Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Samenvatting

In een poging om bacteriële pathogenen te dwarsbomen, hosts beperken vaak de beschikbaarheid van voedingsstoffen op de plaats van infectie. Deze beperking kan de abundanties van de belangrijkste metabolieten waaraan regulerende factoren te reageren, het aanpassen van cellulaire metabolisme te veranderen. In de afgelopen jaren is een aantal eiwitten en RNA zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie virulentie. Bijvoorbeeld, de CodY eiwit reageert hoeveelheden vertakte aminozuren en GTP en wordt veel geconserveerd bij lage G + C Grampositieve bacteriën. Als globale regulator in Staphylococcus aureus, CodY de expressie van tientallen virulentie en metabole genen. Onze hypothese is dat S. aureus gebruikt CodY, voor een deel, aan de metabole toestand te veranderen in een poging aan te passen aan voedingsstoffen randvoorwaarden potentieel aangetroffen in de nieuwe omgeving. Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor de extractie en analyse van metabolieten van S. aureus met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrietrometry, een protocol dat is ontwikkeld om deze hypothese te testen. De werkwijze wijst ook beste praktijken die zorgt voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, zoals het behoud van biologische stabiele en voortdurende beluchting zonder het gebruik van continue chemostaatcultures. Ten opzichte van de USA200 methicilline-gevoelige S. aureus isolaat UAMS-1 uitgangsstam, de isogene mutant Cody vertoonden significante verhogingen van aminozuren afgeleid van aspartaat (bijvoorbeeld threonine en isoleucine) en afnamen in hun precursors (bijvoorbeeld aspartaat en O -acetylhomoserine ). Deze resultaten correleren goed met transcriptionele gegevens verkregen met RNA-seq analyse: genen in deze trajecten werden opgereguleerd tussen 10- en 800-voudig in Cody null-mutant. Koppeling globale analyse van de transcriptoom en het metaboloom kan onthullen hoe bacteriën veranderen hun metabolisme wanneer zij worden geconfronteerd met het milieu of nutritionele stress, het verstrekken van potentiële inzicht in de physiological veranderingen in verband met een tekort aan nutriënten ervaren tijdens infectie. Dergelijke ontdekkingen de weg voor de ontwikkeling van nieuwe anti-infectieuze middelen en therapeutische middelen vrijmaken.

Inleiding

Bacteriële pathogenen te kampen met vele uitdagingen in de nieuwe omgeving. Naast directe aantasting door immuuncellen, de gastheer sekwestreert ook voedingsstoffen die essentieel zijn voor bacteriële overleving en replicatie, genereren nutritionele immuniteit ^{1, 2.} Om deze vijandige omgeving te overleven, bacteriële ziekteverwekkers implementeren virulentiefactoren. Sommige van deze factoren kan de bacterie om de immuunrespons te ontwijken; Andere factoren zijn uitgescheiden spijsverteringsenzymen, zoals hyaluronidase, thermonuclease en lipase, waarbij de bacteriën in staat kan stellen ontbrekende voedingsstoffen aan te vullen door de consumptie van weefsel afgeleide bestanddelen ^{3, 4, 5.} Sterker nog, bacteriën regulerende systemen die de fysiologische toestand van de cel te binden aan de productie van virulentiefactoren ^{6, 7 geëvolueerd,} up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Een groeiende hoeveelheid bewijs wijst op CodY als kritische regulator koppelen metabolisme en virulentie. Hoewel in Bacillus subtilis eerst ontdekt als een repressor van het dipeptide permease (dpp) -gen ^11, is CodY nu bekend dat door vrijwel alle lage G + C Gram-positieve bacteriën ^{12, 13} en regelt tientallen genen betrokken bij koolstof en stikstofmetabolisme ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} In pathogene species, CodY bestuurt ook de expressie van een aantal van de belangrijkste virulentiegenen ^{20, 21,}. ef '> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} CodY wordt geactiveerd als een DNA-bindend eiwit door twee klassen van liganden: vertakte aminozuren (BCAA, isoleucine, leucine en valine [ILV]) en GTP . Wanneer deze voedingsmiddelen zijn overvloedig, CodY onderdrukt (of in sommige gevallen, stimuleert) transcriptie. Al deze voedingsstoffen beperkter is CodY activiteit geleidelijk verminderd, waardoor een gegradeerde transcriptionele respons die omleidt precursoren via verschillende metabolische wegen verbonden centraal metabolisme ^{28, 29, 30.}
Tandem vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is een techniek die nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van kleine moleculen intracellulaire metabolieten ^31. In combinatie met Transcriptome analyse (bijvoorbeeld RNA-Seq) Dit analytisch workflow inzicht in de fysiologische veranderingen die optreden in reactie op milieu- of nutritionele stress. Hier presenteren we een methode voor het metaboliet extractie uit Staphylococcus aureus cellen en daaropvolgende analyse door LC-MS. Deze benadering is gebruikt om de pleiotrope effecten van CodY op S. aureus fysiologie aan te tonen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Buffer Solutions

1. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door verdunning van een voorraadoplossing van 10x PBS tot een eindconcentratie van 1 x met ultrazuiver (gedestilleerd en gedeïoniseerd) water.
2. Bereid quenching oplossing combineert 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrazuiver _H2O en 19 pl (0,1 mM eindconcentratie) mierenzuur.
3. Bereid LC-MS oplosmiddel A door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) met ultrazuiver water.
4. Bereid LC-MS oplosmiddel B door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) acetonitril.
   LET OP: Alle oplossingen moeten worden bereid met behulp van de hoogste zuiverheidsgraad reagentia beschikbaar (in het algemeen high-performance vloeistofchromatografie graad). Oplossingen moeten vers voor elk experiment worden voorbereid en opgeslagen op ijs voorafgaand aan het gebruik.

2. Vaststelling van Steady-state S. aureus Growth

1. Streak S. aureus stammen van belang zijn voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) uit een bevroren glycerol voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16-24 uur.
2. Beënten van 4 ml tryptische soja bouillon (TSB) of een ander geschikt medium in steriele glazen incubatiebuizen met enkele kolonies van elke stam. Incubeer schuin (70 ° hoek ~) met rotatie bij 60 omwentelingen per minuut (rpm) bij 37 ° C gedurende 16-20 uur.
   OPMERKING: Overnacht kweken zijn gevoelig voor zuurstof verlopen bij gebruik van standaard werkwijzen, waaronder de in stap 2.2 beschreven, waarbij de cellulaire fysiologie beïnvloeden. Derhalve maken we een meerdere back-verdunning strategie biologische steady state verzekeren (zie stap 2,4-3,2, hieronder).
3. Met een spectrofotometer om de optische dichtheid van de kweken te meten van stap 2,2 bij 600 nm (OD _600). Gebruik steriel medium als een optische referentie (leeg). Deze cellen verdund tot een OD ₆₀₀ van 0,05 in 50 ml steriele TSB-medium (voorverwarmd tot 37 ° C) in afzonderlijke 250 mL DeLong flessen.
4. Incuverminder de kweken bij 37 ° C in een waterbad onder schudden bij 280 rpm.
5. Elke 30 minuten, neem _OD600 metingen; Als optische dichtheden toenemen, kan het nodig zijn de kweken verdunnen met TSB zodat ze binnen het lineaire bereik van de absorptie spectrofotometer blijven.
6. Bij culturen uit stap 2.5 komen tot een _OD600 van 0,8-1,0 ~, subcultuur ze in 50 ml 37 ° C TSB tot een OD ₆₀₀ van 0,01-0,05 en herhaal de stappen 2.4 en 2.5.

3. Sample Collection Setup

1. Bereid een bed van gemalen droog ijs in een geschikt vat (bijvoorbeeld glazen schaal, ijsemmer of koeler).
2. Wanneer de optische dichtheid van de kweken naderen het gewenste punt oogst, voeg 1 ml blussen oplossing tot een 35 mm petrischaal onbehandeld en pre-koel op droogijs ≥5 min.
   OPMERKING: De "gewenste oogst point" zal variëren afhankelijk van experimentele doelen. Bijvoorbeeld, als men m onderzoekenetabolites tijdens aërobe groei kengetallen van deze toestand omvatten acetaat excretie en opnieuw assimilatie van het acetaat tijdens de post-exponentiële groeifase ^{32, 33.} In het algemeen dient dit punt binnen een bepaald groeistadium (bijvoorbeeld exponentiële fase). De specifieke _OD600 waarden die met deze fase kan variëren tussen verschillende bacteriestammen en groeimedia.
3. Plaats een roestvrij stalen filter frit (voorgekoeld tot -20 ° C) in een rubberstop en plaats deze bovenop een vacuum kolf bevestigd aan een vacuümbron of vacuümpomp.
4. Breng het vacuüm en plaats een gemengde cellulose-ester membraan (0,22 urn poriegrootte) geplaatst.
   Opmerking: Het is cruciaal om een ​​filter te gebruiken met een diameter gelijk aan die van de frit en goed Deze filter zodat het monster wordt getrokken door het filter in plaats van over de rand. Bevochtigen van het membraan met ijskoud, steriel _H2O kan helpenmet het positioneren van het membraan.

4. De steekproef Harvest

1. Bij een _OD600 van 0,4-0,5 ~ Gebruik een serologische pipet 13 ml kweek uit de kolf te verwijderen en het monster op het filter.
2. Nadat het gehele monster werd gefilterd, spoel de filter met ≥5 ml ijskoude PBS tot middelgrote geassocieerde metabolieten wegspoelen.
3. Neem de vacuümslang en gebruik een paar steriele pincet om het filter uit de frit verwijderd. Keren de filter (cel naar beneden) in de voorgekoeld afschrikoplossing.
   Opmerking: Het is belangrijk om de bovengenoemde stappen snel uit te voeren (dat wil zeggen binnen enkele seconden) en zodra de vloeistof is verwijderd om de snelle afkoeling van de cellen te waarborgen het stoppen metabolische activiteit.
4. Incubeer de filter in uitwasoplossing op droog ijs gedurende ≥20 min.
5. Met steriele pincet Draai het filter (cel naar boven) in de petrischaal en gebruik een micropipet om de cellen af ​​te spoelen aan Thij membraan in de demping oplossing.
6. Geresuspendeerd de cellen in uitwasoplossing en breng de celsuspensie in een steriele 2 mL slagvaste buis met -100 pl 0,1 mm silicapareltjes. Bewaar deze op droog ijs of bij -80 ° C.

5. Extractie Afbraakproduct

1. Dooi samples op nat ijs en verstoren de cellen in een homogenisator met vier 30 s uitbarstingen op 6000 rpm, 2 min koelperioden op droogijs tussen cycli.
2. Verduidelijking van de lysaten gedurende 15 minuten in een vooraf gekoelde, gekoelde microcentrifuge bij topsnelheid (dwz 18.213 xg bij ≤4 ° C).
3. Breng het supernatant in een schone microcentrifugebuis.
4. Met behulp van een micropipet, dragen een klein gedeelte van het monster naar een microcentrifugebuis voor de kwantificering van residuele peptidegehalte in stap 6; Bewaar de rest bij -80 ° C.
   Opmerking: Het volume van gereserveerde monster varieert, afhankelijk van de BCA assay gebruikt in stap 6.1. Dezemonster moet worden opgeslagen op nat ijs voor onmiddellijke analyse of ingevroren bij -80 ° C.

6. bicinchoninezuur (BCA) assay

1. Voer een BCA assay zoals aanbevolen door de fabrikant kit hand monsters uit stap 5.4 om de resterende peptideconcentratie voor elk monster te bepalen.

7. LC-MS

1. Meng 75 pl S. aureus extract met 75 pi van LC-MS solvent B, bereid in stap 1.4.
2. Vortex te mengen en centrifugeren bij 13.000 xg gedurende 5 minuten.
3. Plaats 100 pi supernatans in een vloeistof chromatografie (LC) flesje en sluit het. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten in het monster.
4. Laad de LC flesjes op de LC-MS autosampler en de running te bewerken in de software "Offline Worklist Editor."
   1. Vul de "Sample Name" (bijvoorbeeld wildtype-1), "Sample Position" (bijvoorbeeld P1-A1), "Method" (bijvoorbeeld A Mierenzuurcid-Negative Method) en "Data File" (bijvoorbeeld wild-type-1) kolommen. Klik op de knop "Save werkvoorraad" knop. Open de "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" software en voer de eerder opgeslagen werklijst. Klik op de "Start Worklist Run" knop om de continue LC-MS meting te starten.
5. Scheid de monsters op een kolom, de kolom te koppelen aan een time of flight (TOF) spectrometer, en koppelen van de TOF spectrometer met het LC-systeem. Met een mobiele fase gradiënt als volgt: 0-2 min, 85% oplosmiddel B; 3-5 min, 80% oplosmiddel B; 6-7 min, 75% oplosmiddel B; 8-9 min, 70% oplosmiddel B; 10-11,1 min, 50% oplosmiddel B; 11,1-14 min, 20% oplosmiddel B; en 14,1-24 min, 5% oplosmiddel B; eindigen met een 10 min re-equilibratie periode bij 85% oplosmiddel B en een stroomsnelheid van 0,4 ml ^min-1.
6. Onder toepassing van een isocratische pomp trekken een referentiemassa oplossing met de run om gelijktijdige mass as kalibratie.
   LET OP: Deze stapis gebaseerd op de standaard TOF spectrometer handleiding.
   1. Gebruik het mengsel van azijnzuur D4 en hexakis (1H, 1H, 3H--tetrafluorpropoxy) fosfazine de referentiemassa oplossing voor de real-time kalibreren. Met de isocratische pomp met debiet van 2,5 ml ^min-1 gedurende de infusie.

8. Batch Correctie van Ion Counts

1. Wijzen een monster dienen als referentiemonster voor batch corrigeren (bijvoorbeeld wildtype, repliceren 1).
2. Bereken de som van de ion telt voor alle metabolieten binnen de referentie-monster. Herhaal deze berekening voor alle monsters.
3. Verdeel het totaal aantal ionen van elk monster door de ionen van het referentiemonster om een ​​verhouding te genereren.
4. Verdeel het ion telling voor elke metaboliet in een monster door het monster / referentieaandeel een batch-gecorrigeerde ion telling voor elke metaboliet te verkrijgen.

9. Peptide Normalisatie

1. Divide de batch-gecorrigeerde ion telwaarden voor elke verkregen in stap 8 door de peptideconcentratie bepaald met BCA assay stap 6 om een ​​genormaliseerde waarde verkregen voor elk monster metaboliet.
   OPMERKING: De genormaliseerde, batch-batch ion gecorrigeerde tellingen per metaboliet, verkregen in stap 9.1 kan direct worden vergeleken tussen stammen en onderworpen aan statistische analyse (bijvoorbeeld een Mann-Whitney U test). Als alternatief, een metaboliet waarvan bekend is onveranderd, hetzij door de behandeling of genetische achtergrond kan worden gebruikt als een normalizer om veranderingen als gevolg van ontleding metaboliet detecteren. De toevoeging van een bekende hoeveelheid L-norvaline of gluraric zuur in de extractiebuffer kan worden gebruikt voor het corrigeren voor het verlies tijdens monster verwerking ^34.

Resultaten

We hebben intracellulaire metaboliet zwembaden in S. aureus geanalyseerd tijdens de in vitro groei in een rijke, complexe medium. Als bewijs van het principe, vergeleken we metabolietprofielen tussen de methicilline-gevoelige S. aureus osteomyelitis isoleren UAMS-1 (wildtype [WT]) en een isogene stam zonder de globale transcriptionele regulator CodY (Δ Cody) ^26. Steady-state, exponentiële kweken van de WT en Cody stamme...

Discussie

Alle kleine moleculen metabolieten zijn met elkaar verbonden via hun gemeenschappelijke oorsprong in centrale metabole routes. Tijdens exponentiële groei, bacteriële cellen in biologische en metabolische steady state, die een momentopname van de fysiologische toestand onder specifieke omstandigheden. CodY controleert voedingsstoffen voldoende door te reageren op ILV en GTP. Als ILV en GTP zwembaden druppel wordt CodY verricht waardoor geleidelijk verlaagd, het aanpassen van de expressie van de doelwitgenen te passen aan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal/Uitrustinga
DeLong Cultuurkolf (250 mL)	Belco	2510-00250
Sidearm Kolf, 500 mL	Pyrex	5340
3-gats Rubber Stop, #7	Fisher	14-131E
Roestvrij Staal Filter houder/frit	VWR	89428-936
Petri Schaal, 35 mm	Corning	430588	Niet behandeld voor weefselcultuur
Gemengde cellulose ester membraan, 0.22 μm poriegrootte	Millipore	GSWP02500
Stootvast buizen, 2 mL	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenisator	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Eiwit Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C kolom	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pomp, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pomp, 1290 Series	Agilent	G4220A
Ventilaandrijving, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratische Pomp, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostaat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Chemisch
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Gegranuleerd	Becton Dickinson	214530	Vaste media bevat 1,5% [w/v] agar
Fosfaat-gebufferde saline (pH 7,4) 10x	Ambion	AM9624	Verdun vers tot 1x met ultra-puur water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; giftig
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	Voor massaspectrometrie, 98%
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterie Stam	Soort	Stam	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicaliën en materialen die worden vermeld, zijn specifiek voor de beschreven methode en omvatten geen standaard laboratoriumchemicaliën of -benodigdheden.