We beschrijven hier een relatief snelle en eenvoudige benadering voor het in kaart brengen van genoom-breed replicatietiming bij zoogdieren, van celisolatie tot de basisanalyse van de sequentieresultaten. Een genomische kaart van een representatief replicatieprogramma zal worden verstrekt volgens het protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Replicatie van het genoom plaatsvindt tijdens de S fase van de celcyclus in een sterk gereguleerd proces dat de getrouwheid van DNA-duplicatie zorgt. Elk genomisch gebied wordt gerepliceerd op een specifieke tijd gedurende de S-fase door de gelijktijdige activering van verschillende oorsprongen van replicatie. Tijd van replicatie (ToR) correleert met vele genoom en epigenetische kenmerken en is gekoppeld aan mutatie tarieven en kanker. Het begrijpen van de volledige genomische uitzicht op de replicatie-programma, in gezondheid en ziekte is een belangrijke toekomstige doel en uitdaging.
Dit artikel beschrijft in detail de "Copy Number Verhouding S / G1 voor het in kaart brengen van genomische Time of Replication" methode (hierin genoemd: CNR-ToR), een eenvoudige benadering van de genoomwijde ToR van zoogdiercellen kaart te brengen. De werkwijze is gebaseerd op het kopienummer verschillen tussen de S-fase cellen en G1-fase cellen. De CNR-ToR werkwijze wordt uitgevoerd in 6 stappen: 1. Bereiding van cellen en kleuring met propidiumjodide (PI); 2. Sorting G1 en S-fase cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); 3. DNA-zuivering; 4. Sonicatie; 5. voorbereiding en sequencing Bibliotheek; en 6. Bioinformatica analyse. De CNR-ToR methode is een snelle en eenvoudige aanpak die resulteert in gedetailleerde replicatie kaarten.
Inleiding
Zoogdier DNA replicatie strak geregeld om de juiste replicatie van elk chromosoom precies één keer te verzekeren tijdens de celcyclus. Replicatie gebeurt op basis van een sterk gereguleerde order - meerdere grote genomische regio's (~ Mb) te herhalen aan het begin van de S-fase (begin repliceren domeinen), terwijl andere genomische regio's later bootsen midden of late S-fase (midden en late replicerende domeinen) 1. De meeste genoom repliceert tegelijk in alle weefsels (constitutieve ToR domeinen), terwijl 30% - 50% van het genoom verandert ToR tussen weefsels 2, tijdens differentiatie 3,<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: ToR kan alleen worden gemeten op de groei, niet-gesynchroniseerde cellen. De procedure begint met ten minste 1-2 x 10 6 snelgroeiende cellen, die gewoonlijk leiden tot ~ 1 x 10 5 cellen in de S fase (de snelheidsbeperkende stap). Het verdient aanbeveling om elk experiment met twee of drie herhalingen voeren. Het hele proces van CNR-ToR kan worden voltooid binnen een week - twee dagen worden gewijd aan alle trappen naar bibliotheek bereiding 01:59 dagen nodig voor sequentiebepaling en een extra dag is noodzakelijk voor de eerste gegevensanalyse.
1. Verzameling van cellen van Culture
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een typische ToR kaart wordt weergegeven in figuur 3 voor muis embryonale fibroblasten (MEF). Deze figuur toont het analyseproces aangezien toont zowel de punten die de genormaliseerde S / G1 ratio voor afzonderlijke vensters (stap 8,3) zijn, en de lijn die door de kubische smoothing en interpolatie (stap 8,5).
Dergelijke kaarten vast te leggen voor de organisatie van de replicatie-programma, dat is een lappen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CNR-ToR kan uitgevoerd worden in principe op elke eukaryote prolifererende celpopulatie die kunnen worden gedeeld door FACS op S en G1 fasen (beoordeeld door Rhind N. en Gilbert 20 DM). De hier beschreven methode is aangepast voor zoogdiercellen met een genoomgrootte van ~ 3 Gb zoals mens en muis. Kleine veranderingen in de CNR-ToR protocol (in celpreparaat en sequentiebepaling diepte) nodig, om aan te passen aan andere eukaryoten. Aandacht moet worden besteed aan het verzamelen van voldoende hoe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Oriya Vardi voor hulp bij het genereren van cijfers. Werk in de IS-groep werd gesteund door de Israel Science Foundation (subsidie No. 567/10) en de European Research Council Starting Grant (# 281306).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A | |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B | |
| 15 mL conische buis | Corning | 430790 | |
| 5 mL Polystyreen ronde bodembuis met celstrainerdop | BD-Falcon | 352235 | |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 | |
| RNAse-A 10 mg/mL | Sigma | R4875 | |
| Propidiumjodide 1 mg/mL | Sigma | P4170 | |
| Parafilm | Parafilm | PM-996 | |
| 1.5 mL DNA LoBind Eppendorf buisjes | Eppendorf | 22431021 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| 1.7 mL MaxyClear buis | Axygen | MCT-175-C | |
| magnetische kralen - Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ultrasonicator | Covaris | M-serie -530092 | |
| 50 µL microTUBE AFA Fiber Schroefdop 6 x 16 mm | Covaris | 520096 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Elektroforese 2200 Tape station systeem | Agilent | D1000 ScreenTape | |
| Sequencing - Illumina NextSeq systeem | Illumina | SY-415-1001 | |
| Dneasy kit voor DNA zuivering | Qiagen | 69504 | |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 | |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III | |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Referenties
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
