Methodenartikel

Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ongelijke verlies drager van microtiterplaten beïnvloedt de reproduceerbaarheid van uniforme multicellulaire bolvormige tumoren ontstaan. Verbetering kweekomstandigheden aanzienlijk medium verlies zal de reproduceerbaarheid van sferoïde vorming en de resultaten van sferoïde-gebaseerde testen met de vloeistof-overlay techniek te verbeteren verminderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumormodellen die nauw nabootsen in vivo omstandigheden worden steeds populairder in geneesmiddelen en ontwikkeling voor de screening van potentiële geneesmiddelen tegen kanker. Meercellige bolvormige tumoren (MCTSes) effectief te bootsen de fysiologische omstandigheden van solide tumoren, waardoor ze uitstekend in vitro modellen voor lead optimalisatie en target validatie. Van de verschillende technieken beschikbaar voor het MCTS cultuur, de vloeistof-overlay methode op agarose is een van de meest goedkope werkwijzen voor MCTS genereren. Echter, de betrouwbare overdracht van MCTS culturen die vloeibare-overlay voor high-throughput screening worden beïnvloed door een aantal beperkingen, waaronder de bekleding van microtiterplaten (MPs) met agarose en irreproducibility uniforme MCTS formatie in putten. MPs significant gevoelig voor effecten die resulteren uit overmatige verdamping van medium vanaf de buitenzijde van de plaatrand, die het gebruik van de gehele dienblad drugproeven. Dit manuscript bevat gedetailleerde technische verbeteringen aan de vloeistof-overlay techniek om de schaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS vorming verhogen. Daarnaast, details op een eenvoudige, semi-automatische en universeel toepasbare software tool voor de evaluatie van MCTS beschikt na de behandeling met geneesmiddelen wordt gepresenteerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kankercellen in tumoren fysiologisch gerangschikt in een complex, 3-dimensionale (3D) structuur omgeven door extracellulaire matrix en interagerende cellen. Daar bijna alle cellen in weefsels in een 3D-omgeving bevinden, is de behoefte aan meer fysiologisch relevante in vitro tumormodellen die tumor eigenschappen nabootsen geleid tot de ontwikkeling van verschillende 3D kweektechnieken 1, 2, 3. Deze modellen worden nu fundamenteel onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de rol van de tumor micro op metastase en celrespons op therapeutica 3D 2. Bovendien, in vergelijking met 2-dimensionale (2D) celculturen 4, 3D apparaten kan een beter begrip van tumor-stroma interacties, welke cel signaalroutes beïnvloeden.

Multicellulaire bolvormige tumoren (MCTSes) kankercellijnen worden vaak gebruikt in 3D cel cultuur modellen als gevolg van hun relatieve nabijheid van in vivo tumoren. Van de verschillende technieken gebruikt, is de vloeistof-overlaytechniek (LOT) MCT generatie on-agarose gecoate platen significant belang voor lead optimalisatie en targetvalidatie 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 bereikt. Dit blijkt uit de recente studies die met succes kunnen pilot-schermen van collecties van chemische moleculen draaien in MCTS culturen met behulp van LOT 6, 7 waren. Echter, well-to-well variabiliteit in MCTS morfologie en groei als gevolg van de verdamping veroorzaakte ongelijke verlies van het medium komen vaak hindernissen die de LOT met behulp van microtiterplaten (MPS) te begeleiden. Bijgevolg is de vorming van niet-uniforme MCTSes compromitteert de betekenis en relevantiegegevens van farmacologische assays 8, 12, 13. Naast de reproduceerbaarheid kwesties ander praktisch probleem dat LOT-based high-throughput assays beïnvloedt is de bekleding van de MPs met agarose bij automatische vloeibare toedieningseenheden. Hoewel de afgifte-eenheid verwarmd tot de gelering agarose voorkomen kan worden gehouden, het verstoppen van de afgifte cassette leidingen is een potentiële zorg voor robotsystemen 6.

Om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, hebben we onlangs bedacht een paar wijzigingen in de LOT voor MCTS cultuur 8. Deze wijzigingen zijn voornamelijk gebaseerd op de mogelijkheden om ongelijke medium verlies van MPs gebruiken instrumenten die gewoonlijk worden aangetroffen in screeningslaboratoria high-throughput voorkomen. Een gedetailleerde procedure van de gewijzigde LOT voor het genereren van uniforme grootte en reproduceerbare MCTSes over 384-well platen (WP) wordt hier gepresenteerd. Het manuscript geeft een semi-automatische routine voor de evaluatie van MCTS grootte, met name in gedeeltelijk gedesintegreerde, geneesmiddelbehandelde MCTSes dat geen duidelijke begrenzing voor het meten van de doorsnede hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van agarose gecoate platen

  1. Weeg 0,75 g laag-smeltpunt agarose toevoegen aan 100 ml McCoy's 5A medium (met of zonder fenolrood) zonder serum. Verwarm de oplossing in een magnetron en schud elke 1-2 min de agarose volledig op te lossen. Autoclaaf de oplossing te steriliseren.
  2. Koel het agarose autoclaaf tot ongeveer 70 ° C en filtreer het door een 500 mL, 0,22 urn filter top door vacuumfiltratie in een laminaire stroming in. Aliquot de 0,75% gefilterde agarose-oplossing (FAS) in kleinere hoeveelheden, zo niet in een keer met behulp van de gehele oplossing. Bewaar deze kant-en-klare agarose oplossing aseptisch in een koude kamer of 4 ° C koelkast gedurende maximaal 4 weken.
  3. Bevestig een buisje met een kunststof- of metalen top afgeven cassette een Combi reagens dispenser en vul de cassette met 70% ethanol (EtOH) en vervolgens met steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een stroom vak.
  4. Voor gebruik warmte een opgeslagen hoeveelheid van FAS i n de magnetron om het te smelten. Prime de verstrekking cassette met agarose-oplossing en jas 384-wells, weefselkweek (TC) -behandeld "speciale" microplaten met 15 pi van FAS. Laat de agarose in de plaat afkoelen 15-20 min voor het zaaien van de cellen. Bewaar de agarose-gecoate platen aseptisch, verpakt in een polyethyleen zak in een koude kamer of bij 4 ° C en uit de buurt van direct licht.
    OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk verwarmen van de 0,75% FAS een verandering in de concentratie van agarose in de voorraadoplossing voorkomen. -Agarose gecoate plaatjes kunnen worden bewaard gedurende maximaal 2 weken bij opslag onder de bovengenoemde omstandigheden. De FAS geen verhitting nodig heeft tijdens het bekleden van platen.
  5. Maak de verstrekking cassette door priming met 70-80 ° C steriel water om alle resterende agarose in de cassette tips en buizen te verwijderen.

2. Cel Cultuur en MCTS Formation

  1. Cultuur HCT116 humane colorectaal carcinoom cellen, zoals eerder beschrevenlass = "xref"> 8.
  2. Verwijder het vereiste aantal-agarose gecoate, 384 putjes, TC-behandelde microplaten van koel- en evenwicht ze op kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min.
  3. Bereid de Combi reagens dispenser voor cel zaaien door priming een standaard buis doseren cassette met 70% EtOH en steriel PBS. Stel het zaaien volume op het vereiste pi en de afgifte snelheid tot medium met behulp van de handmatige instelling knoppen op de dispenser.
    OPMERKING: De gehele cel enten wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire stroming in.
  4. Distantiëren hechtende cellen uit de weefselkweek kolf met een recombinante cel-dissociatie enzym. Wordt celsuspensie voorraad in een steriele beker met zaad cellen bij een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / mL per putje in 50 ul volledig groeimedium. Tijdens zenden meerdere 384-WP, roer de cellen met behulp van een magnetische roerder om te voorkomen dat zich afzet op de bodem van het bekerglas.
  5. laat deplaten rusten 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer 15 minuten bij 4 x g.
  6. Ondertussen neemt de verdamping reducerende milieu af en giet het met 8 ml steriel H2O of 5% dimethylsulfoxide (DMSO) bij de korte zijden (links en rechts) met een 5 ml pipet (figuur 1A). Eerst afzien 4 ml vulvloeistof in de linker goot opvegen de pipetpunt langzaam op en neer. Herhaal deze stap met de rechter-side trog.
    OPMERKING: Zorg dat de vloeistof toegevoegd aan de zijkant troggen niet samen te voegen in het midden van het deksel, en laat een gat voor de gasuitwisseling (Figuur 1A). Toevoegen van een overmaat H 2 O leidt tot lekkage van H2O aan de buitenkant van het deksel en vervolgens in de buitenste putjes van de 384-well platen TC.
  7. Vul het vloeistofreservoir van de 384-well TC plaat met steriel H2O en vervang regelmatig plaat deksels met vloeistof gevulde milieu deksels (Figuur 2A).
  8. Plaats de platen in een 37 ° C roterende incubator met 95% vochtigheid, 5% CO2 en 20% O2, en laat de cellen te aggregeren tot MCTSes gedurende 4 dagen. Vermijd openen van de incubator deur te lang in de daaropvolgende dagen om te voorkomen dat de luchtvochtigheid abrupt daalt.

3. Medium Exchange Met behulp van een robotsysteem

  1. Op dag 4 na MCTS vorming, voeg 30 ul van voorverwarmde medium per putje onder toepassing van een geautomatiseerde microplaat ring dispenser. Laat de MCTSes om te groeien voor een extra 3 dagen. Vervang het medium regelmatig elke 3 dagen totdat de gewenste grootte bereiken voor experimenten.
  2. Om een bepaald volume van het medium uit elk aspireren goed, empirisch passen de z -Hoogte van de wasmachine spruitstuk. Verzamelbak 30 ul van medium per putje en vervangen door 30 pi van verse, voorverwarmde medium.
    LET OP: Stel de afgifte snelheid en de snelheid waarmee de wasmachine spruitstuk reistin putten tegen het laagste tarief turbulentie in de putten te minimaliseren.

4. High-gehalte beeldvorming van MCTS en Semi-automatische beeldanalyse

  1. Beeld de MCTS in een high content geautomatiseerd beeldvormingssysteem met een 4X doelstelling lucht (NA 16).
  2. Stel de belichtingstijd tot 11 ms en de binning tot 4 x 4. Pas het aantal en de spreiding van de z -stacks en de pixel binning zoals gewenst voor het experiment om een hele MCTS per goed vast te leggen.
  3. Verwerk de beelden stapsgewijs, zoals beschreven in het "readme," met een eigen routine geschreven programmeertaal.
    LET OP: De .m code en .txt readme-bestanden zijn beschikbaar als aanvullende code-bestanden (Figuur 1B). De routine meet de MCTS gebied, grote en kleine assen, perimeter, en stevigheid van de 2D-beelden.

figure-protocol-1
Figuur 1:Bereiding van milieu deksels en een stroomdiagram van de halfautomatische routine. (A) Afbeelding van een verdamping verminderen milieu deksel gevuld met de juiste (links) en een overmaat (rechts) hoeveelheid van het vullen van vloeistof (hier, 5% DMSO). De pijl geeft de kopse goot voor het toevoegen van vloeistof. De asterisk geeft het gat in het midden van het deksel na de toevoeging van de juiste hoeveelheid DMSO. (B) Een werkstroom die de stappen van de semi-automatische beeldanalyse routine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ongelijke verlies van medium, in het bijzonder van de perifere putjes, is een veel voorkomende probleem in Kamerleden met kleine cultuur volumes. Substantieel verbeterde kweekomstandigheden, zoals incubatoren met goed gecontroleerde temperatuur / bevochtigingsystemen en verdamping verminderen MPs en plaat deksels, verminderen significant verlies drager in putjes 8. De relatieve verdamping te meten, gelijke volumes Orange G (OG) werden aan elk putje toegevoegd e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coating 384-Well TC Platen met Filtered Agarose

De gangbare praktijk in LOT is een 1-1,5% laag smeltpunt agarose gebruiken om de vacht van de platen, die de agarose en / of apotheekhoudend apparaat heeft verwarmd te worden gehouden aan de geleren van de agarose 6 te voorkomen. Het geleren van de agarose is potentieel problematische tijdens het bereiden van meerdere platen met vloeibare afgeven cassettes met slangetjes openingen variërend tussen 0,2 en 0,4 mm in diameter....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Tsjechische ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport (LO1304) en de technologische Agentschap van de Tsjechische Republiek (TE01020028). De auteurs willen graag bedanken Dr. Lakshman Varanasi voor het nemen van de foto's van milieu-deksels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseSigma-AldrichA9414Low-melting
McCOY's 5A MediumSigma-AldrichM8403
“rapid” Filtermax filterTPP995050.22 μm, 500 mL
Multidrop™ Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific5840300
Small Tube Dispensing cassette Thermo Fisher Scientific24073295Metal tip 
384-well TC plate PerkinElmer6057308Plate type- CellCarrier
Standard Tube Dispensing CassetteThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Environmental LidLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
Rotary Incubator (SteriStore )HighRes Biosolutions23641Serienummer: D00384
Microplate Washer Dispenser BioTekOngespecificeerdModel: EL406 
High-Content Imaging System (CellVoyager )Yokogawa Electric CorporationOngespecificeerdModel: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagentThermo Fisher Scientific12604021Fenol vrij

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Liquid Overlay TechniekVermindering van VerdampingCoaten van MicrotiterplatenBereiding van Agarose oplossingProtocol voor CelzaaienGroeicondities voor Sfero denGeautomatiseerde BeeldanalyseEvaluatie van DrugbehandelingMitigatie van Randeffecten

Gerelateerde artikelen