We presenteren hier een celkweek werkwijze voor het induceren mesenchymale-epitheliale overgangen (MET) sarcoom cellen op basis van gecombineerde ectopische expressie van microRNA-200 familieleden en grainyhead-achtig 2 (GRHL2). Deze methode is geschikt voor een beter begrip van de biologische gevolgen van de fenotypische plasticiteit in de agressiviteit van kanker en behandelingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van mesenchymale-epitheliale Transities sarcoomcellen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Fenotypische plasticiteit verwijst naar een fenomeen waarin cellen transiënt trekken van een lijn krijgen. Tijdens carcinoom progressie, fenotypische plasticiteit drijft invasie, verspreiding en metastase. Inderdaad, terwijl de meeste van de studies van fenotypische plasticiteit in het kader van epitheliale carcinomen afkomstig zijn, blijkt sarcomen, die mesenchymale oorsprong zijn, ook fenotypische plasticiteit vertonen, met een subset van sarcomen een verschijnsel dat lijkt mesenchymal- ondergaan epitheliale transitie (MET). Hier hebben we een werkwijze omvattende de miR-200-familie en grainyhead als 2 (GRHL2) deze MET-achtige fenomeen waargenomen sarcoom patiënten samples.We achtereenvolgens tot expressie GRHL2 en miR-200 familie die cel transductie en transfectie nabootsen respectievelijk , beter inzicht in de moleculaire onderbouwing van deze fenotypische overgangen in sarcoma cellen. Sarcoma cellen die miR-200s en GRHL2 aangetoond verbeterde epitheliale characteristics in cel morfologie en verandering van epitheliale en mesenchymale biomarkers. Toekomstige studies met behulp van deze methoden kunnen worden gebruikt om beter inzicht in de fenotypische gevolgen van de MET-achtige processen op sarcoma cellen, zoals migratie, invasie, metastatische neiging, en therapie weerstand.
Inleiding
Fenotypische plasticiteit heeft betrekking op een reversibele overgang tussen cellulaire fenotypes en wordt gewoonlijk verdeeld in twee types, epitheliale naar mesenchymale (EMT) overgangen en mesenchymale tot epitheliale overgangen (MET). Deze fenotypische plasticiteit speelt een belangrijke rol in de normale processen van meercellige organismen, zoals de ontwikkeling en wondgenezing 1; echter kan deze zelfde paden en genexpressie programma ook leiden tot ziekten zoals fibrose (samengevat in 2, 3, 4) en carcinoom metastase (samengevat in referenties ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Bereid DMEM gedurende celkweek door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline-streptomycine (5000 U / ml) en 500 ml DMEM. Dit medium kan voor maximaal zes maanden worden bewaard bij 4 ° C.
- Resuspendeer gevriesdroogde primers in nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 10 uM. WINKEL hersuspendeerd primers bij -20 ° C.
- Bereid radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Aanvullen met proteaseremmer cocktail voor het gebruik en bewaar buffer op ijs tijdens het gebruik. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 10 mg / m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Schema voor BMO inductie in sarcoma cellen
Een algemene tijdschema voor de inductie van MET-achtige veranderingen in sarcoma cellen wordt getoond in figuur 1. Het protocol begint met transducerende GRHL2 (figuur 1A), gevolgd door transfectie van de familie miR-200 (Figuur 1B). GRHL2 of miR-200 familieleden waren niet in staat om de impact van de verschijning van RD-cellen wanneer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Sarcomen zijn zeldzaam, maar zeer agressieve kanker van een mesenchymale lijn. Ondanks hun mesenchymale lijn, een subset van sarcomen blijkt een fenotypische overgang naar een epitheel-achtige toestand ondergaan. Dit MET-achtige schakelaar prognostische impact, zoals patiënten met epitheel-achtige tumoren zijn minder agressief 24. Ondanks hun klinische relevantie, zijn er weinig studies over de moleculaire mechanismen die deze fenotypische overgangen in sarcomen.
Om M.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
JAS erkent steun van het Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory, en de Duke University Afdeling Orthopedie. HL werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) Centrum voor Theoretische Biological Physics (NSF PHY-1.427.654) en NSF DMS-1.361.411, en als een CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) Scholar in Cancer Research van de staat Texas aan de Rice University. KEW werd ondersteund door NIH F32 CA192630 MKJ en HL geprofiteerd van nuttige besprekingen met Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta en Donald S. Coffey.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Countess geautomatiseerde teller | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess celtellingkamer slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplaat | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blocking Buffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-gebaseerde blocking buffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Loopbuffer |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transferbuffer |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA mimic negatieve controle #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | serumvrij medium |
| anti-Ecadherin antilichaam | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-muis AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-konijn AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease en Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μm filter voor flow |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blue tetrazolium | Sigma | N5514 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | polybrene |
| 3 mL spuit | BD Bioscience | 309657 | |
| Steriele spuitfilter | VWR | 28145-505 | |
| 5mL polypropyleen ronde bodembuis | 352063 | flow cytometry buizen | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie Kit | Thermo Fisher | 4368814 | reverse transcriptie kit |
| 4% paraformaldyhyde | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| runde serum albumine | Sigma | A7906 |
Referenties
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu
