De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Luchtwegontsteking wordt vaak geassocieerd met bacteriële infecties en vertegenwoordigt een belangrijke determinant van longziekte. De in vivo bepaling van de pro-inflammatoire mogelijkheden van verschillende factoren is uitdagend en vereist terminale procedures, zoals bronchoalveolaire lavage en de verwijdering van longen voor in-situ analyse, waardoor longitudinale visualisatie in dezelfde muis wordt uitgesloten. Hierin wordt longontsteking geïnduceerd door de intratracheale instillatie van Pseudomonas aeruginosa- kweek supernatant (SN) bij transiënte transgeniseerde muizen die het luciferase reportergen onder controle van een heterologe IL-8 runderpromotor uitdrukken. Luciferase expressie in de long wordt gecontroleerd door in vivo bioluminescente beeld (BLI) analyse over een periode van 2,5 tot 48 uur na de instillatie. De procedure kan meerdere keren worden herhaald binnen 2 - 3 maanden, waardoor de evaluatie van de ontstekingsrespons in dezelfde muizen mogelijk isDe noodzaak om de dieren te beëindigen Deze aanpak maakt het mogelijk om pro-en anti-inflammatoire factoren in realtime in de long te volgen en lijkt geschikt voor functionele en farmacologische studies.
Inleiding
Chronische longziekten, zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), cystische fibrose (CF) en bronchiectase, worden gekenmerkt door luchtwegontsteking. Luchtwegontsteking wordt gekenmerkt door oedeem, celinfectie, T-lymfocyt- en mastcelactivering, verhoogde luchtwegafscheidingen en overmatige collageenafzetting. CF is een multisystemenstoornis, en de belangrijkste oorzaak van sterfte en morbiditeit is longbacteriële infectie met toenemende pulmonale exacerbatie. De daling van de longfunctie voorspelt een significant slechtere uitkomst 1 , 2 , 3 , 4 .
De ontstekingstoestand van de luchtwegen wordt meestal waargenomen door de evaluatie van immunologische markers die tijdens het ontstekingsproces worden gewerkt in materiaal afgeleid van de onderste en bovenste luchtwegen, zoals sputum, die variabele resULT's. Bronchoscopies worden ook uitgevoerd 5 . Murine modellen zijn waardevolle instrumenten voor het onderzoeken naar de pathogenese en de evolutie van ziekten die worden gekenmerkt door luchtwegontsteking en waarvoor effectieve behandelingen of behandelingen nog niet zijn geïdentificeerd. Diermodellen van longinfectie en ontsteking zijn gebruikt om astma- en gastropathogene interacties te bestuderen, met inbegrip van de rol van chemicaliën die de menselijke omstandigheden simuleren ( bijvoorbeeld blootstelling aan sigarettenrook, LPS, elastase, ovalbumine, poly I: C, enz . Ook als combinaties van bovenstaande) 6 . De meting van ontstekingsgerelateerde parameters vereist het offer van de dieren, aangezien invasieve benaderingen nodig zijn om factoren zoals bacteriële belasting, cytokinen in de longen en verzamelde bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof te meten. Ook histologische onderzoeken zijn vaak nodig. De mogelijkheid om informatie te verkrijgen over de ontstekingsrespons kinetiek vereist het gebruik van numErge muizen. Daarom is een techniek die het mogelijk maakt om dergelijke informatie te verkrijgen zonder dat de dieren moeten worden opgeofferd, waardevol op technische, ethische, economische en operationele basis.
IL-8 is een essentiële speler in het ontstekingsproces, waarbij leukocyten worden aangewakkerd aan het ontstoken weefsel. Het is een moleculaire uitlezing voor de studie van de ontsteking van de ontstekingsweg. MIP-2 en KC kunnen functionele homologen van menselijk IL-8 in muizen zijn. Muizen uiten slechts één potentiële IL-8 receptor, een homoloog van humane CXCR2 7 , 8 , maar ze zijn in staat om een heterologe IL-8 gen promotor te moduleren die een reporter gen drijft. Een muizenmodel met longontsteking is onlangs ontwikkeld na de waarneming dat een runder IL-8 promotor / luciferase reporterconstruct in muizen kan worden geactiveerd. Deze functie maakt het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) mogelijk om de ontstekingsrespons in het leven van a te controlerenNimals 9 .
Dit model is aangepast om ontsteking te onderzoeken die wordt veroorzaakt door bacteriële exoproducten ( bijv. LPS of producten die door bacteriestammen worden vrijgegeven) of TNFalpha 10 , 11 . Het geneesmiddel ontdekkingsproces is gericht op de ontwikkeling en optimalisatie van oude en nieuwe anti-inflammatoire moleculen die longziekten kunnen behandelen, zoals CF, astma en COPD. Deze nieuwe chemische entiteiten moeten snel en gemakkelijk worden getest in diermodellen die gekoppeld kunnen zijn aan specifieke klinische fenotypen om het ontwerp van slimme klinische proeven te vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het intramurale dierenwelzijnscommissie voor dierproeven door het Interdepartementale Centrum voor Experimentele Onderzoeksdienst aan de Universiteit van Verona en voldoen aan de Europese Richtlijn 2010/63 UE, Italiaanse D.Lgs 26/2014 en de herziene "Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Dit protocol en experimenten werden goedgekeurd door de National Institutes of Health (n 273/15). Dieren hadden gratis toegang tot standaard knaagdierkoor en verzacht tapwater en werden gedurende tenminste 5 dagen geacclimatiseerd met de lokale vivariumomstandigheden (kamertemperatuur: 20 - 24 ° C, relatieve luchtvochtigheid: 40 - 70%; lichtdonkere cyclus: 12 uur ) Voor elke behandeling.
1. In Vivo Gene Delivery
- Gebruik een laminar flow hood om de in vivo delivery reagent / nucleïnezuur complexen te bereiden.
- Definieer het experimentele protocol aNd parameters volgens de in vivo instructies van de fabrikant.
- Gebruik een totaal injectievolume van 200 μL complexen per muis.
- Begin met 40 ug DNA gesuspendeerd in endotoxinevrij water; Het optimalisatiebereik kan 60 μg bereiken.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van nucleïnezuur in het injectievolume mag niet hoger zijn dan 0,5 μg / μL, volgens de instructies van de fabrikant. - Gebruik een N / P verhouding van 6 - 8 (0,12 - 0,16 μL leveringsreagens per μg nucleïnezuur). Bereken het overeenkomstige volume van de afgifte-reagens.
OPMERKING: De complexen moeten kationisch zijn voor effectieve celinvoer. De N / P-verhouding wordt gedefinieerd als het aantal stikstofresiduen (N) op het in vivo afgifte-reagens per nucleïnezuurfosfaat (P) en vertegenwoordigt de maat van het ionische evenwicht binnen de complexen.
- Verdun de berekende hoeveelheid (zie stap 1.2.1) van nucleïnezuur in 5% glucose (eindconcentraatRantsoen) met 10% glucose voorraadoplossing (meegeleverd) en steriel water. Zorg ervoor dat het verdunningsvolume de helft van het uiteindelijke injectievolume is. Vortex zachtjes of meng door pipettering omhoog en omlaag.
- Verdun de berekende hoeveelheid (zie stap 1.2.3) van het leveringsreagens in de helft van het injectievolume van 5% glucose (eindconcentratie) met behulp van de 10% glucose voorraadoplossing (meegeleverd) en steriel water. Vortex voorzichtig en draai bij 13.000 xg gedurende 15 s.
- Voeg de bovenstaande verdunde afgifte-reagentia in het verdunde nucleïnezuur tegelijk toe. Meng ze met zachte vortexing en draai deze bij 13.000 xg gedurende 15 s.
- Incubeer het mengsel van stap 1.5 gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: vanaf dit punt zijn de complexen stabiel gedurende 4 uur bij kamertemperatuur en gedurende 7 dagen bij opslag bij 4 ° C. - Voer staart-ader injecties uit met behulp van complexen die bij kamertemperatuur worden geëquilibreerd. Plaats de muisstaart in warm water (50 - 53 ° C) gedurende 30 s om de adervering mogelijk te maken.
- Plaats de muis in het bevestigingsapparaat. Voeg een 27- tot 30-gauge naald in de staartvener in een hoek van 20-30 ° en injecteer langzaam 200 μL. Na voltooiing verwijder de naald en druk op de injectieplaats toe.
OPMERKING: Een lichte buiging in de staart tijdens de injectie geeft aan dat de positionering onjuist is. Als dit gebeurt, verwijder de naald en herhaal het proces proximaal naar de vorige site.
- Plaats de muis in het bevestigingsapparaat. Voeg een 27- tot 30-gauge naald in de staartvener in een hoek van 20-30 ° en injecteer langzaam 200 μL. Na voltooiing verwijder de naald en druk op de injectieplaats toe.
- Visualiseer genuitdrukking door in vivo BLI te verrichten (zie stap 2) om 24 en 48 uur na de intraveneuze injectie.
2. In Vivo BLI
OPMERKING: Vooraf bereiden een nieuwe voorraadoplossing van 15 mg / ml D-luciferine in DPBS, filtersteriliseren met een 0.22 μm filtereenheid en opslaan bij -20 ° C.
- Plaats de muizen in een duidelijke plexiglas anesthesie kamer. Zorg ervoor dat de isofluraankamer vol is. Zorg ervoor dat de pomp (lEft) en kamer (rechts) schakelaars zijn ingeschakeld. Draai de isofluraan wijzerplaat naar 2,5% voor inductie en 2% voor onderhoud. Dieren in de IVIS-kamer worden onder een 2,5% isofluoraananesthesie tijdens de opname van het beeld gehouden.
- Nadat de muizen volledig verdoofd zijn, injecteer 10 ml / kg lichaamsgewicht van de D-luciferinoplossing door een intraperitoneale route 15 minuten voor beeldvorming.
OPMERKING: Een kinetische studie op D-luciferine moet worden uitgevoerd om de tijd van de signaalpiek na de toediening van D-luciferine te bepalen. - Open het in vivo beeldvormingssysteem en berei de beeldkamer voor door het met een stuk zwarte karton te voegen (weggooien na afloop). Plaats de neuskegels als nodig voor correcte verdoving (gebruik een kegel per muis).
OPMERKING: De buis die de anesthesie aan het instrument levert, wordt gesplitst, zodat dezelfde concentratie van verdoving naar de anesthesie manifolds in het beeldvormingssysteem wordt gebracht. - Plaats de muizen (tot 5) van de bOs aan de neuskegels die aan het verdeelstuk in het beeldvormingssysteem zijn bevestigd en de deur sluiten. Beeldverwerving duurt 5 minuten.
- Verkrijg een BLI met de software van de fabrikant, als volgt.
- Initialiseer de software. In het in-vivo beeldscherm systeem acquisitie controle paneel, zet een vinkje naast Luminescent . Controleer of de instelling Excitiefilter Blok is en de instelling Emissiefilter open is.
- Klik op de pijlen: voor de lichtgevende beeldmodus selecteert u een belichtingstijd van 5 minuten, Binning 8 en F / Stop 1; Voor de fotograferingsmodus selecteert u Binning 4 en F / stop 8.
- Selecteer in de vervolgkeuzelijst Veldweergave D, 19 cm en een onderwerphoogte van 1,5 cm. Klik op Acquire wanneer u klaar bent om de afbeelding te verwerven.
- Zodra de opname is voltooid, plaats de muizen terug in hun kooien.
- Kwantificeer de fotonen die uit specifieke regio's worden uitgezonden met behulp van de software van de fabrikant.
- Klik ROI Tools in het gereedschapspalet. Selecteer in de ROI Tools de meetrendement van de vervolgkeuzelijst Type.
- Klik op het vierkante pictogram en teken een vierkante ROI met de juiste afmetingen om de thorax van een dier te dekken. Kopieer en plak de ROI voor elk dier om ROI's met dezelfde afmetingen te verkrijgen. Klik in het paneel ROI-gereedschap op Meet ROI om de metingen van de totale intensiteit in de ROI's te verkrijgen.
- Controleer de ROI-meetgegevens voor alle ROI's die in de afbeeldingen of sequenties zijn gemaakt tijdens een sessie (één ROI per rij). Klik op Exporteren en selecteer de map waar het bestand wordt opgeslagen.
3. Muis Uitdaging Met Pro-Inflammatorische Stimuli
OPMERKING: Controleer vóór de muisuitdaging met pro-inflammatoire stimuli de basislijnactivering door i n vivo BLI (zie stap 2). Minimaal 7 dagen moeten tussen in vivo genafgifte en mous overgaanE uitdaging om de milde en voorbijgaande ontsteking te laten verdwijnen.
- Bereid de apparatuur voor intratracheale instillatie aan (zie Figuur 1 en Figuur 2 ).
- Verbind de 5 ml wegwerpspuiten met de veer (C, E), een 100 μL injectiespuit (B) en een wegwerpmeter (D) aan de 3-weg stopknop (A). Plaats het systeem op de steun (H). Plaats het systeem op de steun (H).
- Sluit de PE190 micro medische buis (F) aan op de wegwerpmeter (D) en aan de pen eeuw (G).
- Vul de 5 ml spuit met 800 μL lucht en draai de 3-weg stopknop.
OPMERKING: Vul de buis met Pseudomonas aeruginosa cultuur supernatant door 50 μl in de 100 μl spuit te aspireren.
Figuur 1: Schematische weergaveNtatie van een enkele component van het intratracheale apparaat.
(A) 3-weg stopcock, (B) 100 μL Hamilton spuit, (C) weggooibare 5 ml spuit, (D) disposable gauge, (E) weggooibare 5 ml spuit met veer, (F) PE190 micro medische buis , (G) pen eeuw, en (H) ondersteuning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vertegenwoordiging van het samengestelde intratracheale apparaat.
De identificaties zijn hetzelfde als in Figuur 1 . Klik opHier om een grotere versie van deze figuur te zien.
- Verdoof de muizen met behulp van een isofluraan verdampkamer die is ingesteld op 2,5% isofluraan gemengd met zuurstof.
- Monitor het dier om de effecten van de verdoving na 3 - 5 minuten te evalueren.
OPMERKING: Om te bevestigen dat de muis volledig verdoofd is, moet u de volgende tekenen zorgvuldig controleren: de vertraagde ademhalingssnelheid moet vertragen, het gebrek aan armrekken wanneer u door de nek opgehaald wordt en een gebrek aan respons wanneer de achterste ledematen worden gestimuleerd. Wacht nog een paar minuten en controleer opnieuw voordat u verder gaat naar de volgende stap als deze criteria niet zijn voldaan. - Plaats de verdoofde muis op het plexiglas intubatieplatform, hangend door de snijbalkjes, die op de draad worden geplaatst.
- Zet de laryngoscoop aan met de linkerhand (voor rechtshandige onderzoekers) en pak een paar stompe tangen. Gebruik de tip van de laryngoscoop en de tang om de mond voorzichtig te openen.
- Trek de tong uit en hOud het aan de kant met behulp van de tang. Leid het laryngoscoopblad naar de achterkant van de mond. Houd de laryngoscoop heel zacht tegen een hoek van 90 ° ingedrukt tot de opening van de luchtpijp zichtbaar is. Houd de laryngoscoop op zijn plaats.
- Gebruik de andere kant de afvoerbuis aan het uiteinde van de PE-buis en steek het in de luchtpijp. Draai de driewegklep om het inoculum te leveren. Trek de buis zo snel mogelijk uit de luchtpijp. Houd de muis rechtop een paar seconden lang vast tot het inoculum inademt in de longen.
OPMERKING: Muizen zullen verstikken en sterven als de luchtpijp te lang wordt geblokkeerd. - Verwijder de muis van het platform. De hersteltijd kan variëren op basis van stammen; Controleer de muis zorgvuldig en zorg ervoor dat het dier binnen 30 minuten volledig wakker is na de procedure.
- Intraperitoneaal injecteer 150 mg / kg D-luciferine en beeld de longen aan met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem 4, 24 en 48 uur na de intratrachealeInstillatie van de stimuli. Kwantificeer de fotonen die uit specifieke regio's worden uitgezonden met behulp van de software van de fabrikant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het transgene muismodel bIL-8-Luc werd gebruikt voor de in vivo monitoring van longontsteking bij muizen die werden geconfronteerd met geconcentreerde bacteriële supernatanten (30x) die gescheiden virulentiefactoren bevatten. De geïnduceerde ontstekingsreactie was detecteerbaar door in vivo beeldvorming als een toename in het BLI-signaal. Pro-inflammatoire activiteit was duidelijk detecteerbaar 2,5 uur na instillatie, hoewel het BLI-signaal de hoogste piek bereikt tusse...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In een eerdere werk 11 werd een contrast weergegeven tussen bIL-8-Luc-afhankelijke BLI en BAL markers. Het vertrouwde op de differentiële mate van gevoeligheid binnen muisstammen 12 . Om deze reden vereist de eerste toepassing van het bIL-8-Luc model op een andere muisstam een initiële studie van de ontstekingsreactie, zowel in termen van BLI als meer gestandaardiseerde ontstekingsmarkers.
Muizentransfectie veroorzaakt milde longontsteking en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 en door de Italiaanse Cystic Fibrosis League via de Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimentele bouwer | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Beeldvormingssysteem | Perkin Elmer Inc. | Experimentele bouwer | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Bescherm tegen licht, bewaar de sonde bij 4 °C |
| Vrouwelijke ingefokt BalbC | Harlan Laboratories Italy | Voorafgaand aan gebruik, werden dieren gedurende minimaal 5 dagen geacclimatiseerd aan de lokale dierlaboratoriumomstandigheden | |
| bIL-8-Luc plasmide | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Bewaar het plasmide bij -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Bewaar de vector bij -20 °C |
| JetPEI DNA transfectiereagens | Polyplus transfectie | 201B-001G | Het DNA en JetPEI mengsel werd geformuleerd met een uiteindelijk N/P-verhouding van 7 |
| D-luciferine kaliumzout 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Bescherm tegen licht, bewaar bij -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimentele bouwer | |
| Isofluraan | ESTEVE spa | 571329.8 | Niet inademen |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Bewaar de ongeopende kit bij 4 °C |
| Geautomatiseerde celteller | Dasit XT 1800J | Experimentele bouwer | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gasanesthesie systeem XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimentele bouwer | |
| PE190 micro medische betubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Spuit zonder naald 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Snij de planken van de zuiger met een schaar |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-weg stopkraan | Braun | 4095111 | |
| Spuit met naald 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Gebruik zonder naald |
| Kunststof voedingsbuizen 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Snij de punt schuin |
Referenties
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716(2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251(2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226(2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
