproduct van een LC-MS / MS voorziening of aan een derde partij massaspectrometrie laboratorium voor analyse ^12.

Results

We identificeerden een sterk signaal ARIP4, ongeveer 160 kDa, evenals die van een mock vergelijkingsmonster en verscheidene andere onbekende eiwitten (Figuur 1). LC-MS / MS analyse identificeerde zowel ARIP4 complex peptiden en de potentiële peptide cofactoren in de fractie van FLAG parels (tabel 1). p62 (Sequestosome1), een bekende ARIP4 cofactor ¹¹ werd geïdentificeerd in de analyse (tabel 1), waarbij de werkzaa...

Discussion

Efficiënte transfectie is essentieel voor een succesvol resultaat met dit protocol verkregen. Daarom raden wij u aan Western blot analyse om de immunogeprecipiteerd FLAG-gemerkte eiwitten te bepalen. Deze stap kan de gebruiker controleren of hun eiwit van interesse behoren tot overexpressie wordt gebracht en bovendien dat de IP is gelukt. FLAG-gemerkt eiwit niveaus ook vóór de massaspectrometrie analyse gecontroleerd.

Een mock monster moet worden gebruikt als een negatieve controle te vermij...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA vrij) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Afiniteitsgel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Kolommen	BIO-RAD	732-6204