Methodenartikel

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55157

⸱

19 januari 2017

 ,  ,  , 
1Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Core Research Facility, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier een relatief snelle en eenvoudige benadering voor het in kaart brengen van genoom-breed replicatietiming bij zoogdieren, van celisolatie tot de basisanalyse van de sequentieresultaten. Een genomische kaart van een representatief replicatieprogramma zal worden verstrekt volgens het protocol.

Samenvatting

Replicatie van het genoom plaatsvindt tijdens de S fase van de celcyclus in een sterk gereguleerd proces dat de getrouwheid van DNA-duplicatie zorgt. Elk genomisch gebied wordt gerepliceerd op een specifieke tijd gedurende de S-fase door de gelijktijdige activering van verschillende oorsprongen van replicatie. Tijd van replicatie (ToR) correleert met vele genoom en epigenetische kenmerken en is gekoppeld aan mutatie tarieven en kanker. Het begrijpen van de volledige genomische uitzicht op de replicatie-programma, in gezondheid en ziekte is een belangrijke toekomstige doel en uitdaging.

Dit artikel beschrijft in detail de "Copy Number Verhouding S / G1 voor het in kaart brengen van genomische Time of Replication" methode (hierin genoemd: CNR-ToR), een eenvoudige benadering van de genoomwijde ToR van zoogdiercellen kaart te brengen. De werkwijze is gebaseerd op het kopienummer verschillen tussen de S-fase cellen en G1-fase cellen. De CNR-ToR werkwijze wordt uitgevoerd in 6 stappen: 1. Bereiding van cellen en kleuring met propidiumjodide (PI); 2. Sorting G1 en S-fase cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); 3. DNA-zuivering; 4. Sonicatie; 5. voorbereiding en sequencing Bibliotheek; en 6. Bioinformatica analyse. De CNR-ToR methode is een snelle en eenvoudige aanpak die resulteert in gedetailleerde replicatie kaarten.

Inleiding

Zoogdier DNA replicatie strak geregeld om de juiste replicatie van elk chromosoom precies één keer te verzekeren tijdens de celcyclus. Replicatie gebeurt op basis van een sterk gereguleerde order - meerdere grote genomische regio's (~ Mb) te herhalen aan het begin van de S-fase (begin repliceren domeinen), terwijl andere genomische regio's later bootsen midden of late S-fase (midden en late replicerende domeinen) 1. De meeste genoom repliceert tegelijk in alle weefsels (constitutieve ToR domeinen), terwijl 30% - 50% van het genoom verandert ToR tussen weefsels 2, tijdens differentiatie 3, 4 en in mindere mate ook bij kanker transformatie 5 . Bovendien bepaalde genoomgebieden repliceren asynchroon 6, 7, 8, namelijk er is een verschilin de ToR tussen de twee allelen.

ToR correleert met vele genomische en epigenomisch functies, waaronder transcriptie niveaus, GC-gehalte, chromatine staat, gen dichtheid, enz. 1, 9. ToR wordt ook geassocieerd met mutatie tarieven en types 10, 11 en daarom niet verwonderlijk, worden verstoringen van de replicatie-programma verband gebracht met kanker 12, 13. Het causale verband tussen de taakomschrijving en chromatine structuur is nog niet begrepen. Het is mogelijk dat geopend chromatine vergemakkelijkt vroege replicatie. Echter, een alternatief model suggereert dat het chromatine gemonteerd tijdens de replicatie en de verschillende chromatine regulatoren bij het begin en het einde van S-fase leidt tot differentiële verpakking van vroeg en laat replicerende gebieden 1, 14 . We hebben onlangs aangetoond dat de ToR geeft vorm aan de GC-gehalte van invloed zijn op de aard van de mutaties die zich voordoen in verschillende genomische regio's 11.

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is de belangrijkste methode voor het meten ToR op individueel loci. Het is eenvoudig uitgevoerd door het tellen van het percentage S-fase cellen die één FISH signalen versus percentage doubletten voor een bepaald allel 15, 16 vertonen. Een alternatieve methode bestaat uit het labelen van de puls DNA met BrdU, sorteren van cellen op basis van hun DNA inhoud aan verschillende tijdstippen langs S, immunoprecipitatie DNA met BrdU en controleren van de overvloed aan DNA neergeslagen met 17 qPCR.

Genomische ToR mapping kan worden bereikt op twee manieren. De eerste methode is een genomische versie van de BrdU-IP hierboven beschreven, waarin de kwantificering van de hoeveelheidvan geprecipiteerd DNA in elke fractie gelijktijdig uitgevoerd voor het volledige genoom tot hybridisatie aan microarrays of diepe sequencing. De tweede methode, CNR-referentiekader, is gebaseerd op het meten van het aantal kopieën van elk genomisch gebied van S-fase cellen en het normaliseren van het DNA-gehalte in G1 cellen. Bij deze werkwijze worden de cellen gesorteerd door FACS in niet-replicerende (G1-fase) en repliceren (S-fase) groepen (Figuur 1). Cellen in G1 hetzelfde aantal kopieën in alle genomische regio en zullen hun DNA inhoud hetzelfde zijn. Anderzijds, het DNA kopieaantal in S afhankelijk van het referentiekader, sinds begin replicerende regio onderging replicatie in de meeste cellen en dus hun DNA-inhoud wordt verdubbeld, terwijl laat replicerende gebieden nog in de meeste cellen gerepliceerd en dus hun DNA inhoud analoog is aan die van G1 cellen. Vandaar de S om G1-verhouding van DNA-gehalte is een indicatie van het mandaat. De hoeveelheid DNA per genomisch gebied wordt gemeten door hybridisatie metmicroarrays of door diepe sequencing 2, 8. De voordelen van het CNR-ToR methode zal verder worden besproken.

Dit document beschrijft de CNR-Tor methode voor het genoom ToR in kaart brengen, zoals beschreven in figuur 2. Het artikel bespreekt de fijne details van het gehele proces van het verzamelen van de cellen tot de fundamentele analyse van de resultaten en het creëren van genomische ToR kaarten. De in dit document beschreven protocol is met succes uitgevoerd op verschillende celtypen in kweek. Toekomstige verbeteringen van dit protocol kan leiden tot het in kaart brengen van het referentiekader in vivo en in zeldzame celtypen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: ToR kan alleen worden gemeten op de groei, niet-gesynchroniseerde cellen. De procedure begint met ten minste 1-2 x 10 6 snelgroeiende cellen, die gewoonlijk leiden tot ~ 1 x 10 5 cellen in de S fase (de snelheidsbeperkende stap). Het verdient aanbeveling om elk experiment met twee of drie herhalingen voeren. Het hele proces van CNR-ToR kan worden voltooid binnen een week - twee dagen worden gewijd aan alle trappen naar bibliotheek bereiding 01:59 dagen nodig voor sequentiebepaling en een extra dag is noodzakelijk voor de eerste gegevensanalyse.

1. Verzameling van cellen van Culture

OPMERKING: Het protocol is geschreven voor cellen die groeien in kweek in 10 cm platen (met ongeveer 2-5 x 10 6 cellen), maar kan gemakkelijk worden aangepast aan andere platforms.

  1. Voor cellen die werden gekweekt in suspensie, gaat u naar fixatie (deel 2).
  2. Voor hechtende cellen, aspireren en was de plat met 3 ml PBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
  3. Gooi de PBS en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 1 ml trypsine-EDTA commerciële tot cellen los.
    OPMERKING: De duur van de trypsine behandeling moet worden aangepast aan elk type cel.
  4. Voeg 3 ml kweekmedium de trypsine te neutraliseren en verzamel cellen in een 15 ml conische buis of een 5 ml polystyreen buis. Houd op het ijs.

2. fixatie

LET OP: Voor dit deel, alles in het werk moet worden gedaan bij 4 ° C.

  1. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  2. Aspireren en wassen cellen tweemaal met 1 ml koude PBS.
  3. Resuspendeer cellen in 250 pi (totaal) koude PBS.
  4. Terwijl voorzichtig vortexen de buis langzaam druppelsgewijs 800 ul van -20 ° C 100% ethanol. Dit leidt tot een uiteindelijke ethanolconcentratie van 70 - 80%.
    LET OP: Zuiver ethanol wordt aanbevolen bij deze stap.
  5. Incubeer cellen op ijs for 30 min.
    Opmerking: In dit stadium kunnen de cellen worden gedurende een paar dagen bij 4 ° C of gedurende enkele maanden bij -20 ° C.

3. PI kleuring

  1. Centrifugeer de cellen bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  2. Zuig het supernatant voorzichtig en was de cellen tweemaal met 1 ml koud PBS.
  3. Aspireren en resuspendeer elk monster met het volgende mengsel: 1 ml PBS, 5 pl 10 mg / ml RNaseA, 50 pl 1 mg / ml propidiumjodide (PI; mengen flesje voor gebruik). Passen concentratie tot ~ 2 x 10 6 cellen / ml).
    LET OP: Blijf van het licht - PI is lichtgevoelig.
  4. Filteren door middel van 35 um mesh aan een 5 ml polystyreen buis, en sluit af met Parafilm.
  5. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15-30 minuten.
    OPMERKING: Cellen zijn nu klaar voor FACS analyse. Indien nodig kan de gekleurde cellen worden bewaard gedurende ten minste 24 uur bij 4 ° C in het donker.

4. Sort

  1. Sorteer cellen met een FACS-machine. Onse de 561 nm laser om cellen op basis van hun PI intensiteit onderscheiden. Andere lasers in de buurt van de 535 nm excitatie maximum zoals 488 nm of 532 kunnen worden gebruikt afhankelijk van de FACS machine configuratie.
  2. Voor een optimaal resultaat, gebruik maken van de kleinste nozzle aanbevolen voor de specifieke afmetingen cel (voor de meeste cellen 85 pm). Prioriteren zuiverheid modi dan de opbrengst. Gebruik een gestage langzame stroom, meestal tot 300-500 evenementen / s, met een omhulsel druk van 45 psi.
  3. Met behulp van gating, discrimineren dode cellen en subcellulaire puin (lage FCS en hoge SSC) door het uitzetten van FCS vs SSC. Van de levensvatbare cellen onderscheiden doubletten getrokken waarbij SSC-breedte (W) vs SSC-hoogte (H) gevolgd door een FSC-W vs FSC-H perceel en PI- W vs PI-H (doubletten Dezelfde H-waarde maar groter w-waarde). Voor de levensvatbare enkele cellen teken een histogram van de PI-Area (A) intensiteit waarmee de DNA-inhoud van de cellen vertegenwoordigt.
  4. Soort cellen in G1 en S fasen, zoals weergegeven in figuur 1. Gating voor S moet breed zijn en uitsteken in de G1 en G2 fasen, terwijl G1 gating smal moet zijn en zo ver van S mogelijk.

figure-protocol-1
Figuur 1. fase van de celcyclus bepalen op basis van PI intensiteit. Histogram toont de verdeling van het cellulaire DNA-gehalte (gemeten met PI-Area) van muis embryonale fibroblasten (MEF) populatie. Het DNA-gehalte wordt gebruikt om de populatie te sorteren in twee subpopulaties i) G1 cellen (2N DNA inhoud) en ii) S-fase cellen (2N - 4N DNA-gehalte) met de aangegeven gebieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opmerking: bij het verzamelen van G1 cellen verantwoording op voorspanningen in de volgorde efficiëntie tussen verschillende genomische regio. Een alternatieve appvoorn is G1 gearresteerd cellen gebruiken van hetzelfde type cel. Deze aanpak geeft schonere resultaten (omdat het minimaliseert S besmetting fase), maar het kan vooroordelen als gevolg van genetische verschillen tussen de gearresteerde cellen en de gemeten cellen te introduceren.

  1. Sorteer in koude omstandigheden en het verzamelen van gesorteerde cellen in 1,5 / 2 ml buizen. Houd buizen op ijs na de soort.
    Opmerking: Om de DNA herstel te verbeteren, is het beter om lage bindingsaffiniteit buizen gebruikt of buizen bekleed met 4 gebruik - 5% BSA gedurende 1-3 uur bij 4 ° C 18.

5. DNA Purification

  1. Voor elk monster (G1 en S) zuiveren DNA met een DNA-zuivering kit.
    OPMERKING: Bij gebruik van de commerciële kit, elueer met 400 ul elutiebuffer in een 2 ml buisje voor hoge opbrengst, zoals aanbevolen door de fabrikant.
  2. Raadpleeg DNA-concentratie gebruikt fluorometer.
    Opmerking: Van 100.000 zoogdiercellen door FACS verzamelde moeten krijgen ~ 1 ug DNA. EENt dit stadium DNA kan gedurende enkele dagen bewaard bij 4 ° C of bij -20 ° C voor langere opslag.

6. Sonicatie

  1. Transfer DNA in een 1,7 ml buis die compatibel zijn met de magnetische standaard gebruikt is.
  2. Concentreer DNA met 2x SPRI korrels volgens de instructies van de fabrikant onder toepassing van een magnetische standaard en elueren in 50 ul elutiebuffer.
  3. Shear DNA met een gerichte ultrasonicator tot een gemiddelde doelstelling piek van 250 bp. Gebruik de volgende instellingen voor een 50 ul DNA-monster: 50 W, 20% inschakelduur, 200 cycli per burst, 20 ° C, 120 s.
  4. Controleer de grootte van de geschoren DNA door elektroforese. De aanbevolen grootteverdeling is 200-700 bp met een piek bij ~ 250 bp.
    Opmerking: In dit stadium DNA kan worden gehouden voor een paar dagen bij 4 ° C of bij -20 ° C voor langere opslag.

7. Bibliotheek Voorbereiding en Sequencing

LET OP: Veel bibliotheek voorbereiding kits en verschillenent sequencing platforms moet op dezelfde manier werken om degene die gebruikt door ons en vermeld in de sectie materialen. Eigenlijk in het verleden ToR kaarten werden gegenereerd met een soortgelijke werkwijze met microarray platforms 2.

  1. Bereid bibliotheken met behulp van een commerciële bibliotheek voorbereiding kit.
  2. Aan het einde van de bibliotheek voorbereiding, maat selecteren met behulp van magnetische parels voor 300-800 bp.
  3. Na bereiding bibliotheken Meet DNA-concentratie gebruikt fluorometer.
  4. Meet DNA grootte met behulp van elektroforese.
  5. Voer sequencing op elk platform.
    OPMERKING: Sequentiebepaling tenminste 10 M leest per monster wordt aanbevolen. Deze diepte is gelijk aan een te lezen ongeveer elke 300 bp (voor ~ 3 Gb groot genoom), en is voldoende voor ToR metingen met een resolutie van 50 - 100 kb. Toenemende diepte zal resulteren in een afname van de omvang van de vensters en dus in staat stelt toenemende resolutie met hogere zekerheid. Gepaarde end sequencing is niet nodigDit protocol aangezien slechts dekking zijn verzameld. Het wel kunnen helpen bij het oplossen van de locatie van leest die repetitieve sequenties.

8. Analyse

LET OP: Data-analyse is gebaseerd op de methode die wordt gebruikt door A. Koren et al. 19.

  1. Kaart sequencing data naar de overeenkomstige genoom met behulp van bowtie2 of een betrouwbare korte read aligner. Definieer variërende grootte, gelijke dekking chromosomale ramen segmenten onder 200 leest de G1 fractie en tel S-fase leest dezelfde ramen.
  2. Bereken de S / G1 ratio voor elk venster. Dit moet een kaart met grote schommelingen in de S / G1 verhouding langs het genoom (figuur 3) te genereren. Een goede beheersing van de betrouwbaarheid van het mandaat metingen te vergelijken map voor de G1 / G1-verhouding (van twee afzonderlijke metingen van G1) die veel vlakker moeten zijn.
  3. Normaliseren van gegevens naar 0 betekenen en 1 SD door van elk vALUE de gemiddelde waarde van alle vensters (behalve het X-chromosoom) en delen van de resultaten van de standaardafwijking van de S / G1 alle ramen. Dit wordt gedaan om te zetten tot z scores en maakt een onderlinge vergelijking tussen de verschillende experimenten.
  4. Verwijder al gap streek gedefinieerd door de UCSC genoom browser evenals elke resterende inter kloof fragment met minder dan 15 data ramen.
  5. Strijk de overgebleven fragmenten met een cilinderinhoud smoothing spline via de Matlab functie csaps met een parameter van 10-16 en interpoleren op vaste punten elke 100 kb.
    OPMERKING: Parameters effening en interpolatie moet worden aangepast op basis van de diepte van de gegevens. Andere geschikte afvlakmethoden en functies bestaan ​​en kunnen worden gebruikt.
  6. Na visuele bevestiging van de betrouwbaarheid van elke repliceren samenvoegen alle leest en berekent een diepere resolutie profiel door dezelfde werkwijze hierboven beschreven van deze gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een typische ToR kaart wordt weergegeven in figuur 3 voor muis embryonale fibroblasten (MEF). Deze figuur toont het analyseproces aangezien toont zowel de punten die de genormaliseerde S / G1 ratio voor afzonderlijke vensters (stap 8,3) zijn, en de lijn die door de kubische smoothing en interpolatie (stap 8,5).

Dergelijke kaarten vast te leggen voor de organisatie van de replicatie-programma, dat is een lappen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CNR-ToR kan uitgevoerd worden in principe op elke eukaryote prolifererende celpopulatie die kunnen worden gedeeld door FACS op S en G1 fasen (beoordeeld door Rhind N. en Gilbert 20 DM). De hier beschreven methode is aangepast voor zoogdiercellen met een genoomgrootte van ~ 3 Gb zoals mens en muis. Kleine veranderingen in de CNR-ToR protocol (in celpreparaat en sequentiebepaling diepte) nodig, om aan te passen aan andere eukaryoten. Aandacht moet worden besteed aan het verzamelen van voldoende hoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken Oriya Vardi voor hulp bij het genereren van cijfers. Werk in de IS-groep werd gesteund door de Israel Science Foundation (subsidie ​​No. 567/10) en de European Research Council Starting Grant (# 281306).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PBSBI (Biological Industries)02-023-1A
Trypsin-EDTABI (Biological Industries)03-052-1B
15 mL conische buisCorning430790
5 mL Polystyreen ronde bodembuis met celstrainerdopBD-Falcon352235
EthanolGadot64-17-5
RNAse-A 10 mg/mLSigmaR4875
Propidiumjodide 1 mg/mLSigmaP4170
ParafilmParafilmPM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf buisjesEppendorf22431021
BSASigmaA7906
1.7 mL MaxyClear buisAxygenMCT-175-C
magnetische kralen - Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
UltrasonicatorCovarisM-serie -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Schroefdop 6 x 16 mmCovaris520096
Qubit fluorometerInvitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay KitInvitrogenQ32854
Elektroforese 2200 Tape station systeemAgilentD1000 ScreenTape
Sequencing - Illumina NextSeq systeemIlluminaSY-415-1001
Dneasy kit voor DNA zuiveringQiagen69504
PureProteom Magnetic StandMilliporeLSKMAGS08
Anti-BrdU/FITCDAKOF7210
FACS sorterBDFACSARIA III
FACS softwareBDFACSDiva v 8.0.1

Referenties

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011(2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319(2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004(2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502(2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400(2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genoombrede mappingS fase cellenG1 fase cellenfluorescentie geactiveerde cel sorteringpropidiumjodide kleuringDNA zuiveringlibrary preparatiebio informatische analyse

Gerelateerde artikelen