De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo&#39;s als<em&gt; In Vivo</em&gt; Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions

Samenvatting

Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo's.

Samenvatting

Opmerkelijk weinig cel-tot-cel signaaltransductieroutes zijn nodig tijdens de embryonale ontwikkeling om de grote verscheidenheid aan celtypen en weefsels in de volwassen lichaamsvorm te genereren. Toch worden er elk jaar meer componenten van individuele signaalroutes ontdekt, en onderzoeken geven aan dat er, afhankelijk van de context, significante cross-talk is tussen de meeste van deze routes. Deze complexiteit maakt het bestuderen van cel-tot-cel signalering in elk in vivo ontwikkelingsmodelsysteem een moeilijke taak. Bovendien zijn efficiënte functionele analyses vereist om moleculen te karakteriseren die geassocieerd zijn met signaalroutes die zijn geïdentificeerd uit de grote datasets gegenereerd door next generation differentiële screens. Hier illustreren we een eenvoudige methode om efficiënt componenten van signaaltransductieroutes te identificeren die de celbestemming en asspecificatie in zee-egelembryo's bepalen. De genomische en morfologische eenvoud van embryo's, vergelijkbaar met die van de zee-egel, maken ze krachtige in vivo ontwikkelingsmodellen voor het begrijpen van complexe signaalinteracties. De hier beschreven methodologie kan worden gebruikt als sjabloon voor het identificeren van nieuwe signaaltransductiemoleculen in individuele routes, evenals de interacties tussen de moleculen in de verschillende routes in vele andere organismen.

Inleiding

Gen regulerende netwerken (GRNs) en signaaltransductiewegen stellen de ruimtelijke en temporele expressie van genen tijdens de embryonale ontwikkeling die worden gebruikt om het volwassen dier lichaam kunnen samenstellen. Cel-tot-cel signaaloverdracht zijn essentiële componenten van deze regulerende netwerken die het mogelijk maakt waarbij cellen communiceren. Deze cellulaire interacties vast te stellen en verfijnen van de expressie van de regelgevende en differentiatie genen in en tussen de verschillende gebieden tijdens de embryogenese ^{1, 2.} Interacties tussen uitgescheiden extracellulaire modulatoren (liganden, antagonisten), receptoren en co-receptoren controle over de activiteiten van signaaltransductieroutes. Een assortiment van intracellulaire moleculen transduceert deze ingangen resulteert in veranderde genexpressie, delen en / of vorm van een cel. Hoewel veel van de sleutelfactoren die de extracellulaire en intracellulaire niveaus in grote pathwaybekend is, is een onvolledige kennis grotendeels te danken aan de complexiteit van afzonderlijke signaalpaden. Bovendien hebben verschillende signaalwegen vaak met elkaar positief of negatief in de extracellulaire intracellulaire en transcriptionele niveau ^{3, 4, 5, 6.} Belangrijk is dat de kerncomponenten van signaaltransductiewegen sterk geconserveerd in alle metazoan soort en, opmerkelijk meeste grote signaalwegen voeren vaak dezelfde ontwikkelingsfunctie in vele species bij vergelijking organismen van nauw verwante phyla name ^{7, 8, 9, 10, 11.}

De studie van signalering tijdens de ontwikkeling is een enorme taak in elk organisme, en erzijn verscheidene belangrijke uitdagingen voor het bestuderen signaalwegen meeste nieuwmondigen modellen (gewervelde, ongewervelde chordates, hemichordaten en stekelhuidigen): 1) In vertebraten er grote aantallen mogelijke ligand en receptor / co-modulator interacties intracellulaire transductie moleculen, alsmede mogelijke interacties tussen verschillende signaalwegen vanwege de complexiteit van het genoom ^{12, 13, 14;} 2) Het complex morfologie en morfogenetische mutaties in gewervelden vaak moeilijker om functionele interacties in en tussen signaaltransductieroutes interpreteren; 3) Analyses in de meeste niet-echinoderm invertebrate nieuwmondigen model soorten worden beperkt door korte vensters van graviditeit met uitzondering van enkele soorten manteldier ^{15, 16.}

Dezeeëgel embryo enkele van de hierboven genoemde beperkingen en biedt een uitstekende eigenschappen voor het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van signaaltransductie in vivo. Deze omvatten het volgende: 1) De relatieve eenvoud van de zee-egel genoom vermindert het aantal mogelijke ligand, receptor / coreceptor en intracellulaire transductie molecuul interacties ^17; 2) De GRNs besturen van de specificatie en patroonvorming van de kiem lagen en grote embryonale assen zijn goed ingeburgerd in zeeëgel embryo, hulp bij het begrijpen van de regulerende context van de cel / gebied ontvangen van de signalen ^{18, 19;} 3) Vele signaaltransductieroutes kunnen worden onderzocht tussen splitsing en vroege stadia, gastrula embryo uit één gelaagde epitheel waarvan de morfologie gemakkelijker te analyseren; 4) De moleculen omvattend in signaalwegen in de zee-egels zijn gemakkelijk te manipuleren; 5) Veel zee-egels zijn gravid gedurende 10 tot 11 maanden per jaar (bv Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus).

Hier presenteren we een methode om systematisch en doeltreffend karakteriseren componenten van de signaalroutes die aangeven en patroon gebieden zeeegel's naar de voordelen die verschillende ongewervelde modelsystemen bieden in de studie van complexe moleculaire mechanismen illustreren.

Protocol

1. High Throughput Morfolino Design Strategy

1. Identificeer een gen (s) van belang (bijvoorbeeld kandidaat-gen benadering, cis-regulerende analyse RNAseq en / of proteomics differentiële schermen).
2. Gebruik genomische, transcriptoom, en genexpressie gegevens beschikbaar over regelmatig bijgewerkt websites (bv SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ en S. purpuratus Genome Search http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) om vast te stellen dat de spatiotemporele expressie profiel overlapt met de ontwikkelings-mechanisme in kwestie. Als geen expressie gegevens beschikbaar zijn, dan genereert qPCR primers en / of een antisense probe voor in situ genexpressie patroon beoordelen.
3. Na het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie, het verkrijgen van de DNA-sequentie van de genomische websites.
   1. Voor het opwekken van translatie-blokkerende morfolino oligonucleotiden, het verkrijgen van sequentie of de 5 'niet-vertaalde gebied (5' UTR) direct stroomopwaarts van het initiatiecodon van expressed sequence tag (EST) databases beschikbaar SpBase of S. purpuratus Genome Search websites. Als deze informatie niet beschikbaar is voor het gen van belang, voer dan 5 'RACE.
   2. Om een verbinding te blokkeren morfolino ontwerpen, zoeken naar de genoomsequentie waaronder de exons en introns met behulp van het schavot BLASTN instrument in SpBase of S. purpuratus Genome Search tool.
4. Met het oligonucleotide ontwerpen website http://oligodesign.gene-tools.com teneinde de gewenste 25 baseparen sequentie morfolino ontwerpen.
   1. Voor een translationele blokkering morfolino Gebruik de mRNA sequentie van 5 'naar 3' als bron van translationele doelsequentie. Omvatten de 5 'UTR sequentie (ongeveer 70 nucleotiden stroomopwaarts van de transcriptie startplaats) plus 25 basen van coderende gebied (stroomafwaarts van de startplaats) met het startcodon gemarkeerde with haakjes (ATG).
   2. Voor een verbinding blokkerende morfolino, selecteert intron-exon of exon-intron grens sequentie en omvatten 50 basen (25 bases van exon sequentie en 25 bases van intronsequentie) rond de grens regio's. Scan het genoom met morfolino sequentie te controleren of de sequentie is uniek.

2. Micro-injectie van morfolino oligonucleotiden

1. Bereid 3 mM voorraadoplossingen van de morfolino oligonucleotiden door toevoeging van 100 pi nuclease-vrij water in de 300 nmol morfolino flacon.
   LET OP: Gebruik geen DEPC behandeld water voor de re-ophanging, omdat diethylpyrocarbonaat de morfolino kunnen beschadigen.
2. Voor de eerste bereiding draai naar beneden de flacon met de voorraad oligonucleotide oplossing gedurende 30 seconden op volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), kort vortex, warmte bij 65 ° C gedurende 5 tot 10 min, kort vortex, en houden de morfolino voorraad bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Morfolino stockoplossing s zijn opgeslagen -20 ° C tot 4 ° C.
3. Bereid injectieoplossing die morfolino oligonucleotiden in de gewenste concentratie. Deze oplossing bevat gewoonlijk 20% glycerol en 125 mM KCl als drager en 15% FITC-dextraan (fluoresceïne isothiocyanaat dextran 10.000 MW 2,5 mg / pl voorraadoplossing). FITC-dextraan en andere fluorescerende dextran conjugaten worden routinematig gebruikt om geïnjecteerde embryo's te identificeren door epifluorescentie microscopie. WINKEL injectieoplossingen bij -20 ° C.
4. Verwarm de morfolino oplossing bij 65 ° C in een verwarmingsblok of waterbad gedurende tenminste 2-5 minuten.
5. Kort draaien de morfolino oplossing gedurende 30 seconden bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg) gedurende ten minste 10 min.
6. Laad de injectienaalden met de morfolino oplossing. Voor een gedetailleerde micro-injectie protocol zie Stepicheva en Song, 2014 ²¹ en Proost en Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixatie en In Situ Protocol na 24 uur na de bevruchting (HPF) in S. purpuratus Embryo's

LET OP: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van Arenas-Mena et al. , 2000 ²³ en Sethi et al. 2014 ^24.

1. bevestiging
   1. Voeg enkele druppels fixatief (zie hieronder) om putjes die embryo's, meng voorzichtig door pipetteren, en hen in staat stellen om zich te vestigen. Verwijder het fixatief en meng embryo's met twee additionele 180 pl wassingen fixatief.
      LET OP: Het is belangrijk om goed te mengen de embryo's tijdens de wasbeurten door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. Als dit niet gebeurt kan de signaal-ruisverhouding te verlagen.
   2. Laat de embryo vast te stellen in de tweede fixeermiddel was voor 50 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in 4% paraformaldehyde elektronenmicroscopie rang bestaande uit 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, en kunstmatige seawater (ASW). Maak deze oplossing vers elke keer voor de beste resultaten. Bovendien Eenvoudig, praktisch embryo's worden gefixeerd in 96-well platen.
      1. Voor 20 ml fixeermiddel gebruik 5 mL 16% paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi 1 M MOPS pH 7,0, en 20 ul Tween-20.
   3. 5 keer wassen bij kamertemperatuur met 180 ul MOPS wasbuffer bestaande uit 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl en 0,1% Tween-20 gedurende ten minste 5 minuten of totdat embryo naar de bodem van de put. Nogmaals, het is belangrijk om de embryo's in de wasbuffer meng door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. MOPS wasbuffer kan worden gebruikt voor 2 dagen houdbaar bij 4 ° C.
      1. Voor 40 ml MOPS wasbuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH ₂ O en 40 ul Tween-20.
      2. Vaste embryo's kunnen gedurende 2 dagen bewaard bij 4 ^° C.
         Opmerking: Als het opslaan vaste embryo langer, voeg dan 0,2% natriumazide in MOPS wasbuffer om bacteriegroei te voorkomen.
2. Pre-hybridisatie
   1. Zuig het MOPS wasbuffer en voeg 180 ul van een 2: 1 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo's in de oplossing door voorzichtig pipetteren meerdere malen en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Hybridisatiebuffer bestaat uit 70% formamide, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA en 0,1% Tween-20.
      1. Voor 40 ml hybridisatiebuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH ₂ O, 0,04 g BSA en 40 ul Tween-20. Meng goed door vortexen, voeg 28 ml formamide, en vortex weer.
   2. Verwijder de 2: 1 verhouding van MOPS wassen en hybridisatie buffers en voeg 180 ul van een 1: 2 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo in de oplossing en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Voordat probe hybridisatie meng embryo's in 100-150 ul hybridisatiebuffer. Incubeer embryo's bij 50 ° C gedurende ten minste 1h.
      OPMERKING: incuberen embryo 's nachts is aanvaardbaar. Vóór incuberen, sluit de putjes van een kleefvel om verdamping te voorkomen.
3. Hybridisatie
   1. In een afzonderlijke buis voeg 0,1-0,3 ng / pl probe en 500 ug / ml gist tRNA in hybridisatiebuffer, dan vortex zachtjes probe-oplossing te maken. Gist tRNA wordt toegevoegd aan de probe-oplossing om niet-specifieke binding van de antisense probe verlagen. Verwarm de oplossing tot 50 ° C, en zuig hybridisatiebuffer.
   2. Mix pre-embryo gehybridiseerd in 100 pi van de probe-oplossing, afdichting met een kleefvel en hybridiseren bij 50 ° C gedurende 2-7 dagen, afhankelijk van de probe (de foxq2 probe kan worden gedurende 2 dagen).
      LET OP: Incubation tijden zullen variëren op basis van de sonde. Sommige genen tot expressie op een laag niveau vereisen tot 7 dagen incubatie. 96-well platen kunnen in een vochtige doos worden geplaatst verzekering tegen verdamping als de kleefstoive vel niet goed af te dichten.
   3. Was 5 keer bij 50 ° C met 180 pi vers gemaakte MOPS wasbuffer voor een totaal van 3 uur. Vervolgens was 3 keer (15 minuten) met 180 ul MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. Vergeet niet om te mengen embryo's in de wasbuffer telkens met enkele malen zachtjes pipetteren.
4. antilichaam Incubation
   1. Zuig het MOPS wasbuffer en meng embryo's in 180 ui blokkerende buffer bestaande uit 10% normaal serum van schapen en 5 mg / ml BSA in wasbuffer MOPS en incubeer gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht.
   2. Verwijder blokkerende buffer en meng embryo's in het blokkeren van buffer die een 1: 1500 verdunning van alkalische fosfatase geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam verdund in het blokkeren van buffer. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur in een gesloten plaat verdamping plaatsvindt. OPMERKING: antilichaam niet achter op meer dan 's nachts.
   3. Was de embryo's 6 keer (5 minuten of tot de embryo's te laten vallen) in MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. embryo's kunnenworden 's nachts bewaard bij 4 ° C.
5. In situ ontwikkeling
   1. Was embryo 3 keer (10 min) bij kamertemperatuur met vers gemaakte pH 9,5 buffer bestaande uit 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM _MgCl2, 1 mM Levamisol en 0,1% Tween-20.
      1. Voor 20 mL pH 9,5 buffer gebruik 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 ui 5M NaCl, 1 ml 1 M _MgCl2, 20 ul Tween-20, 16,6 ml dH ₂ O en 0,0048 g Levamisool.
   2. Incubeer embryo's bij 37 ° C in kleurbuffer beschermd tegen licht. Kleuring buffer bestaat uit 10% dimethyl formamide, 4,5 ul / ml 4-nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) en 3,5 pl / ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) in vers bereide pH 9,5 buffer .
      1. Voor 1 ml vlekken buffer 100 ul dimethyl formamide, 4,5 pi NBT en 3,5 pi BCIP.
   3. Stop de alkalische fosfatase reactie door wassen 3-5 keer MOPS wasbuffer. De reactie with de foxq2 sonde duurt meestal 30 minuten tot 1 uur. Sommige probes kunnen overnacht incubatie nodig op ofwel kamertemperatuur of 4 ° C.
   4. Meng embryo's in een oplossing van 70% MOPS was en 30% glycerol. De glycerol verschaft een brekingsindex nodig voor microscopie. Embryo's kunnen worden opgeslagen in deze oplossing gedurende enkele weken. Dicht de platen met plastic paraffine om verdamping te voorkomen.
6. Dia voorbereiding en vastleggen van het beeld
   1. Bereid een dia door het organiseren van drie kleine strookjes dubbelzijdige tape in een driehoek met kleine openingen tussen de stroken op een glijbaan.
   2. Overdracht van de embryo's in de 70% MOPS was en 30% glycerol oplossing voor het midden van de driehoek en bedek met een dekglaasje.
   3. Dicht de dekglaasje door een laag nagellak rond de randen van het dekglaasje.
   4. Maak foto's met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop met een 20X objectief en een aangesloten camera.

Resultaten

In de zee-egel embryo hebben we aangetoond dat 3 verschillende Wnt signalering branches (Wnt / β-catenine, Wnt / JNK en Wnt / PKC) ^{4, 25} interactie vertonen een Wnt signalering netwerk anterior-posterior (AP) patronen regelt vormen. Een van de belangrijkste gevolgen van deze signalering gebeurtenissen is die de oorspronkelijke algemeen uitgedrukt anterior neuroectoderm (ANE) GRN wordt beperkt tot een klein gebied rond de oogbol d...

Discussie

De hier gepresenteerde methodiek is een voorbeeld dat de kracht van het gebruik van embryo's met minder genomische en morfologische complexiteit dan gewervelde dieren aan de signalering-routes en GRNs betreffende fundamentele ontwikkelingsstoornissen mechanismen te begrijpen illustreert .. Veel labs worden met vergelijkbare testen tijdens de zee-egel vroege ontwikkeling van het ontleden signaalwegen betrokken bij andere lot van de cel specificatie evenementen (bijv Notch, Hedgehog, TGF-β, en FGF signalering...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Translational-blocking morpholino en/of splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Aangepast	Meer informatie op www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluoresceïne isothiocyanaatje)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Maak 25 mg/mL stockoplossing
Paraformaldehyde 16% oplossing EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Gist tRNA	Invitrogen	15401-029
Normaal geitenserum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline fosfatase-geconjugeerd anti-digoxigenine-antilichaam	Roche	11 093 274 910
Tetramisoolhydrochloride (levamisol)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Natriumchloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesiumchloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-fosfaat	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blauw tetrazoliiumchloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Kaliumchloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Natriumbicarbonaat	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesiumsulfaat	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calciumchloride	Sigma Aldrich	C1016-500G