Ongecontroleerde bloeding, een belangrijke oorzaak van sterfte onder traumapatiënten, kan gemodelleerd worden met behulp van een standaard leverlaceratie in een muizen model. Dit model resulteert in consistent bloedverlies, overleving, en maakt het mogelijk om hemostatische stoffen te testen. Dit artikel geeft de stap voor stap het uitvoeren van dit waardevolle model.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ongecontroleerde hemorragische shock, gemodificeerd via leverlakeratie in muizen met realtime hemodynamische monitoring
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ongecontroleerde bloeding is een belangrijke oorzaak van preventieve sterfte onder traumapatiënten. Wij hebben een muizenmodel ontwikkeld van onbeheerde bloeding via een leverbeschadiging die resulteert in consistent bloedverlies, hemodynamische veranderingen en overleving.
Muizen ondergaan een gestandaardiseerde resectie van de linker-middelloop van de lever. Ze mogen zonder bloei ingeademd worden. Hemostatische middelen kunnen worden toegediend als voorbehandeling of reddingstherapie, afhankelijk van de interesse van de onderzoeker. Tijdens de bloeding wordt realtime hemodynamische monitoring via een linker femorale arteriële lijn uitgevoerd. Muizen worden dan geofferd, bloedverlies wordt gekwantificeerd, bloed wordt verzameld voor verdere analyse en organen worden geoogst voor analyse van letsel. Experimenteel ontwerp is beschreven om gelijktijdig te testen van meerdere dieren.
Leverbloeding als een model van onbeheerde bloeding bestaat iN de literatuur, voornamelijk in rat- en varkensmodellen. Sommige van deze modellen maken gebruik van hemodynamische controle of kwantificeren bloedverlies maar hebben geen consistentie. Het huidige model bevat kwantificering van bloedverlies, real-time hemodynamische controle in een muizenmodel dat het voordeel biedt van het gebruik van transgene lijnen en een hoogdoorlaatmechanisme om de pathofysiologische mechanismen verder te onderzoeken bij onbeheerde bloeding.
Inleiding
Trauma is de belangrijkste doodsoorzaak en invaliditeit bij jongeren wereldwijd. 1 Onbeheerde bloeding blijft een belangrijke oorzaak van sterfte bij ernstig gewonde traumapatiënten. 2 Beheersing van de bloederende traumapatiënt is tweeledig: controle van chirurgische bloeding en reanimatie en vervanging van verloren bloed.
Diermodellen van hemorragische shock zijn de hoeksteen in het trauma onderzoek en kunnen gebruikt worden in de evaluatie van de pathofysiologie en de behandeling van traumatische / hemorragische shock. 3 , 4 Schokken in diermodellen kunnen in grote mate worden verwezenlijkt door twee methoden: gecontroleerde bloeding en onbeheerde bloeding. 5 , 6 Controle-bloeding wordt uitgevoerd door verwijdering van een vast bloedvolume of door bloedverwijdering om een bepaalde bloeddruk te bereiken (vaste druk). Terwijl deSe modellen zijn nuttig bij de evaluatie in de mechanismen en immuunveranderingen bij hemorragische shock, ze zijn niet van toepassing op het testen van hemostatische stoffen en mimiceren niet het klinische scenario van bloeding na trauma. In deze mate trachten we een model van onbeheerde bloeding te ontwikkelen die ons toelaten om hemostatische veranderingen en pro-coagulerende middelen in een muizenmodel te testen. De lever is een aantrekkelijke optie voor onbeheerde bloeding onder invloed van de dubbele bloedtoevoer naar de lever en het is een van de meest gewonde intrabdominale organen in zowel stomp en doordringend trauma. Gezien de hoge klinische relevantie, is de lever gebruikt als een model van onbeheerde bloeding, meestal bij rat- en varkensmodellen, maar ook onlangs in primaten. 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Murine modellen hebben ook leververwonding opgenomen, zoals een crush model of een stomp trauma; Deze modellen resulteren echter niet in hemorragische schokken die afleiden aan de leverbeschadiging. 13 , 14
De rat- en varkensmodellen van onbeheerde leverbloeding, die waardevol zijn bij het kijken naar resuscitatiepraktijken en hemodynamische controle, zijn minder voordelig dan een muizenmodel om verschillende redenen, zoals kosten, aantal dieren die gebruikt worden en belangrijker het relatieve gebrek aan transgene lijnen die beschikbaar zijn voor analyse Van specifieke cellulaire en moleculaire signalering. Het huidige muizenmodel deelt belangrijke overeenkomsten met bestaande leverblosemodellen, waaronder gestandaardiseerde leverlaceratie, bloedverlieskwantificatie, hemodynamische monitoring en het vermogen om overlevingsanalyse uit te voeren. Veel bestaande modellen bevatten slechts enkele van deze aspecten, terwijl ons model is ontwikkeld om veel van de fysiologische variaties te metenBles gelijktijdig en in meerdere muizen. Ook de ontwikkeling van een muizenmodel opent de deur naar onderzoeken buiten reanimatie en in grotere pathofysiologische mechanismen bij onbeheerde bloeding met het potentieel van een kosteneffectief, high-throughput model met behulp van geavanceerde moleculaire technieken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen werden gehuisvest in overeenstemming met de Universiteit van Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) en National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD, USA) richtlijnen voor dierenverzorging in specifieke pathogeenvrije condities met 12 uur lichte donkere cycli en vrije toegang tot Standaard voer en water. Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door het Animal Research and Care Committee van de Universiteit van Pittsburgh zijn uiteengezet.
1. Chirurgische veld- en instrumentinstellingen
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten, hechtingen, gaas, katoenen tip applicators, buizen en buizen voor de procedure.
- Steriliseer chirurgische instrumenten, hechtingen, gaas en katoenen tip applicators in een autoclaaf. Steriliseer de buizen en de buisverbindingen met ethyleenoxide.
- Chirurgisch veld
- Zet een watercirculerende verwarmingspaneel aan en zet deze op 37 ° C. Plaats een surgiCal blue pad bovenop en dan een steriele draperie bovenop de chirurgische blauwe pads.
- Open alle gesteriliseerde instrumenten op de steriele draperie. Gebruik steriele handschoenen om de steriliteit tijdens deze stap te voorkomen.
- Vul een roestvrijstalen kom met 70% ethanol en zet opzij. Dit wordt gebruikt om instrumenten tussen dieren te reinigen.
- Zet de microbead sterilisator aan en laat het verwarmen tot 150 ° C. Dit wordt ook gebruikt om instrumenten tussen dieren te reinigen. Als u operatie uitvoert op meer dan 5 muizen, moet u de instrumenten veranderen in een nieuwe steriele set.
- Transducer Set-up
- Sluit een steriele transducer, PE-50 slang, twee 23G naalden, en mannelijke luer, en een drie-weg stopcock. 6
- Kalibreer en doe de transducer op volgens de instructies van de fabrikant.
2. Chirurgische Proces van de Lever Laceratie
- Anesthesie Inductie en Positie
- Spuit natriumpentobarbital intraperitoneaal in bij een dosis van 70 mg / kg. Anesthesie moet tussen 5-10 minuten in werking treden; Bepaal diepte van de verdoving met een teenknijp. Als de muis een reactie heeft op de teenknijp, is extra tijd of verdoving nodig. Als tijdens de procedure extra anesthesie nodig is, vul dan natriumpentobarbital aan. Geef geen supplementen in grotere hoeveelheden dan 0,05 ml om overdosering te voorkomen.
- Nadat de muis helemaal onder verdoving is, plaats de muis op een chirurgische raad. Bevestig alle vier de ledematen van de muis aan het bord met tape.
- Scheer de buik en bilaterale lies met een scheermes.
- Soak steriele gaas met betadine en doe dit op de buik en bilaterale groenten voor de operatie. Voor overlevingsexperimenten prepareer de buik en de groenten met betadine gevolgd door ethanol voor in totaal drie prep cycli.
- Plaats een rectale temperatuursensor om de kerntemperatuur gedurende de gehele procedure te controleren. Houd de cErts temperatuur tussen 35-37 ° C.
- Femorale slagader en veneuze kanulatie
- Voor veneuze katheteropstelling: vul PE-10-buizen, een 30 G-naald en een driewegsklok met de oplossing van Lactated Ringer uit een IV-tas.
- Voor arteriële catheteropstelling: vul PE-10-buis en 30G-naald met gehardiniseerde zoutoplossing (1:10 verdunning van 1000 U heparine). Heparine-zoutoplossing is nodig om stolling te voorkomen.
- Plaats de muis onder een dissectiemicroscoop.
- Maak een 4-5 mm longitudinale snede over de liesspier met behulp van chirurgische Iris schaar. Met behulp van Dumont-tangen pak het vetweefsel vast dat verbonden is met de adductor spier en trek zijdelings voor een schone blootstelling van de femorale bundel. Ontleed niet door het vetweefsel, aangezien dit tot vaatbeschadiging zal leiden.
- Ontleed de zenuw uit de ader en de ader zorgvuldig met de Dumont-tang. Er is een vet pad naast de zenuw. Pak dit met een Dumont Forcep anD zijwaarts trekken; Dit trekt de zenuw weg van de slagader en creëert een vliegtuig voor dissectie. Ontleed met andere Dumont Forcep het bindweefsel tussen de zenuw en de slagader.
- Grijp de zenuw niet tijdens dit deel van de dissectie.
- Loop drie 6-0 zijde hechtingen rond de slagader en ader proximaal aan de profunda femoris opstijgen.
- Plaats hechting 1 meest proximaal en los los.
- Plaats hechting 2 meest distaal en bind onmiddellijk.
- Plaats hechting 3 tussen hechting 1 en 2 en los los.
- Maak een arteriotomie op het ventrale oppervlak van het vat. Gebruik van microvasculaire scharen wordt aanbevolen om de arteriotomie te maken om transcriptie van het vat te vermijden.
- Steek de driewegkatheter in de slagader in. Houd Suture 1 en 2 onmiddellijk vast om de katheter vast te zetten.
- Sluit de driewegskatheter aan op de transducer en verzamel de basisgegevens van de bloeddruk.
- Herhaal stappen 2.2.4 - 2.2.6 op de tegenovergestelde lies. Kannuleer de femorale ader op een soortgelijke manier als de slagader. Voer een venotomie uit op het ventrale oppervlak van het vat, gevolgd door de inbrengen van de katheter. Deze katheter kan worden gebruikt voor vloeistof- of geneesmiddeladministratie.
- Lever Laceratie
- Pre-weeg een buis met 0,5 ml PBS, drie absorptie driehoeken, en een weeg boot per muis.
- Maak een ventrale middenlijn laparotomie incisie beginnend bij het xiphoide proces en verleng caudally om de blootstelling van de lever volledig mogelijk te maken.
- Plaats een absorptie driehoek in de buik tegen de rechter buikwand. Herhaal aan de linkerkant.
- Zorg ervoor dat de absorptie driehoek weg is van de lever om een verpakking hemostatic effect te vermijden nadat de lever is gescheurd.
- Pak de linker-middelloop van de lever voorzichtig en snijd 75% van de lap met chirurgische Iris-schaar. Plaats het snoerD segment in een buis die PBS bevat.
- Sluit de buikwand met nietjes aan via een nietjesapparaat. Pak de huid en de spieren bij elkaar en brand de nietjes. Doe dit zo snel mogelijk na de leververgroting om bloedverlies buiten de buik te vermijden. Bij overlevingsexperimenten is de buik in twee lagen gesloten. Een lopende, absorbeerbare hechting voor de spier gevolgd door een lopende laag van niet-absorbeerbare hechting voor de huid zorgt voor een afdoende afsluiting.
- Voor muizen die langer dan 30 minuten voor overlevingstijdpunten zijn, dienen de femorale katheters verwijderd te worden, de slagader en de ader zijn vastgelegd met hechting 3 van stap 2.2.6. Bilaterale groenten worden dan in twee lagen afgesloten, zoals beschreven in de vorige stap.
- Na een bepaalde tijd van interesse voor bloeding (30 minuten tot 72 uur), verwijder de nietjes. Verwijder de absorptiedriehoeken en plaats in overeenkomstige voorgewogen weegboten. Gebruik extra absorptiedriehoeken om ongeabsorbeerd bloed op te slikken.
- Weeg absorptiefilters om het totale bloedverlies te berekenen.
- Postoperatieve zorg
- Laat muizen die 30 minuten op de operatieplank worden geofferd en onder constante bewaking en onder volledige verdoving tot op het moment van het offeren. Muizen worden geëuthaniseerd met een combinatie van cardiale punctuur en een overdosis ingeademd isofluraan.
- Plaats muizen die langer zijn dan de overlevingstijd in een herstelkooi bovenop een watercirculerende verwarmingspaneel. Controleer de muizen voortdurend tijdens het herstel en laat het niet onbewaakt achter totdat ze het bewustzijn herwinnen om de sternale recumbency te behouden. Keer de muis terug om alleen met andere muizen ruimte te besparen zodra het verdient is van verdoving.
- Administreer postoperatieve analgesie met 0,1 mg / kg buprenex via subcutane injectie, wekelijks verdoofd van verdoving en elke 12 uur na tot opofferingstijd.
- Laat muizen vrije toegang tot eten en water nadat ze zijn teruggegeven aan hunNormale kooien postoperatief.
- Op het moment van het offeren voor overlevingsmuizen wordt anesthesie bereikt met inhalatie isofluraan. Eens onder verdoving wordt bloed verzameld via een hartkardiale punctie, bloedverlies wordt geregistreerd zoals hierboven beschreven en uiteindelijk is euthanasie verzekerd met een overdosis isofluraan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het leverlaceratiemodel resulteert in reproduceerbaar en consistent bloedverlies bij muizen. Figuur 1A toont het consistente gewicht van verscheurde lever die kan worden verkregen met een standaardafwijking van slechts 0,02 g. Deze consistentie in versneld lever gewicht maakt het mogelijk om het model tussen muizen en in verschillende experimentele opstellingen te reproduceren, zoals verschillende resuscitatieve protocollen. Ook het reproduceerbare gewicht van de gesmolt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven murine leverlaceratiemodel biedt een betrouwbaar, consistent model van onbeheerde bloeding. Dit model is eenvoudig te verrichten, maar er zijn belangrijke stappen die zorgvuldig overwegen. Het meest technisch uitdagende deel van het model is de canulatie van de femorale vaten voor hemodynamische controle en vloeistof- / geneesmiddeladministratie. Bij de dissectie van de zenuw en de arteriotomie / venotomie moet voorzichtig zijn. Het is belangrijk om de zenuw niet aan te raken tijdens de dissectie van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financiële concurrerende belangen om te verklaren.
Dankbetuigingen
Het werk van dit manuscript werd ondersteund door financiering aan Dr. Neal door het Pilot Project van het Vasculaire Geneeskunde Instituut in Hemostase en Vasculaire Biologie (P3HVB) en de AAST Research Fellowship. Dit werk wordt ondersteund door US National Institutes of Health-subsidies 1 R35 GM119526-01 en UM1HL120877-01.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SS/45 dumonts | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| surgical scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.8 mm curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| suture reel 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| suture 4-0 silk w/ needle | Owens Minor | K188H | |
| gauze 4 x 4 | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| cotton-tip applicator | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 30 G naald | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 23 G naald | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 10 cc spuit | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 50 cc conische buis | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 1 cc spuit met 25G naald | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Polyethyleen 10 buis 100`(PE-10) | Fisher Scientific | 14-170-12P | |
| Polyethyleen 50 buis 100`(PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| 3-weg stopkraan | Fisher Scientific | NC9779127 | |
| chirurgisch blauw kussen | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Steriele veldverbanden | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| tape rollen 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| rechtzijdige brede mond potten | VWR | 159000-058 | |
| roestvrij stalen lade 8" x 11" | VWR | 62687-049 | |
| male-male leur lock 3-way | VWR | 20068-909 | |
| sterilisatie zak 3" x 8" | VWR | 24008 | |
| sterilisatie zak 5" x 10" | VWR | 24010 | |
| absorptie driehoeken | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| 7 mm wondclip applicator | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 1.000 7 mm wondclips | Fisher Scientific | E0522687 | |
| betadine (4 oz) | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| steriele handschoenen | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| eppendorfs | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| 1/2 cc Lo-Dose insuline spuit | Fisher Scientific | 12-826-79 | |
| kleine weegboot | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| lactated ringers | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| hepranized zoutoplossing (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl) | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| fosfaat gebufferde zoutoplossing | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| pentobarbital | kan worden gekocht via een willekeurige wereldwijde leverancier | ||
| Wild M650 microscoop met statief | Leica | ||
| Digi-Med BPA-400 analyzer & systeemintegrator | Micro-Med | SYS-400 | |
| TXD-310 (Digi-Med Transducer) | Micro-Med | TXD-300 | |
| Computer | Dell | ||
| microbead instrument sterilisator | VWR | 11156-002 | |
| Oster A5 clippers met maat 40 kling | VWR | 10749-020 | |
| circulerende verwarmingspad 18 x 26 | Harvard | py872-5272 | |
| rectale thermometer | Kent Scientific | RET-3 |
Referenties
- Chang, R., Cardenas, J. C., Wade, C. E., Holcomb, J. B. Advances in the understanding of trauma-induced coagulopathy. Blood. 128 (8), 1043-1049 (2016).
- Kutcher, M. E., et al. A paradigm shift in trauma resuscitation: evaluation of evolving massive transfusion practices. JAMA surgery. 148 (9), 834-840 (2013).
- Tsukamoto, T., Pape, H. C. Animal Models for Trauma Research. Shock. 31 (1), 3-10 (2009).
- Darwiche, S. S., et al. Pseudofracture: an acute peripheral tissue trauma model. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -S., Ayala, A. Shock and Hemorrhage: an Overview of Animal Models. Shock. 24, Suppl 1. 33-39 (2005).
- Kohut, L. K., Darwiche, S. S., Brumfield, J. M., Frank, A. M., Billiar, T. R. Fixed volume or fixed pressure: a murine model of hemorrhagic shock. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuoka, T., Hildreth, J., Wisner, D. H. Liver injury as a model of uncontrolled hemorrhagic shock: resuscitation with different hypertonic regimens. J Trauma. 39 (4), 674-680 (1995).
- Komachi, T., et al. Adhesive and Robust Multilayered Poly(lactic acid) Nanosheets for Hemostatic Dressing in Liver Injury Model. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. , (2016).
- Orfanos, N. F., et al. The effects of antioxidants on a porcine model of liver hemorrhage. J Trauma Acute Care Surg. 80 (6), 964-971 (2016).
- Morgan, C. E., Prakash, V. S., Vercammen, J. M., Pritts, T., Kibbe, M. R. Development and validation of 4 different rat models of uncontrolled hemorrhage. JAMA Surgery. 150 (4), 316-324 (2015).
- Rosselli, D. D., Brainard, B. M., Schmiedt, C. W. Efficacy of a topical bovine-derived thrombin solution as a hemostatic agent in a rodent model of hepatic injury. Can J Vet Res. 14 (14), 303-308 (2015).
- Sheppard, F. R., et al. Development of a Nonhuman Primate (Rhesus Macaque) Model of Uncontrolled Traumatic Liver Hemorrhage. Shock. 44, 114-122 (2015).
- Nemzek-Hamlin, J. A., Hwang, H., Hampel, J. A., Yu, B., Raghavendran, K. Development of a murine model of blunt hepatic trauma. Comp Med. 63 (5), 398-408 (2013).
- Vogel, S., et al. Platelet-derived HMGB1 is a critical mediator of thrombosis. J Clin Invest. 125 (12), (2015).
- Modery-Pawlowski, C. L., Tian, L. L., Ravikumar, M., Wong, T. L., Sen Gupta, A. In vitro and in vivo hemostatic capabilities of a functionally integrated platelet-mimetic liposomal nanoconstruct. Biomaterials. 34 (12), 3031-3041 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
