We presenteren een methode voor de isolatie en de cultuur van de muis Wolffian kanaal (WD). We hebben ook een gedetailleerde procedure voor de hele berg immunokleuring van gekweekte / vers geïsoleerde WDS met fluorescent gelabelde antilichamen aan te tonen. Samen vormen deze technieken kan de studie van de WD ontwikkeling, oprollen, en differentiatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tubal morfogenese een fundamenteel vereiste voor de ontwikkeling van de meeste zoogdieren organen, waaronder het mannelijke voortplantingssysteem. De bijbal, een integraal onderdeel van het mannelijke voortplantingsstelsel, is verantwoordelijk voor spermaopslag, rijping en transport. De volwassen bijbal is een zeer opgerolde slang die zich ontwikkelt van een eenvoudige en rechte embryonale voorloper bekend als Wolffian kanaal (WD). Goede oprollen van de bijbal essentieel is voor mannelijke vruchtbaarheid, zoals sperma in de testis niet een eicel te bevruchten zijn. Het mechanisme verantwoordelijk voor epididymis ontwikkeling en coiling blijft onduidelijk, mede door het ontbreken van hele orgaankweek en beeldvorming. In deze studie beschrijven we een in vitro kweeksysteem en geheel mount immunofluorescentie protocol bij het proces van WD coiling en ontwikkeling, die ook kan worden toegepast op andere buisvormige organen bestuderen beter zichtbaar.
Inleiding
Het mannelijke voortplantingssysteem bestaat voornamelijk uit testis, de site voor kiemcellen ontwikkeling en differentiatie, en een complex ductaal systeem dat nodig is voor de rijping, transport en opslag van sperma. Bijbal is een buisvormig orgaan dat testis met zaadleiders en voornamelijk betrokken bij post-testis ontwikkeling en rijping van kiemcellen 1 verbindt. De zeer opgerolde volwassen muizen bijbal ontwikkelt zich van een eenvoudige en rechte voorloper buis, Wolffian kanaal (WD) 1. De complexe en gewikkelde structuur van epididymis is essentieel voor sperma het vermogen om vrouwelijke kiemcellen 2 bevruchten verkrijgen. Hoe zo'n belangrijk orgaan voor mannelijke vruchtbaarheid ontwikkelt en krijgt in vorm is niet goed begrepen. Verschillende signaalroutes bleken betrokken te zijn bij de ontwikkeling van WD zoals Wnt signaling pathway 3,4 en androgeen signaleringsroute 5. Onze recente werk is de eis van de bal gevestigdewichtige Wnt-signalering voor WD wikkelen tijdens de prenatale ontwikkeling 4. Echter, verder onderzoek nodig is om de mechanismen betrokken bij postnatale epididymis wikkelen, celdifferentiatie en cel-cel communicatie in de epididymis epitheel en interstitiële cellen te begrijpen.
Genetisch gemodificeerde muismodellen hebben bewezen een krachtig instrument voor de identificatie / validering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en de ziekte van de verschillende orgaansystemen 6 zijn. Ondanks het veelvuldig gebruik, zijn er aanzienlijke beperkingen van genetisch gemodificeerde muismodellen, zoals de onvoorziene fenotype gerichte muizenmutanten met betrekking tot veronderstelde genfunctie en geen fenotype in null mutanten in sommige modellen invloed van genetische en omgevingsfactoren, arbeidsintensief en tijdrovende proces van het ontwikkelen muismodellen. Daarom is de interpretatie van de betekenis van de bevindingen enige genetisch modified muismodellen is niet altijd eenvoudig 6. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door in vitro orgelcultuur systeem dat ons de flexibiliteit om meerdere signaalwegen in real time onder gecontroleerde kweekomstandigheden manipuleren geeft. Orgelcultuur systeem is instrumenteel in het begrijpen van de fysiologie en pathologie van hele organen 7. Bovendien beeldvorming van gehele organen gekleurd met fluorofoor gemerkte antilichamen kunnen wij de markers van belang visualiseren in een driedimensionale context, zoals bekend in vivo, waardoor een beter begrip van de vorm van het orgel, structuur en functie 8.
Hier hebben we de werkwijzen voor isolatie van muis embryonale gonadale richels, in vitro kweek en volledige mount immunofluorescentie beeldvorming van WDS, die kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen met betrekking tot de morfogenese van buisvormige organen zoals WDS beantwoorden beschreven. In dit protocol, wegeïsoleerde muis embryonale urogenitale ruggen van 15,5 dagen na coïtum (DPC) zwanger dammen en gekweekt hen gedurende 3 dagen gevolgd door immunokleuring voor epitheliale cellen marker (cytokeratine 8, CK8), een celproliferatie marker (fosfo-histon 3, PH3) en actieve βcatenin.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierenverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care en de ethische commissie van de Universiteit van Newcastle en bevestigd aan de New South Wales Animal Research Act, New South Wales Animal Research verordening, en de Australische code voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden. Alle ondernomen op muizen procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en de ethische commissie van de Universiteit van Newcastle.
1. Time Mating
- Pair 6-8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen vlak voor het einde van daglicht cyclus.
- Controleer de vrouwtjes voor de aanwezigheid van vaginale pluggen vroege ochtend (op of vóór 08:00) elke dag. Dag van de plug wordt beschouwd als 0.5 dpc.
- Breng de vrouwen met vaginale plug in een nieuwe kooi (zonder mannelijk) en het etiket van de datum van de plug.
2. Isolatie van muis embryonale Gonadale Ridges
- Isoleer muis embryonic gonadale richels van 15,5 dpc zwangere vrouwen zoals beschreven in 9, met enkele wijzigingen zoals hieronder beschreven.
- Uit te voeren dissectie voor de middag als de tijd zwangere vrouwen worden beschouwd in de volgende dag van de zwangerschap door 's middags te gaan.
- Sacrifice 15,5 dpc zwangere vrouwen met behulp van cervicale dislocatie (of volgens het protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Ethics Committee).
- Houd de muis op zijn rug op absorberend vloeipapier en spuit de ventrale zijde van de buik met 70% ethanol.
- Til de onderste buikhuid (ventrale zijde) met een pincet en maak een laterale incisie met behulp van chirurgische schaar, dat zich uitstrekt van urogenitale opening naar het einde om ribbenkast. Trekt de huid naar de kop van het dier aan de buik bloot.
- Snijd de buikspieren met chirurgische schaar peritoneale holte bloot. Pak de zwangere baarmoeder met een tang net boven de baarmoederhals en maak een snede. Til nu de baarmoeder door te oordelen op to de urineblaas en snijd de baarmoeder brede ligament, gevolgd door bezuinigingen bij de tubale kruispunten om de baarmoeder los te maken van de peritoneale bijlage.
- Breng de baarmoeder in een 50 ml buis met ijskoud HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). Was de zwangere baarmoeder voorzichtig met ijskoude HBSS om het overtollige bloed te verwijderen.
- Houd de baarmoeder in een petrischaal met ijskoude HBSS en blijf op ijs. Snijd de baarmoederwand en verwijder de embryo's. Houd de embryo's in een frisse petrischaal met HBSS op het ijs.
- Neem een schone steriele papier en zet het op een nieuwe petrischaal. Spray 70% ethanol op het vloeipapier. Blijf embryo deze tissuepapier aan de laterale zijde en knippen van onderbuik met een steriel mes in de richting zoals getoond met onderbroken lijn in figuur 1.
- Bevestig de embryo op een steriele spons basis door pinning de wervelkolom.
- Plaats het onder de ontleden stereomicroscoop en zorgvuldig snijd langs de ventrale middellijn. Verwijder de lever en darmen. De muis urogenitale systeem (nier, ureter, testis, WD, en zaadleiders) moet nu zichtbaar zijn.
- Knip de testis en WD, en bewaar in een frisse petrischaal met HBSS, op ijs. Tot het afsluiten van de WD en testis, snijd de zaadleider dicht bij zijn gehechtheid aan urethra en snijd de bevestiging van de onderste deel van WD uit gubernaculum.
- de testes en WDS zwembad van de embryo's van dezelfde groep (dit kan variëren volgens de proefopzet).
3. Cultuur van de embryonale Gonadale Ridges (figuur 2)
- Bereid medium voor het kweken van de embryonale gonadale richels aanvulling DMEM / F12 met 10% FBS (foetaal runderserum), 1% penicilline / streptomycine en 1% L-glutamine. Verwarm de media tot 37 ° C in een waterbad.
- Voeg 300 ul van media per putje van een 24-well celkweek plaat.
- Neem een frisse Petri bord en zet een kleine daling van steriele HBSS op. Zet een polycarbonaat spoor ets membraan (0,881; m) op deze daling van HBSS met zijn glanzende oppervlak tegenover de HBSS.
- Het gebruik van schone tang zet twee WDS en de geslachtsklieren op het membraan (op het ruwe oppervlak, naar boven) en verwijder het maximumbedrag van HBSS met behulp van steriele doekjes / absorberend papier. Heeft het weefsel met absorberend papier niet aan; Anders zal het weefsel beschadigen.
- Zorg ervoor dat noch de WDS noch de geslachtsklieren elkaar raken. Anders zullen ze samen tijdens de daaropvolgende incubatie plakken.
- Breng de membraan met de weefsels in het putje van een plaat met 24 putjes die 300 ul kweekmedium en cultuur ze op air-medium interface. Teveel kweekmedium op membranen resulteert in een cystic groei van WDS.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator, bij aanwezigheid van 5% CO2.
- Verander het kweekmedium dagelijks. Om het medium met de pipet te veranderen, verwijder het medium uit de put eerste en voeg dan 300 pi van de voorverwarmde vers medium.
Notitie:Voor het bestuderen van het effect van verschillende signaalwegen op WD morfogenese, kan chemische activatoren en / of remmers van de gewenste concentraties aan het kweekmedium worden toegevoegd. - Cultuur weefsels gedurende 3 dagen. Binnen 3 d, afgewikkeld WDS verzameld uit een 15,5 dpc embryo te vormen tot zeer ingewikkelde buizen (Figuur 3B). De toevoeging van de Wnt inhibitor, IWR1, leidt tot remming van WD coiling (Figuur 3C).
- Voor het oogsten van deze weefsels neem een petrischaal met ijskoude PBS. Breng de membraan met gekweekte gonade en WD in de Petri plaat. Het membraan drijft op de PBS. Druk op het membraan om het te zinken in PBS en neem de gonaden en WD.
- Bevestig de weefsels met 4% paraformaldehyde (PFA) O / N bij 4 ° C of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Indien nodig, neem heldere veld beelden van WDS voor fixatie.
4. Whole Mount Immunofluorescentie
- Was de gefixeerde weefsels 3x met PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) met rustige heen, 10 minuten elk, bij kamertemperatuur.
- Dehydrateer de weefsels in een gegradeerde reeks van ethanol (25%, 50%, 75% en 100%), 10 minuten elk, bij 4 ° C onder langzaam schommelen (~ 30 rpm). Bij deze stap kan het weefsel worden bewaard bij 4 ° C in 75% ethanol.
- Om de ethanol te veranderen, houdt de weefsels ongestoord gedurende 2 minuten en laat de weefsels settelen. Neem zoveel supernatant mogelijk en voeg vervolgens de volgende hogere concentratie van ethanol. Om schade aan het weefsel te voorkomen, moet de pipetpunt niet de weefsels aanraken of fase.
- Na dehydratatie, hydrateren de weefsels in een gegradeerde reeks van ethanol (100%, 75%, 50% en 25%), 10 minuten elk, bij 4 ° C, met rustige heen.
- Was de weefsels met PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 minuten elk, bij kamertemperatuur onder zacht schommelen (~ 30 rpm).
- Blokkeer de weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met blokkerende buffer (PBS + 1% BSA + 0,2% vetvrije droge melkpoeder + 0,3% Triton X-100).
- after blokkeren, breng de weefsels primaire antilichaamoplossing (verdund in blokkerende buffer) en geïncubeerd O / N bij 4 ° C onder zacht schommelen (~ 30 rpm). Verdunningen van de primaire antilichamen die zijn beschreven in de Materialen tabel.
- De volgende dag, wassen weefsels met PBS-MT (PBS + 2% vetvrije droge melkpoeder + 0,5% Tween-20), 4x, 30 minuten elk, bij kamertemperatuur onder zacht schommelen (~ 30 rpm).
- Na deze wasstap, voeg secundair antilichaam in een verdunning van 1: 250 (deze stap nodig optimalisatie voor afzonderlijke antilichamen) in blokkeerbuffer en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zachtjes wiegen.
- Vanaf nu houden de weefsels bekleed met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen als secundaire antilichamen worden gemerkt met lichtgevoelige fluoroforen.
- Was de weefsels 3x met PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 minuten elk, met zachte wiegen.
- Bereid je dia's voor de montage van de gekleurde weefsels.
- Voor deze, knip de glazen dekglaasjesin dunne reepjes met behulp van een diamant pen en plak twee stroken over elkaar op het glaasje met behulp van nagellak. Maak twee grenzen en plaats weefsel tussen deze twee grenzen.
- Voeg DAPI met montage medium en op een cover slip. Solliciteer nagellak op de hoeken van het deksel slip om het te bevestigen aan de dia.
Let op: Weefsels zijn nu klaar voor de beeldvorming. Bewaar deze dia's bij -20 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tijdens de ontwikkeling, de WD ondergaat aanzienlijke veranderingen, waarbij een eenvoudige en rechte buis is omgetoverd tot een zeer complexe en opgerolde buis. Gebruik van werkwijzen hierboven beschreven, WDS ondergaan een vergelijkbare modificaties in kweekomstandigheden. Hier hebben we de resultaten van WDS gekweekt gedurende 3 d (figuur 3) weergegeven. Om de moleculaire mechanismen betrokken bij WD morfogenese ontleden, kan het kweekmedium worden aangevuld met remmers en activatoren gericht is op v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het orgelcultuur systeem heeft vele voordelen boven de traditionele celcultuur. Dit systeem behoudt de oorspronkelijke structurele relaties en interacties tussen verschillende celtypen. Het bootst in vivo systemen en geeft meer accurate informatie dan celcultuur studies waar de niche factor is afwezig. Het gebruik van organen kweeksystemen zelfs voordelen boven het gebruik van het gehele dier. Deze omvatten de hogere kosten van het gebruik van het gehele dier, gemakkelijk onderhoud van orgaan- kweeksysteem,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij willen graag de leden van de gynaecologische oncologie groep bedanken voor de kritische lezing van dit manuscript. Dit werk wordt mede ondersteund door de financiering van de National Health en Medical Research Council, de Australian Research Council, en de Kanker Instituut NSW (PST). MK is een ontvanger van de Universiteit van Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24-well plates | Corning, USA | 3524 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS gebruikt in cultuurmedium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentratie gebruikt |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentratie gebruikt |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membran (0.8 µm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentratie gebruikt |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS voor gebruik. TOTXISCH - draag handschoenen en kan niet worden weggegooid in de gootsteen |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absoluut, maak 25, 50 en 75% met milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Zeer viskeus, voorzichtig tijdens het doseren |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Zeer viskeus, voorzichtig tijdens het doseren |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blokkeerbuffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blokkeerbuffer |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blokkeerbuffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blokkeerbuffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blokkeerbuffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | kan worden gekocht bij andere leveranciers |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | - |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Gebruik om nucleïnezuren (DNA) te kleuren |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Oplosmiddel |
| Cover Slips (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Referenties
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343(2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
