Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Samenvatting

De meeste eiwitten werken in associatie met andere; daarom is het van cruciaal belang om deze functionele eenheden te karakteriseren om biologische processen volledig te begrijpen. Afiniteitszuivering gekoppeld aan massaspectrometrie (AP-MS) is de methode bij uitstek geworden voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties. Echter, conventionele AP-MS-studies leveren informatie over eiwitinteracties, maar de organisatorische informatie gaat verloren. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden we een strategie om de verschillende functionele verzamelingen waarin een eiwit betrokken kan zijn te ontrafelen, door affiniteitsgezuiverde eiwitcomplexen te scheiden voorafgaand aan hun karakterisering door massaspectrometrie. Eiwitcomplexen geïsoleerd door affiniteitszuivering van een lokkeiwit met behulp van een epitooptag en competitieve elutie worden gescheiden door blauwe native elektroforese. Vergelijking van eiwitmigratieprofielen door correlatieprofilering met behulp van kwantitatieve massaspectrometrie maakt toewijzing van interacterende eiwitten aan verschillende moleculaire entiteiten mogelijk. Deze methode is in staat om eiwitcomplexen met nauwelijks verschillende molecuulgewichten op te lossen die mogelijk niet worden opgelost door traditionele chromatografische technieken zoals gelfiltratie. Met iets meer werk dan conventionele AP-geLC-MS/MS, tonen we aan dat deze strategie in veel gevallen adequaat kan zijn voor het verkrijgen van topologische informatie over eiwitcomplexen gelijktijdig met het identificeren van eiwitinteracties.

Inleiding

In cellen, meeste eiwitten hun functies door middel van tijdelijke eiwit-eiwitinteracties of door vorming van stabiele verzamelingen van eiwitten. Het karakteriseren van eiwit interacties is van cruciaal belang voor een volledig begrip cellulaire processen. Affiniteitszuivering in combinatie met massaspectrometrie (AP-MS) is een van de meest toegepaste strategieën voor natief eiwit interacties te identificeren. Significante verbeteringen in het instrument mogelijkheden bereikt in de afgelopen tien jaar hebben deze aanpak zeer krachtig gemaakt. Het is belangrijk op te merken dat de interacties die door AP-MS experimenten omvatten een mengsel van directe en indirecte verbindingen tussen aas en prooi. Bovendien vaak eiwitten nemen deel aan verschillende complexen binnen dezelfde cellulaire context, waarin verschillende biologische rollen kunnen hebben, en dus de interactoren die worden geïdentificeerd door AP-MS kan een combinatie van afzonderlijke verzamelingen van eiwitten of functionele entiteiten vertegenwoordigen. Het is niet mogelijk te leidendergelijke topologische informatie voorbaat van het mono-dimensionale lijsten van eiwitten die door eenvoudige AP-MS experimenten. Echter de techniek verder worden benut om de architectuur van eiwitcomplexen definiëren door het te combineren met één of meer methoden om deze samenstellingen te lossen.

Om de topologie van eiwitinteracties geïdentificeerd door middel van AP-MS lossen zijn verschillende strategieën toegepast. Een benadering is om iteratief AP-MS experimenten met de prooien die in een voorgaande ronde van experimenten ¹ lokaas voeren. Hoewel zeer informatief, dit is een heel arbeidsintensieve taak experimenteel en analytisch. Eiwit verknoping in combinatie met massaspectrometrie wordt steeds vaker gebruikt om topologische gegevens over eiwitcomplexen ^{2, 3, 4, 5} af te leiden. Echter, computational analyse van verknoopte peptiden nog steeds een uitdaging en is de bottleneck in de workflow vandaar. De komst van MS-afsplitsbare verknopende reagentia moeten in kaart brengen van de aminozuurresten die in de nabijheid van interagerende eiwitten ^{6, 7} te vergemakkelijken. Een ander alternatief is om affiniteitszuivering te combineren indien orthogonale scheidingstechnieken ^{8, 9.} Chromatografische fractionering door gelfiltratie of ionuitwisseling of sucrosegradiënt fractionering zijn recent ook gebruikt in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie multiproteïnecomplexen beschrijven op systeemniveau-niveau, het omzeilen van het complex isolatiestap ^{10, 11, 12, 13.} Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) is op grote schaal toegepastonderzoeken natief eiwit interacties, kenmerkend die waarbij mitochondriale membraan eiwitcomplexen ^14. Deze scheidingstechniek is onlangs ook gebruikt in combinatie met labelvrije eiwit kwantificering en correlatie profilering, niet alleen op de mitochondriale complexen ^{15, 16, 17,} maar ook voor het ontrafelen andere proteïnecomplexen uit gehele cellen ^{18, 19.} Onze hypothese was dat de combinatie van affiniteitszuivering met aansluitende fractionering natieve benaderingen en kwantitatieve MS een bruikbare strategie voor het oplossen van meerdere verzamelingen van eiwitten die een bepaald eiwit moet bieden.

Hier beschrijven we een werkwijze die algemeen epitoop gebaseerde affiniteitszuivering met blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese van de geïsoleerde complexen gecombineerd, gevolgd door kwantitatieve massa spectrometry en eiwit correlatie profilering, de meerdere vergaderingen een eiwit zou kunnen worden betrokken bij het op te lossen. We maken gebruik van embryonale stamcellen van muizen waarbij een eiwit van belang gefuseerd aan een epitooplabel wordt uitgedrukt van de endogene locus in de buurt van fysiologische overvloed te bereiken en te zorgen voor een efficiënte inheemse complex isolement. Deze benadering ontrafelt de meervoudige interacties een eiwit grijpt in, het oplossen van hen in verschillende samenstellingen op basis van hun correlatie profielen, terwijl die niet werken dan conventionele geLC ^MS-20.

Protocol

1. Isolatie van natuurlijke eiwit complexen door FLAG Affinity Purification

1. Voorbereidende werkzaamheden
   1. Het opzetten van een 37 ° C waterbad ontdooien van de celpellet.
   2. Afkoelen een microcentrifuge bij 4 ° C.
   3. Door diverse microcentrifugebuizen van verschillende grootte (1,5 ml, 15 ml) en een homogenisator in ijs.
   4. Bereid 10 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) en bewaar in ijs. Juist voor het gebruik van de buffer, voeg 10 ul van 1 M DTT en gemalen tablet EDTA-vrije proteaseremmers.
2. Bereiding van antilichaam-gekoppelde bolletjes
   LET OP: De antilichaam beklede parels kunnen worden bereid zijn om een ​​week op voorhand en bewaard in de koelkast totdat het nodig is. Proteïne G een hogere affiniteit dan proteïne A voor de meeste soorten subtypes immunoglobuline, behalve konijnen-IgG, waarbij proteïne A heeft een hogere affiniteit.
   1. Was 50 pl Proteïne G-beklede magnetische korrels: Breng 50 &# 956; l kraal suspensie tot een microcentrifugebuis Plaats de buis in de magneet om de bolletjes te verzamelen over de zijkant van de buis en verwijder de vloeistof. Resuspendeer de korrels in 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
   2. Plaats de buis in de magneet om de bolletjes te verzamelen over de zijkant van de buis en verwijder de vloeistof. Resuspendeer de kralen in 40 ul PBS-0,01% Tween-20. Voeg 10 g (10 pl 1 mg / ml voorraadoplossing) van M2 anti-FLAG antilichaam. Incubeer met rotatie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   3. Plaats de buis in de magneet om de bolletjes te verzamelen over de zijkant van de buis en verwijder de vloeistof. Was de kralen met 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
   4. Voor het verknopen van het antilichaam aan de beads, was de parels tweemaal met 1 ml 0,2 M triethanolamine pH 8,2. Vervolgens, resuspendeer de kralen in 1 ml 20 mM DMP (dimethylpimelimidaat) in 0,2 M triethanolamine pH 8,2 (DMP verse oplossing onmiddellijk voor gebruik worden bereid). Incubeer met rotatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   5. Plaats de buis in de magneet. Verwijder het supernatant en resuspendeer de korrels in 0,5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Incubeer met rotatie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   6. Was de korrels 3 keer met 0,5 ml PBS-0,1% Tween-20. Laat kralen in de laatste wasbeurt totdat het nodig is.
3. FLAG-gebaseerde affiniteitszuivering
   LET OP: Wees voorzichtig bij het niet het verlaten van de parels zonder buffer voor een lange periode van tijd. Alle buffers en pijpen moeten in ijs gehouden te allen tijde. Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van eiwitcomplexen 2-5 x 10 ⁸ cellen (10-20 mg eiwitlysaat) tot expressie endogene niveaus van een FLAG-gemerkt eiwit ^20.
   1. Ontdooi de celpellet in een waterbad bij 37 ° C tot het begint te smelten. Neem de buis uit het bad, draai hem zachtjes totdat de pellet volledig ontdooid en onmiddellijk het buis met de celsuspensie op ijs.
   2. Voeg 5 ml ijskoude lysisbuffer(Met DTT en proteaseremmers) aan de celsuspensie en de werveling te mengen. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
   3. Breng de lysaat aan een koude Dounce homogenisator. Lyse met 20-30 slagen met behulp van de krappe stamper (totdat er geen merkbare viscositeit). Breng de homogenaat koude microcentrifugebuizen.
   4. Centrifugeer bij 18.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
   5. Breng de geklaarde lysaat om een ​​schone koude buis. Reactie 50 pl lysaat achteren. Neem een ​​35 pi aliquot lysaat eiwitconcentratie te meten en bewaken van de reiniging.
   6. Verwijder de PBS-0,1% Tween-20 van de parels. Resuspendeer de kralen met 1 ml van het lysaat en mengen met de rest van het lysaat. Incubeer het mengsel in een roterend wiel bij 4 ° C gedurende 1-2 uur.
   7. Verzamel de kralen aan de zijkant van de buis met de magneet. Verzamel een 30 pi aliquot van het supernatans en gooi de rest van de supernatant. Resuspendeer de korrels in 0,5 ml IPP150 buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) door pipetteren 4-6 keer. Verwijzing naar een 1,5 ml koude buis.
   8. Herhaal de wassingen met 0,5 mL buffer IPP150 twee keer.
   9. Was kralen drie maal met 0,5 ml FLAG natief elutiebuffer (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminocapronzuur). Met de laatste wasbeurt, overdracht van de kralen aan een nieuwe koude buis. Verwijder buffer grondig.
   10. Resuspendeer de kralen in 100 pl 200 ng / ml 3x FLAG peptide in natieve elutiebuffer. Incubeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten onder rustig roteren.
   11. Verzamel de kralen met de magneet en breng de supernatant aan een koude nieuwe buis.
   12. Herhaal stap 1.3.10-1.3.11 tweemaal. Pool alle eluaten.
   13. Concentreer het eluaat tot 25 uL in een centrifugale filtereenheid (10 kDa nominaal molecuulgewicht cut-off limit, PES) door centrifugeren bij 10.000 xg bij 4 ° C. Breng het geconcentreerde eluaat om een ​​nieuwe koude buis en voeg 50% glyceRol voor een eindconcentratie van 5%. Het geconcentreerde eluaat bij 4 ° C overnacht worden bewaard indien nodig.

2. Blue inheemse PAGE

1. Voorbereidende werkzaamheden
   1. Bereid 1 liter 1x inheemse PAGE Anode Buffer, 1x inheemse PAGE Dark Blue Cathode Buffer en 1x inheemse PAGE Lichtblauw Cathode Buffer.
   2. Verwijder de kam van een vooraf gegoten 3-12% natieve PAGE gel en spoel de putjes tweemaal met 1x natieve PAGE donkerblauw Kathode buffer. Vul de putten met 1x inheemse PAGE Dark Blue Cathode Buffer. Stel de gel in de lopende tank maar niet donkerblauwe Cathode Buffer naar de kathode (binnen) Chamber.
2. elektroforetische run
   1. Bereid het monster: Om de 25 pl geconcentreerde eluaat geschikt volume van 4x natieve monster beladingsbuffer en 0,5% G-250 sample toevoegsel voor eindconcentraties van 1 x en 0,005% respectievelijk.
   2. Laad het monster en inheemse moleculairgewichtmerkers het verlaten van een lege put between hen. Load 10-20 pl 1x natieve monster beladingsbuffer in alle lege putjes.
   3. Vult de kathode (binnen) kamer met 200 ml 1x natieve PAGE donkerblauw Kathode buffer voorzichtig om te voorkomen dat de monsters te verstoren. Vul het anode (buiten) kamer met 550 ml 1x natieve PAGE Anode Buffer.
   4. Voer de elektroforese bij 150 V gedurende 30 minuten. Stop de run, verwijder de Dark Blue Cathode Buffer met een serologische pipet en vervang met 1x Light Blue Cathode Buffer. Ga door met de run voor 60 min. De gel kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij 4 ° C; de gemeten temperatuur een effect op eiwit complexe structuur.
3. gel kleuring
   1. Open de gel cassette en gooi een van de cassette platen. De gel blijft tot overige cassette plaat bevestigd. Breng de gel in een lade of bak met voldoende fixatief (40% methanol, 2% azijnzuur) om de gel te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten onder zacht schudden.
   2. Verwijder het fixeermiddel solution en voeg voldoende water om de gel te bedekken. De gel kan worden gescand voor toekomstig gebruik.

3. Massaspectrometrie analyse

Opmerking: Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap zo mogelijk zuiverheid van de monsters te verzekeren. Alle oplossingen moeten worden bereid met HPLC-grade water. Bespreken protocol met massaspectrometrie laboratorium dat de analyse uitvoert.

1. Voorbereidende werkzaamheden
   1. Plaats een conische bodem 96-well plaat bovenop een andere plaat met 96 putjes om het afval te verzamelen. Doorboren de bodem van de putjes van de conische bodem 96-wells plaat met een 21 G naald.
   2. Was de putjes van de doorboorde plaat met 96 putjes.
      1. Voeg 200 ul van 50% acetonitril-0,25% mierenzuur aan de putjes van de doorboorde plaat. Incubeer de plaat stapel in een schudder gedurende 10 min.
      2. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 1 minuut, zodat de vloeistof door de gaten in de afvalinzameling plaat. Gooi de waste vloeistof.
      3. Herhaal stap 3.1.2.1-3.1.2.2 twee keer.
      4. Vult de putjes van de doorboorde plaat met 96 putjes met 150 ui 50 mM ammoniumbicarbonaat (vers).
   3. Was de putjes van een centrifugale filtratie met 96 putjes.
      1. Plaats een normale 96 putjes onder centrifugale filtratieplaat om het afval te verzamelen. Voeg 200 ul van 50% acetonitril-0,25% mierenzuur aan elk putje van de centrifugale filtratieplaat.
      2. Centrifugeer de platenstapel bij 200 xg gedurende 1 minuut. Gooi het afval.
      3. Herhaal stap 3.1.3.1-3.1.3.2 twee keer.
2. Geluitsnijding en in-gel digestie
   OPMERKING: Terwijl het uitsnijden van het gel, identificeren en noteer de gel slice afgestemd op elk van de eiwit-normen. Het eiwit standaards kunnen worden toegepast om benaderde molecuulgewichten schatten voor gelplakken.
   1. Plaats de gel met de glasplaat op een schoon oppervlak. Snijd de baan bevattening monster in 48 gelijke segmenten (1,5 mm x 5 mm). Snijd elk sneetje in 2-3 kleinere stukken (behalve de laatste vijf plakken aan de bovenkant van de gel) en leg elke plak achtereenvolgens in een putje van de doorboorde en gewassen met 96 putjes.
   2. Voeg 50 ul acetonitril aan elk putje. Incubeer de plaat onder schudden gedurende 30-60 min. Verwijder de vloeistof door centrifugeren zoals in stap 3.1.2.2.
   3. Voeg 200 ul van 2 mM TCEP in 50 mM ammoniumbicarbonaat aan elk putje. Incubeer de plaat onder schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de vloeistof door centrifugeren zoals in stap 3.1.2.2.
   4. Voeg 200 ul van 4 mM joodacetamide in 50 mM ammoniumbicarbonaat aan elk putje. Incubeer de plaat onder schudden gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker. Verwijder de vloeistof door centrifugeren zoals in stap 3.1.2.2.
   5. Voeg 150 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat plus 50 ul acetonitril en incubeer de plaat onder schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Herhaal deze wasstap eenTussen vaak als nodig is totdat de blauwe kleur van de gelstukken verwijderd.
   6. Dehydrateer de gelstukken door toevoeging van 200 pi zuivere acetonitril en incubeer onder schudden bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat de gel stukken zijn wit en ondoorzichtig. Acetonitril te verwijderen.
   7. Voeg 150 ul van 0,001 mg / ml trypsine (sequencing kwaliteit) in koude 50 mM ammoniumbicarbonaat aan elk putje. Incubeer de plaat onder schudden bij 37 ° C gedurende 2 uur. Na 1 h, controleer dat de gel stukken zijn bedekt met vloeistof; indien dit niet het geval is, voeg nog 50-100 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat. Na 2 uur bij 37 ° C, blijft de digestie op 25 ° C overnacht.
   8. Plaats een schone conische bodemplaat onder de gel bevattende plaat, de correcte oriëntatie van de platen. Verzamel de vloeistof die de peptiden door middel van centrifugatie bij 200 xg gedurende 1 minuut.
   9. Plaats de peptiden bevattende plaat in een centrifugale verdamper verdampt en de vloeistof tijdens de uitvoering thij volgende stap.
   10. Voeg 150 ul van 50% acetonitril-0,25% mierenzuur aan de gelstukken. Incubeer onder schudden bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
   11. Het verzamelen van de vloeistof in de gedeeltelijk gedroogde plaat uit stap 3.2.9 door centrifugatie bij 200 xg gedurende 1 minuut. Verder verdampen van de peptiden bevattende plaat tijdens het uitvoeren van de volgende stap.
   12. Herhaal stap 3.2.10-3.2.11.
   13. Voeg 200 ul van pure acetonitril aan elk putje van de plaat met de gelstukken. Incubeer onder schudden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   14. Verzamel de vloeistof in de peptiden bevattende plaat door centrifugatie bij 200 xg gedurende 1 minuut.
   15. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van acetonitril in alle putjes boven 55%. Indien nodig, voeg extra pure acetonitril.
   16. Breng de peptideoplossingen aan de gewassen centrifugaalfiltratie plaat. Plaats een schone conische bodemplaat eronder om de peptiden te verzamelen. Centrifugeer de platenstapel bij 200 xg gedurende 1 minuut.
   17. Evaporat de vloeistof in de conische bodemplaat totdat wells volkomen droog zijn. De plaat kan worden bedekt met een siliconen deksel en bewaard bij -20 ° C in dit stadium.
   18. Opnieuw oplossen peptiden in 32 pl 0,5% mierenzuur onder krachtig schudden gedurende 15 minuten. Voeg 8 pi 400 mM ammoniumbicarbonaat en incubeer onder krachtig schudden gedurende 15 minuten. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 1 minuut. Dek af met een siliconen deksel en bewaar de plaat bij -20 ° C totdat massaspectrometrieanalyse.
3. Massaspectrometrie
   OPMERKING: Analyseer peptiden op een hoge resolutie massaspectrometer met behulp van die verenigbaar zijn met shotgun proteomics. De gegevens afhankelijke overname is de meest gebruikte LC-tandem MS set-up voor dit type van analyse en dient te worden geoptimaliseerd voor efficiënte peptide identificatie, het minimaliseren van redundante sequencing en kandidaat-selectie op achtergrondgeluiden. Massaspectra in de eerste trap massa-analyse scan (MS1) worden geregistreerd in profielmodus. Het is aan te bevelened met voorkeur selecteren dubbel en drievoudig geladen ionen voor de tweede trap massa-analyse (MS2). Een massagebied m / z 400-1,600 is geschikt voor de meeste peptiden te identificeren tussen 8-30 aminozuren bereik. Hier wordt een protocol voor analyse met behulp van een Orbitrap massaspectrometer voorzien.
   1. Injecteer 20 uL monster per analyse met behulp van autosampler van nanoLC-MS / MS-systeem. Ontzouten en concentreren peptiden op een omgekeerde fase C18-kolom (100 urn id, 2 cm).
   2. Afzonderlijke peptiden op een analytische C18 kolom (75 urn id 15 cm) met een 30 min lineaire gradiënt van 4-28% acetonitril / 0,1% mierenzuur bij 300 nL / min.
   3. Analyseren peptiden in een massaspectrometer met een top 10 gegevensafhankelijke Werkwijze verkrijgen met de volgende parameters: m / z bereik 380-1,600, resolutie 30.000 bij m / z 400, isolatie breedte van 2 Th, dynamische uitsluiting op ± 10 ppm gedurende 45 s automatische versterkingsregeling doel met 1 x 10 ⁶ voor MS en 5000 MS / MS, maximale injectietijd van 150 ms voor MS en100 ms voor MS / MS.

4. Data Analysis

1. Eiwit identificatie en kwantificatie met behulp van MaxQuant
   1. Met de vrij beschikbare MaxQuant software om eiwitten te identificeren en kwantificeren elk gelfractie van massaspectrometrie ruwe data.
      OPMERKING: MaxQuant werkt op gegevens die zijn gegenereerd door middel van data-afhankelijke acquisitie shotgun proteomics benaderingen. De MS-gegevens uit de blauwe natieve gel fracties worden geanalyseerd batch afzonderlijke experimenten en niet als fracties van een experiment waarin alle gelplakken. Controleer de iBAQ waarde vak stoichiometrie berekeningen uit te voeren. Gedetailleerde protocollen voor databankonderzoek en eiwitten kwantificering middels MaxQuant zijn beschreven in ^{21, 22.}
2. Eiwit profiel analyse met behulp van Perseus
   1. Gebruik de vrij beschikbare software Perseus om de migratie profielen van de geïdentificeerde eiwitten zien en vergelijken ze met behulp vanstatistische analyse.
      OPMERKING: Algemene documentatie over hoe Perseus gebruiken is beschikbaar op http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Een voorbeelddataset beschikbaar als aanvullende gegevens.
   2. Upload het bestand proteingroups.txt geretourneerd door de MaxQuant analyse die het eiwit identificatie en kwantificering waarden voor alle fracties gel. Bevolken intensiteiten in de Main (Afbeelding 1). Een matrix weergegeven die alle eiwitidentificaties in rijen, met de gel fracties als kolommen.
   3. Vermeldingen bij treffers keren eiwitten alleen geïdentificeerd door plaatsspecifieke potentiële verontreinigingen door het selecteren Filter rijen basis van categorische kolom in het filter rijen dropdown menu (figuur 2) te verwijderen.
   4. Normaliseren van de fractie-intensiteiten van elk eiwit in het profiel tegen de totale eiwitten intensiteit door het selecteren verdeel in het rolmenu normaliseren, dan Sum (figuur 3). Een nieuwe matrix verschijnt.
   5. Toon de migratie profiel percelen van alle eiwitten die door het selecteren van Profile Plot in het menu Visualisatie dropdown (Figuur 4).
   6. Selecteer Filter rijen op basis van geldige waarden in de Filter rijen dropdown menu. Voer 1 in het aantal geldige waarden vereist.
   7. Voer hiërarchische clustering van geïdentificeerde eiwitten in alle blauwe inheemse gel fracties door het selecteren van hiërarchische clustering in de clustering / PCA dropdown menu. Verwijder het Columns (Afbeelding 5). De clusters worden gevisualiseerd in een warmte-kaart in de tab Clustering naast de matrix (Figuur 6).
   8. Plaats de cluster met het aas eiwit in het dendrogram. Andere componenten van de cluster vertegenwoordigen eiwitten co-migreert met het aas en dus potentiële interagerende eiwitten / subeenheden van hetzelfde.

r /> Figuur 1. Screenshot Perseus data uploadvenster. De figuur toont de stappen voor het vullen eiwit identificatie en kwantificering gegevens in Perseus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Screenshot van Perseus venster voor het filteren van data corresponderend met verontreinigingen, omgekeerde klappen en eiwitten geïdentificeerd door plaats. Selecteren Filter rijen door categorische kolom opent een nieuw venster voor het selecteren van de soorten eiwitten items die moeten worden verwijderd uit de dataset. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

/55498fig3.jpg"/>
Figuur 3. Screenshot Perseus normalisatie venster. Divide is geselecteerd in het menu Normalisatie opent een nieuw venster, met verschillende opties. Selecteren Sum deelt de intensiteitswaarde van een eiwit in elke fractie van de totale intensiteit van dat eiwit in alle fracties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Screenshot van Perseus tonen migratieprofiel plots. Eiwitten kunnen worden geselecteerd in de matrix onder de profielen in hun overeenkomstige profiel markeren. De werkbalk kan worden gebruikt om de profielen bewerken en exporteren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Screenshot van Perseus hiërarchische clustering venster. De figuur toont de instellingen voor hiërarchische clustering van eiwitten met behulp Manhattan (L1) afstandsmetriek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Screenshot van Perseus tonen dendrogram en eiwitten intensiteiten temperatuurkaart. De werkstroom aan de rechterkant van het hoofdpaneel toont elke stap uitgevoerd en de resulterende matrix en kan worden gebruikt om een ​​stap ongedaan. De workflow kan aftakken tussenliggende matrix. Klik hier om een grotere versie van deze f bekijkenigure.

3. Berekening van relatieve stoichiometrie
   1. Selecteer de subeenheden van een eiwitcomplex op basis van hun co-clustering met het aas eiwit en af ​​te bakenen het profiel piek (en) waar ze verschijnen.
   2. Met de iBAQ waarden die door MaxQuant analyse voor elke subeenheid in elke fractie afzonderlijk normaliseren van de overeenkomstige aas iBAQ waarde in dat gedeelte.
   3. Plot de genormaliseerde iBAQs voor aas en eiwitcomplex subeenheden over de fracties van de geselecteerde piek en toe te passen lineaire regressie. Bereken relatieve hoeveelheid complex subunit tot aas door het vergelijken van de trends van hun genormaliseerde iBAQ waarden.
4. Schatting van eiwitcomplex omvang
   1. Met de eiwitstandaarden met voorspelde molecuulgewichten berekenen voor het uitlijnen blauwe natieve gel segmenten van het monster steeg. Hieruit genereert een lineair regressiemodel door het uitzetten gel segmenten in de x-as en molecuulgewichten in de y-as.
   2. Gebruik het model om de waargenomen molecuulgewicht van het eiwit complex (en) op basis van de blauwe inheemse slice (s) van waaruit ze werden geïdentificeerd te schatten.

Resultaten

De werkstroom van de affiniteitszuivering Blue profilering natieve eiwit Correlatie van Mass Spectrometry (ABC-MS) strategie is afgebeeld in figuur 7. Natief eiwitcomplexen om een ​​eiwit van interesse worden geïsoleerd door affiniteitszuivering met gebruikmaking van antilichamen tegen een epitoop-tag (hier FLAG) en competitieve elutie. De complexen worden gescheiden door BN-PAGE, en de gehele gel baan is gesneden in secties 48 en voorbereid voor jachtgeweer LC-MS / MS. MS kwantitatieve informatie wordt gebruikt om een ​​profiel migratie voor elk geïdentificeerd eiwit in de natieve blauwe scheiding genereren. Eiwitten die interageren met een afzonderlijke complexe weergave vergelijkbaar migratieprofielen met elkaar tot pieken. Wanneer een eiwit van belang deelneemt aan meer dan één samenstel worden meerdere pieken waargenomen bij de migratieprofiel Gezien de sub-complexen zijn in het oplossend vermogen van de blauwe natieve gel. Een systematische vergelijking van de migrantsoen profielen kunnen worden verkregen door proteïne correlatie profilering middels hiërarchische clustering. Het dendrogram en piekintensiteiten van alle fracties worden gevisualiseerd in een warmte-kaart, het vergemakkelijken van de identificatie van interagerende eiwitten die tot afzonderlijke eiwitcomplexen (figuur 8).

We gebruikten deze strategie om de interactie partners van MTA2, een kern subunit van het NuRD chromatine remodeling complex ²⁰ te analyseren. Zoals getoond in figuur 9, de migratieprofiel van MTA2 weergegeven twee pieken afzonderlijke intensiteiten tussen 700 kDa en 1,2 MDa, waarbij de onderste massapiek tonen hogere overvloed. Andere NuRD kern subeenheden, waaronder MTA1 / 3, HDAC1 / 2 en Mbd3, vertoonde dezelfde scheidingspatroon, ondanks de pieken voor enkele van de subeenheden, namelijk Chd4, Gatad2a / b en Rbbp4 / 7, had de inverse abundantie verdeling (figuur 9A, B). Daarentegen het profiel van Cdk2ap1, een regulerende factor die de NuRD complex Wnt genpromoters ²³ recruteert alleen getoonde grotere massa piek (figuur 9C), en dus Sall4, een transcriptionele repressor die ook is aangetoond dat NuRD ^{20, 24, 25} binden. Aldus fractionering van affiniteitsgezuiverde MTA2-geassocieerde eiwitten door blauwe natieve PAGE kon twee vormen van het complex NuRD lossen.

ABC-MS maakt ook de identificatie van nieuwe interactoren terwijl ze toe te wijzen aan specifieke eiwit entiteiten. Door onderzoek van de eiwitten clusters en fractie intensiteiten vertegenwoordigd in een warmte-kaart gedetecteerd we een sterke correlatie tussen NuRD subeenheden en Wdr5, een regulerende subunit van het MLL methyltransferase complex ^26, met Wdr5 weergeven van twee migratie pieken samenvallen met de twee NuRD peaks (figuur 8), suggereert een interactie van de Wdr5 en NuRD. We bevestigden deze interactie met co-immunoprecipitatie en co-migratie in grootte-uitsluitingschromatografie ^20.

De keuze van afstandmetriek berekening in de hiërarchische clustering zal de vorm van de clusters en dus de correlaties beïnvloeden. We raden u aan te experimenteren met de verschillende statistieken om de beste pasvorm met de bestaande interactie kennis van het eiwit of complex van belang te bereiken. Over het algemeen behaalden we de beste resultaten met de Manhattan (L1) afstand metrische ^20. Pearson correlatie of Euclidische afstand metrieken zijn ook beschreven voor het identificeren van complexen op basis van alternatieve fractioneringstechnieken ^{10, 11, 12.}

de QuanMS titatieve gegevens uit de blauwe natieve fracties kunnen ook worden gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen bepalen. De iBAQ (intensiteit gebaseerd absolute kwantificatie) -waarde geeft een maat van de relatieve abundantie van de geïdentificeerde eiwitten ^{27, 28.} De iBAQ waarden voor het eiwitcomplex leden van alle fracties binnen migratieprofiel piek genormaliseerd aan die van de aasproteïne om relatieve hoeveelheden te verkrijgen. De genormaliseerde iBAQs over een profiel piek voor een bepaald eiwitcomplex lid moeten horizontale trend te volgen, en de trend waarden weerspiegelen de stoichiometrie van de interacterende eiwitten ten opzichte van het aas eiwit. Voor een meer gedetailleerde weergave van stoichiometrie berekeningen, zie ^20.

Figuur 7: Schematische samenvatting van de workflow ABC-MS strategie. Dit cijfer wordt gewijzigd van ^20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8 hiërarchische clustering van BN-PAGE migratieprofielen MTA2 interactoren. MTA2-geassocieerde eiwitten werden geclusterd op basis van de gelijkenis van hun migratieprofielen. Slechts een deel van de warmte-map van de NuRD complex weergegeven (tussen het blauwe vak). De gele vakje wijst op de sterke correlatie van Wdr5 met de NuRD complex. De geannoteerde molecuulgewichten werden bepaald door migratie afstand van eiwitstandaarden draaien in dezelfde gel. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics ²⁰ van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Mo lecular Biology. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9. BN-PAGE migratieprofiel van NuRD subeenheden en geassocieerde eiwitten. A) MTA2 en NuRD subeenheden aanwezig intensiteiten gelijk patroon. B) MTA2 en NuRD subeenheden met de inverse intensiteitspatroon. C) MTA2 en Cdk2ap1, die slechts aanwezig is in de hogere molecuulgewicht NuRD entiteit. De geannoteerde molecuulgewichten werden geschat op basis van de migratie-profiel van het eiwit normen. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics ²⁰ van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie._blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende gegevens: Sample dataset. MaxQuant afgeleide proteingroups.txt bestand met eiwitidentificaties en kwantificering waarden uit een ABC-MS experiment. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics ²⁰ van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier beschrijven we het gebruik van affiniteitszuivering gevolgd door blauwe natieve gelelektroforese in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie eiwitcomplexen lossen. Deze aanpak biedt een methode om eendimensionale eiwit interactie lijsten te ontrafelen in functionele verzamelingen van eiwitten.

We tonen de methode gebaseerd op het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten. Echter, als een cellijn die een gecodeerde eiwit niet beschikbaar is, kan een alternatief zijn om antilichamen te gebruiken tegen het eiwit van belang, op voorwaarde dat er een peptide beschikbaar voor inheemse concurrerende elutie bereiken. De hoeveelheid uitgangsmateriaal en de hoeveelheid korrels zouden moeten worden aangepast afhankelijk van het expressieniveau van het doeleiwit. Wij doorgaans voeren dit protocol met 2-5 x 10 ⁸ cellen uitgangsmateriaal, en dit is zelfs voldoende voor eiwitten met laag expressieniveau. De lysisbuffer samenstelling dient empirisch worden gekozen verwezenlijkenin de buurt van oplosbaar maken van het aas te voltooien. Dit kan een uitdaging voor sommige soorten van eiwitten, in het bijzonder chromatine binden of membraaneiwitten. Alternatieven omvatten het verhogen van de hoeveelheid zout, mits het eiwitcomplex onderzochte stabiel in hoog zoutgehalte, of via sonificatie en / of nuclease behandeling van chromatine bindende eiwitten ^{20, 29.} Bij membraaneiwitten, schakelen detergens DDM of digitonine kan wenselijk ³⁰ zijn. In het geval van DNA-bindende eiwitten is het nuttig om een nuclease zoals Benzonase tijdens de zuiveringsstap ²⁰ omvatten. Volledige verwijdering van nucleïnezuren garandeert dat de waargenomen wisselwerkingen plaatsvinden tussen eiwitten en niet gemedieerd door DNA.

Een cruciaal element om te overwegen bij het gebruik van deze aanpak is de stabiliteit van het complex in onderzoek. De procedure is lang en kan preservin betrekkeng het eiwitcomplex een nacht. We hebben goede succes met twee chromatine remodeling complexen (D. Bode en M. Pardo, gegevens niet getoond) bereikt, maar dit moet worden geëvalueerd. De affiniteit zuiveringsstap kan worden verkort indien nodig.

Alternatieve technieken die natief fractionering mogelijk, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, zijn op grote schaal gebruikt voor meer dan 50 jaar eiwitcomplexen karakteriseren. Wij en anderen hebben aangetoond dat de resolutie van de blauwe inheemse PAGE is superieur aan die bereikt met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie ^{20, 31, 32, 33.} Een ander voordeel van de blauwe inheemse PAGE is dat het niet-chromatografie-systemen, die duur zijn vereist, maar maakt gebruik van eiwit elektroforese apparatuur die is wijdverbreid in laboratoria. In termen van hands-on tijd, deze methode niet meer werk dan de traditionele geLC-MS / MS een betrekkenAANPAK of offline chromatografische fractionering. Echter, zoals de meeste fractionering technieken te doen, het heeft een limiet aan de oplossing ervan. Complexen die zeer homogene of dicht in de massa en vorm kan zijn dan de resolutie die door de blauwe inheemse PAGE, en dus het protocol zoals hier gemeld misschien niet universeel succesvol in het oplossen van verschillende complexen met gedeelde subeenheden zijn. Bemoedigend, hebben we succesvol geweest in het scheiden van twee zeer vergelijkbare tetramere complexen delen drie subeenheden (M. Pardo, manuscript in voorbereiding).

Aangezien massaspectrometrie steeds gevoeliger is geworden, kunnen zelfs zeer kleine hoeveelheden niet-specifieke interactors en verontreinigingen worden gedetecteerd in AP-MS monsters. De hier gepresenteerde benadering kan helpen bij het onderscheiden van echte interactoren van achtergrond vervuiling in de affiniteitszuivering door richten van de aandacht op eiwitten met migratie pieken die overeenkomen met aas migratie pieken bij hogere molecuulgewicht dan die vande monomere eiwitten.

Verschillende groepen hebben fractionatietechnieken gevolgd door proteïne correlatie profilering eiwitcomplexen op celniveau bakenen zonder de noodzaak van voorafgaande isolatie ^{10, 11, 12, 34} toegepast. Echter, dit kan resulteren in het niet sub-stoichiometrische interacties te detecteren. Het opnemen van een verrijking voor stap door affiniteit zuivering kan helpen om dit te overwinnen. De hier beschreven benadering zou in het algemeen bruikbaar voor het verkennen van de topologie van eiwitcomplexen en het ontrafelen van de meervoudige complexen een bepaald proteïne deelneemt aan binnen dezelfde cellulaire context. De strategie is eenvoudig en vatbaar voor laboratoria die niet kunnen hebben dure chromatografische fractionering apparatuur om eiwitcomplexen te lossen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protein G Dynabeads	Life Technologies	10003D
FLAG antibody M2	Sigma-Aldrich	F1804
Tween-20, protein grade, 10% solution	Millipore	655206
Dimethyl pimelimidate	Sigma-Aldrich	80490
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2	Sigma-Aldrich	T0449
3x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES	Sartorius	VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel	Life Technologies	BN1001
20x NativePAGE Running Buffer	Life Technologies	BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive	Life Technologies	BN2002
4x NativePAGE sample loading buffer	Life Technologies	BN2003
NativeMARK	Life Technologies	LC0725
NativePAGE 5% G-250 sample additive	Life Technologies	BN2004
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene	Thermo	249944
Multiscreen HTS 96-well filtration system	Thermo	MSDVN6550
Nunc 96-well cap natural	Thermo	276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)	Sigma-Aldrich	646547
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific	A/0627/17
Trypsin, sequencing grade	Roche	11418475001
MaxQuant (software)	N.V.t.	N.V.t.	http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (software)	N.V.t.	N.V.t.	http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus