Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Summary

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) zijn cel-naar-cel verbindingen die functioneren als gateways waarmee kleine en grote moleculen worden vervoerd tussen plantencellen. Overwegende dat Pd vervoer van kleine molecules, zoals ionen en water, wordt verondersteld te passief optreden, cel-naar-cel vervoer van biologische macromoleculen, dergelijke eiwitten bevatten, meest waarschijnlijk gebeurt via een actief mechanisme waarbij specifieke targeting signalen op de vervoerde molecuul. De schaarste van geïdentificeerde plasmodesmata (Pd) lokalisatie signalen (PLSs) heeft strenge beperkingen op het begrijpen van de eiwit-sorteren trajecten die betrokken zijn bij plant cel-naar-cel macromoleculaire vervoer en communicatie. Van een rijkdom aan plant endogene en virale eiwitten bekend om verkeer via Pd, slechts drie PLSs hebben gemeld tot op heden, allemaal van endogene plantaardige eiwitten. Dus, is het belangrijk een betrouwbare en systematische experimentele strategie ter identificatie van een functioneel PLS-reeks, die zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting, direct in de woonkamer te ontwikkelen plantaardige cellen. Hier beschrijven we een dergelijke strategie als een paradigma met behulp van de cel-naar-cel verkeer proteïne (MP) van de tabak mosaic virus (TMV). Deze experimenten, die geïdentificeerd en gekenmerkt de eerste plant virale PLS, kunnen worden aangepast voor de ontdekking van PLS sequenties in meest Pd-gerichte eiwitten.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungeren als leidingen voor intercellulaire vervoer van belangrijke regelgevende instanties van de ontwikkeling van planten en voedselproductie, variërend van transcriptiefactoren tot mRNA en kleine molecules van RNA. Bovendien, deze macromoleculaire transportcapaciteit van Pd wordt gebruikt door de meeste plantenvirussen voor hun intercellulaire verspreiding tijdens infectie; Als u wilt verplaatsen door middel van Pd, geëvolueerd plantenvirussen gespecialiseerde eiwitten, genoemd verkeer eiwitten (MPs), die specifiek gericht zijn op Pd^1,2,3,

Protocol

1. de plantmateriaal

1. Keuze van plantensoorten
2. Gebruik de plantensoorten afkomstig uit de proteïne van belang, dat wil zeggen, één die codeert dit eiwit voor endogene eiwitten of waarmee de natuurlijke gastheer voor het pathogene agens voor virale eiwitten. Bovendien moet de geselecteerde plantensoorten vatbaar voor de gekozen methode van voorbijgaande genetische transformatie.
   Opmerking: De studies routinematig dienst Nicotiana benthamiana, die vertegenwoordigt een goede gastheer voor TMV en efficiënt wordt omgezet door de genetische transformatie Agrobacterium-gemedieerde techniek, dat wil zeggen, agroinfiltration (zi....

Results

De representatieve gegevens, die getrouw illustreren de verwachte resultaten van de beschreven protocollen en de TMV MP PLS te identificeren, zijn aangepast van Yuan et al. ²¹. figuur 1A eerste geeft een overzicht van belangrijke constructies uiten de full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestaande uit de eerste 50 aminozuurresidu's van het eiwit, 1-50), en haar alanine scannen V4A derivaten gesmolten GVB (gegenereerd als beschreven in s.......

Discussion

Dit protocol heeft vier kern bestanddelen: het concept van de identificatie van een reeks die noodzakelijk en voldoende voor targeting te Pd, systematische indeling van de proteïne van belang in fragmenten worden geleidelijk verlaagd in lengte, smelten de geteste fragmenten aan een autofluorescent eiwit, die fungeert als label én als macromoleculaire lading, en/of functionele assay voor Pd targeting in levende planten weefsels na voorbijgaande expressie van de geteste fusie-eiwitten. Merk op dat Agrobacterium-gemedieerde.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss	LSM5	Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging	Zeiss	2009 version	The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Syringes without needles	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A0166