Brain metastase is uitgegroeid tot een dringende onvervulde medische noodzaak als de incidentie is toegenomen, terwijl de therapeutische opties palliatieve zijn gebleven. Het creëren van experimentele diermodellen van de hersenen metastase via intracarotid arteriële injectie van kankercellen vergemakkelijkt mechanistische studies van de ziekte biologie en de evaluatie van nieuwe interventies regimes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intracarotid Cancer Cell Injection aan muismodellen van Brain metastase Produce
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Metastase, de verspreiding en groei van kwaadaardige cellen op secundaire plaatsen binnen het lichaam van een patiënt, goed voor> 90% van kanker-gerelateerde sterfte. Onlangs zijn indrukwekkende vooruitgang in nieuwe therapieën dramatisch verlengde overleving en een betere kwaliteit van leven voor veel kankerpatiënten. Helaas, de incidentie van de hersenen metastatische recidieven stijgt snel, en alle huidige therapieën zijn slechts palliatieve. Daarom zijn goede experimentele diermodellen dringend nodig om diepgaande studies van de ziekte biologie te vergemakkelijken en om nieuwe therapeutische regimes te beoordelen voor preklinische evaluatie. Echter, de standaard in vivo metastase assay via staartader injectie van kankercellen produceert voornamelijk longen uitgezaaide laesies; dieren meestal bezwijken voor de longtumor last voordat zinvolle uitgroei van de hersenen metastase. Intracardiale injectie van tumorcellen produceert metastatische laesies op meerdere organen sites, waaronder de hersenen; Echter, de variabiliteit vanteit van tumorgroei geproduceerd met dit model is groot, demping haar nut bij het evalueren van de therapeutische werkzaamheid. Betrouwbare en consistente diermodellen voor hersenmetastasen studie genereren Hier beschrijven we een werkwijze voor het produceren van experimentele hersenmetastasen in het huis muis (Mus musculus) via intracarotid injectie van tumorcellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om een groot aantal van de hersenen metastase-dragende muizen met een vergelijkbare groei en sterfte kenmerken te produceren, dus moet het onderzoek de inspanningen om fundamentele biologische mechanismen te bestuderen en om nieuwe therapeutische middelen te beoordelen vergemakkelijken.
Inleiding
Metastase van kanker aan het centrale zenuwstelsel (CNS) is een verwoestende ziekte, en kan ofwel de hersenparenchym of leptomeningen ( "hersenmetastasen" verwijst naar zowel in dit artikel) omvatten. Het overheerst intracraniale maligniteit outnumbering primaire gliomen met> 10: 1 1, 2. Longkanker, borstkanker, melanoom en zijn de drie belangrijkste neoplastische ziekten die hoge incidentie van hersenmetastasen 3, 4 produceren. De laatste jaren hebben indrukwekkende vooruitgang in nieuwe kankertherapie dramatisch verlengde overleving en een betere kwaliteit van leven voor veel kankerpatiënten. Echter, bij herhaling, de incidentie van hersenmetastasen neemt snel toe. Zo is het anti-HER2 antilichaam Trastuzumab (Herceptin) significante klinische werkzaamheid bij patiënten met HER2 + borstkanker aangetoond; nog een verontrustende trend is ontstaanbij deze patiënten: tot 1/3 van die waarvan extracraniale systemische ziekte aanvankelijk geprofiteerd van trastuzumab behandeling later ontwikkelen hersenmetastasen 5, 6, 7. Helaas, patiënten met hersenmetastasen refractair zijn voor bijna alle huidige behandelingen meestal ervaren een traumatische verslechtering van de levenskwaliteit en de overleving na een jaar na de diagnose is slechts 20% ~ 8. De huidige therapieën voor de hersenen metastase (waaronder steroïden, craniale radiotherapie en chirurgische resectie bij geselecteerde patiënten) zijn slechts palliatieve, niet curatief 9. Daarom wordt hersenmetastasen opkomst als de volgende imposante uitdaging in dit tijdperk van nieuwe kankertherapieën. Om de onvervulde uitdaging patiënten elke dag geconfronteerd worden in de kliniek aan te pakken, dringend moeten we beter inzicht in de onderliggende mechanisme van de hersenen metastase en het gebruik van deze kennis om nieuwe therapieën te ontwikkelen.
succesvolle kolonisatie van de hersenen door metastatische kankercellen vereist prestaties van een aantal functies gemedieerd door de complexe interactie van meerdere biologische spelers, zoals de bypass van de bloed-hersen barrière (BBB) en ontsnappen aan de hersenen intrinsieke immuun verdedigingsmechanismen 10, waarvan geen enkele is gekaderd een ex vivo of in vitro systeem. Dus goede en getrouwe in vivo modellen kritisch voor studies van hersenmetastasen. Een gebruikelijke in vivo metastase assay introduceert kankercellen via staartader injectie, waardoor de meeste cellen in de longen worden ingediend. Brain metastatische laesies worden zelden geproduceerd in deze modellen voor dier dood door tumorlast veroorzaakt in de longen 11. Directe intracerebrale injectie van kankercellen produceert consistente tumor uitgroei in het CZS en wordt veel gebruikt in de studies van de primaire gliomen. Echter, sUCH injectie compromitteert de BBB en veroorzaakt ernstige verwondingen bij de injectieplaats, beide grote aandachtspunten om de fysiologische relevantie van dit model. Andere veelgebruikte kankercel introductie route intracardiale injectie, is eenvoudig te beheren en maakt experimentele metastase produceren het CNS. Echter, gelijktijdige uitzaaiingen naar andere dan de CNS orgel locaties altijd geproduceerd en kunnen dierlijke sterfte 11 veroorzaken; Daarom is de hoge mate van variabiliteit van het model maakt het ongeschikt voor kwantitatieve evaluatie van biologische mechanismen of geneesmiddelen met een beperkt aantal dieren.Hier beschrijven we de procedures experimentele hersenmetastasen produceren via de injectie van kankercellen in de halsslagader. We hebben deze methode gebruikt om de bijdragen van individuele genen 'ontleden om de metastatische cascade van de hersenen uitzaaiingen en de werkzaamheid van therapeutische interventie te evaluerens 12, 13. De belangrijkste voordelen van deze benadering zijn de hoge mate van reproduceerbaarheid en geringe variabiliteit; het grootste nadeel de verfijning en vaardigheid vereist om de microchirurgie voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek statement: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Bereid kankercellen voor injectie
- Zaad de kankercellen een of twee dagen vóór de injectie. Gebruik DMEM / F12 medium aangevuld met 10% FBS, tenzij een bijzondere medium in de literatuur is vermeld voor een bepaalde cellijn.
- Op de dag van de operatie, oogst cellen wanneer ze bij 70-80% confluentie door eerst wassen met serumvrij medium keer eerder trypsine (0,25%) gedurende 1-2 min bij 37 ° C. Naar in cellen 10% FBS-DMEM / F12 media om de 0,25% trypsine doven.
- Centrifugeer de cellen bij 80 x g gedurende 3 minuten. Was de cellen in serumvrij medium tweemaal om residueel serum te verwijderen, tel de cellen met een hemocytometer en resuspendeer in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) en 1-5 x 10 6 cellen / ml, afhankelijk van de cellijn. Keep on iceop het moment van injectie.
OPMERKING: MDA-MB-231-borstkankercellen en K1735 melanoomcellen werden in dit onderzoek, en beide cellijnen werden gebruikt 2 x 10 6 cellen / ml concentratie. Houd de duur trypsine zo kort mogelijk overbehandeling kan de resultaten van metastase assays beïnvloeden.
2. Bereid muizen voor de injectie van tumorcellen
- Verdoven muizen door intraperitoneale (ip) injectie van ketamine / xylazine cocktail (ketamine 100 mg / kg xylazine 10 mg / kg).
- Bevestig volledige verdoving door knijpen het dier voeten en observeer gebrek aan reactie.
- Plaats de muis op een glasplaat (gebruikt voor het gieten van eiwit gels), en zet vast met elastiekjes.
- Verwijder indien nodig het haar van de nek door het scheren of het aanbrengen van een kleine hoeveelheid van de ontharing product en veegde het haar af met een papieren handdoek. NB: Bij gebruik van naakt muizen, deze stap overslaan omdat ze geen lichaamshaar hebben.
- Reinig de nek huid door het aanbrengenpovidonjood en 70% alcohol.
- Plaats de muis op het podium van de stereomicroscoop
- Een insnijding in de huid ~ 1 cm lang met een chirurgische scalpel.
- Botweg ontleden de spier met getande tang om de halsslagader eronder bloot te leggen.
- Scheid de halsslagader van de aangrenzende nervus vagus met chirurgische pincet.
- Met behulp van chirurgische tang, scheiden sommige katoen uit een watje, bevochtigen, en mode in een kleinere watje. Plaats deze buffer gehydrateerd watten onder de halsslagader van de beoogde plaats van injectie.
- Plaats een hechtdraad distale en proximale de katoenen bal en maak losse knopen. Draai het proximale knoop om de bloedstroom in de injectieplaats blokkeren.
- Ga verder met kankercel injectie als de halsslagader op de watten wordt volledig onder druk gebracht met verse rode bloed.
3. Cancer Cell Injectie in halsslagader
- Vortex en stelt 100 ul of kankercellen in de spuit.
- Onder de microscoop ontleden, en steek langzaam de 31 G naald (met schuine omhoog) in het lumen van de halsslagader zitten op de top van de watten.
- Injecteer langzaam de cellen van de spuit in de halsslagader. Succesvolle injectie kan onder de microscoop worden waargenomen door de kleurverandering van de nabijgelegen bloedvaten en spieren bij gebufferde kankercellen worden geduwd in de circulatie.
- Bij injectie van het volledige volume voltooid is, tilt het distale halsslagader zachtjes regurgitatie voorkomen.
- Snel zet de distale knoop op de injectie te voltooien.
- Na het voltooien van de injectie, draai de ligaturen en trim het overtollige zijden hechtdraad met micro-schaar onder de microscoop ontleden. Achteruit de afgescheiden spier om de wond te dekken. Sluit de huid met twee nietjes.
4. Chirurgische Recovery
- Beweeg de geopereerde dieren op een verwarmingselementvoor herstel. 60 min voor de dieren om het bewustzijn te herwinnen - Het kan 30 nemen. Ondertussen dienen buprenorfine (0,05 mg / kg) subcutaan als postoperatieve analgesie. Opmerking: analgesie moeten worden verstrekt op basis van uw lokale IACUC goedgekeurd protocol.
- Zodra de dieren ontwaken en hervatten hun normale gedrag, de terugkeer van de muizen om hun woning locatie. Zorg voor muizen met gel voedsel voor enkele dagen na de operatie. Handhaven van een chirurgische plaat en bewaar het in de kamer.
5. Niet-invasieve in vivo beeldvorming
- Voor cellen gemerkt met luciferase reporter constructen meten kankercel injectierendement gebruik in vivo beeldvormingssysteem 14.
OPMERKING: Imaging wordt niet uitgevoerd op de dag van de injectie sterk belast om proefdieren te vermijden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Er zijn twee punten waar de kwaliteit van de injectie kan worden geëvalueerd. De eerste kans is door waarneming van het veranderen bloedvat kleuren tijdens de injectie van de operator. Lekkage van slechte injecties kunnen gemakkelijk worden waargenomen onder de stereomicroscoop. De stabiele en zekere plaatsing van de muis (Afbeelding 1A) en de halsslagader (Figuur 1B) zo op het watje kritieke factoren voor een soepele en succesvolle injectie in de halssl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stappen voor succesvolle halsslagader injectie van kankercellen: 1) diepe verdoving van muizen ter voorbereiding van chirurgische ingreep; 2) stabiele plaatsing van halsslagader bovenop de katoensteun; 3) strak ligatie van de halsslagader na een succesvolle injectie.
Deep anesthesie van ~ 30 min is meestal nodig voor stabiele chirurgische prestaties onder de microscoop ontleden. We maken gebruik van commercieel kant-en-klare ketamine / xylazine cocktail voor muis verdoving...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen dankbetuigingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | De microscoop is modulair en zeer configureerbaar om aan specifieke ruimtelijke vereisten te voldoen. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | om huidinsnijdingen te maken |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | om spieren botweg te dissekeren |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | om de halsslagader te scheiden en voor te bereiden voor injectie |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | om hechtingen door te snijden |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | voor wondsluiting |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | voor celinjectie |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
Referenties
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8(2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
