Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) zijn lang een uitdaging structurele biologen vanwege hun gebrek aan stabiele secundaire structuurelementen. Waterstof deuterium uitwisseling (HDX) gemeten bij snelle tijdschalen is bij uitstek geschikt voor structuren en waterstofbinding netwerken die kort worden bevolkt detecteren, waardoor de karakterisering van voorbijgaande conformeren in natieve ensembles. Koppeling van HDX aan massaspectrometrie biedt een aantal belangrijke voordelen, waaronder een hoge gevoeligheid, lage monster consumptie en geen beperking op eiwit grootte. Deze techniek is sterk gevorderd in de afgelopen tientallen jaren, inclusief de mogelijkheid om HDX etikettering de gaten te houden op de milliseconde tijdschaal. Bovendien, door het opnemen van de HDX werkstroom naar een microfluïdisch platform behuizing een zuur protease microreactor, kunnen wij dynamische eigenschappen lokaliseren peptideniveau. In deze studie tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie (Tresi-MS) gekoppeld aan HDX was gebruikt om een gedetailleerd beeld van de resterende structuur in het tau-eiwit, alsook de conformationele veranderingen geïnduceerd na hyperfosforylering verschaffen.
Inleiding
In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke vooruitgangen geboekt bij de ontwikkeling van analytische technieken ter eiwitstructuur en dynamica 1, 2, 3, 4 meten. Terwijl röntgenkristallografie blijft het principe voor het bepalen van eiwitstructuur worden hoge concentraties van eiwitten nodig en uitgebreide optimalisering vereist diffractie Kristallen produceren. Eiwitten die moeilijk te kristalliseren zijn, zoals membraangeassocieerd en intrinsiek ontvouwen eiwitten zijn klassiek bestudeerd door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) NMR
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Dampen door laserablatie van poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kunnen giftig zijn. Zorg ervoor dat de laser graveur is aangesloten op een werkend ventilatiesysteem. Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen in acht bij het bouwen van de microfluïdische apparaat inclusief het gebruik van technische controles (zuurkast, slijpsel container) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, gezichtsmasker, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen). Het is van groot belang voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) rang reagentia te wenden, met wel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Digestie profielen van natieve en fosfo-tau waren vergelijkbaar, hetgeen een sequentie dekking van 77,1 en 71,7% respectievelijk. Deuterium opnamewaarden van elk peptide werd bepaald door het aanpassen van de waargenomen isotopische verdelingen met de theoretische verdelingen gegenereerd met behulp van een intern ontwikkelde FORTRAN software. De best passende verdelingen worden getoond (Figuur 3a) samen met de bijbehorende deuterium opnamewaarden. Opname kinetische profi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel structurele biologie werkwijzen, zoals röntgen kristallografie en NMR zijn voordelig omdat zij zeer gedetailleerd structuren van eiwitten, deze beelden vaak statisch. De karakterisering van voorbijgaande soorten en zwak gestructureerde domeinen blijft ongrijpbaar wanneer onderzocht door deze conventionele werkwijzen. Daarom, met het oog op dynamische inzichten over dit soort systemen te krijgen is het belangrijk om te werken aan een snelle tijdschalen. We hebben met succes Tresi-HDX-MS toegepast op gedetailleerde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Markus Zweckstetter voor het verstrekken van het pdb-coördinatenbestand voor het 'native' tau-ensemble dat werd voorspeld op basis van zijn NMR-werk, met bijdragende analysetools die werden verstrekt door Dr. Adnan Sljoka. Financiering voor dit werk werd verstrekt door het Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant-programma.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Poly(methyl methacrylate) of PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm |
| Fused Silica Glass Capillaire | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaires | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 | |
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Buizen | IDEX | 1477 1548 | ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standaard Polymeer Buizensnijder | IDEX | A-327 | voor 1/16” en 1/8” OD buizen |
| Micro Statische Menging Tee | IDEX | M-540 | voor 1/16” OD buizen |
| of | |||
| Roestvrijstalen Tee, 0,25 mm Boorgat | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | voor 1/16” OD buizen |
| PEEK Tee voor 1/16” OD Buizen | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Vrouwelijk naar Vrouwelijk Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Tweekleufmoer | IDEX | F-300 | |
| Ferrule voor 1/16” OD Buizen | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Roterend Gereedschap | Dremel | F013010001 | |
| Afsnijdschijven | Jobmate | 1/64” dikte | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscoop | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Solderbout | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Spuiten | Hamilton | 81220 | 500 µL capaciteit |
| Spuitpompjes | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Reagentia | |||
| NHS-geactiveerde Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsine uit Varkensmaagslijmvlies | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuteriumoxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Azijnzuur | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammoniumacetaat | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Natriumfosfaat | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Natriumchloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecuulgewicht Calculator | Versie 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Versie 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Versie 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Versie 1.5.0.4 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Instrumenten | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referenties
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
