Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert In Vitro

Samenvatting

Wij presenteren een methode om DNA-methylering te kwantificeren op basis van de 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We bepalen de 5-mC niveaus tijdens chondrocyten dedifferentiatie. Deze eenvoudige techniek kan gebruikt worden om snel het chondrocytfenotype in ACI-behandeling te bepalen.

Samenvatting

De dedifferentiatie van hyalinechondrocyten in fibroblastische chondrocyten begeleidt vaak monolaaguitbreiding van chondrocyten in vitro . Het globale DNA-methyleringsniveau van chondrocyten wordt beschouwd als een geschikte biomarker voor het verlies van het chondrocytfenotype. Echter, resultaten op basis van verschillende experimentele methodes kunnen inconsistent zijn. Daarom is het belangrijk om een ​​precieze, eenvoudige en snelle methode vast te stellen om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren tijdens chondrocytedifferentiatie.

Huidige genoomwijdte methyleeringsanalyse technieken vertrouwen grotendeels op bisulfiet genomische sequencing. Door DNA-afbraak tijdens de bisulfietomzetting, hebben deze methoden typisch een groot monstervolume nodig. Andere methoden die gebruikt worden om globale DNA-methyleringsniveaus te kwantificeren, omvatten hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC). HPLC vereist echter volledige vertering van genomisch DNA. Bovendien, de onvoorziene hoge kosten van HPLC inStruments beperkt HPLC's breder applicatie.

In deze studie werd genomisch DNA (gDNA) geëxtraheerd uit menselijke chondrocyten die werden gekweekt met verschillende aantal passages. Het gDNA-methyleringsniveau werd gedetecteerd onder gebruikmaking van een methyleringspecifieke dot blot analyse. Bij deze dot blot-aanpak werd een gDNA-mengsel dat het gemeten DNA bevat dat gedetecteerd werd, direct op een N ⁺ -membraan gezien als een punt in een eerder getekend cirkelvormig sjabloonpatroon. In vergelijking met andere gel-elektroforese gebaseerde blotting benaderingen en andere complexe blotting procedures, bespaart de dot blot methode significante tijd. Daarnaast kunnen dotbots het totale DNA-methyleringsniveau detecteren onder gebruikmaking van een in de handel verkrijgbaar 5-mC-antilichaam. We vonden dat het DNA-methyleringsniveau verschilde tussen de monolaagse subculturen en zou daarom een ​​sleutelrol kunnen spelen bij chondrocytedifferentiatie. De 5-mC dot blot is een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het algemene DNA-methyleringsniveau te detecteren om te evaluerenE chondrocyt fenotype.

Inleiding

Autologe chondrocyt implantatie (ACI) is een relatief nieuwe, state-of-the-art procedure voor het behandelen van articulair kraakbeen defecten ^{1 , 2} . Een van de cruciale stappen in ACI is de amplificatie van chondrocyten via de monolagcultuur in vitro . Tijdens amplificatie verlielen de hyaline chondrocyten hun fenotype gemakkelijk en worden gedifferentieerd, wat ongewenst is voor ACI-behandeling ^{3 , 4} . Om de uitkomst van ACI-behandeling te optimaliseren, moet de mate van chondrocytedifferentiatie worden bepaald voor replantatie. Het is essentieel om een ​​economische en snelle manier vast te stellen om de status van chondrocyten te bepalen. Onlangs heeft de associatie tussen DNA methylatie en chondrocyt dedifferentiatie veel aandacht aangetrokken ^{4 , 5 , 6} . DNA methylering is een proces van whDe methylgroepen worden toegevoegd aan DNA, wat resulteert in de omzetting van cytosine residuen naar 5-methylcytosine (5-mC).

Om de biologie van DNA-methylering bij chondrocytedifferentiatie te verduidelijken, is de eerste stap het DNA-methyleringsniveau van chondrocyten, dat tot nu toe uitdagend is, te evalueren. Bisulfiet genomische sequencing is de meest gebruikte techniek om DNA-methylering ^{7 , 8 te} analyseren. Bij deze analyse veroorzaakt bisulfietomzetting DNA-afbraak en moet dus een substantiële hoeveelheid monster voor de bepaling worden verschaft. Ook is een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gebruikt om de globale DNA-methyleringsniveaus ^{9 , 10 te} kwantificeren. HPLC analyse vereist echter genomische DNA-vertering. Bovendien zijn geavanceerde en dure experimentele instrumenten nodig. Daarom zijn deze experimentele procedures naast de hoge kosten tijdsverschillenuming. Anti-5-mC-antilichamen zijn nu in de handel verkrijgbaar, wat de mogelijkheid tot immuun blotting van 5-mC-bevattend genoom DNA van complexe genen heeft gecreëerd.

In dit rapport hebben we genomisch DNA uit chondrocyten geëxtraheerd in een serie monolagenculturen geëxtraheerd. We gebruikten een dot blot analyse om het 5-mC gehalte in humane chondrocyten met verschillende aantallen passages te evalueren. We hebben geconstateerd dat 5-mC-inhoud is verhoogd in sterk gedifferentieerde chondrocyten in vergelijking met chondrocyten met laagwaardige dedifferentiatie. Daarnaast identificeerden we een relatie tussen dedifferentiatiestatus en 5-mC-niveaus. Tenslotte hebben we gemeld dat de veranderingen in 5-mC-inhoud geassocieerd zijn met het chondrocytfenotype. Daarom is de 5-mC dot blot-analyse een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode om het DNA-methyleringsniveau in chondrocyten te detecteren.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door het Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital.

1. Menselijke Gewrichtskraakbeen Weefsel Verzameling en Chondrocytecultuur

1. Bereiding van materialen
   1. Bereid Dulbecco's gemodificeerde arend medium (DMEM) medium aangevuld met 10% foetaal runder serum en 1% penicilline streptomycine. Bereid 1 mg / ml collagenase II, 0,25% trypsine-EDTA, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en een celzeef (40 μm nylon).
2. Menselijke articulair kraakbeen weefsel collectie
   1. Isolate gewrichtskraakbeen uit de kniegewrichten van donorpatiënten na trauma. Verkrijg geïnformeerde toestemming van alle deelnemers.
   2. Dobbel het kraakbeen in 1-2 mm ³ stukken met een steriele scalpel en verteer chondrocyten uit de gehakte kraakbeen met 1 mg / ml collagenase II in DMEM bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
   3. Filter de resulterende celL suspensie door een celfilter (40 μm) en tweemaal wassen met PBS.
   4. Tel cellen met een hemocytometer en zaad met een dichtheid van 20.000-30.000 cellen / cm2 in DMEM aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS) en 1% penicilline streptomycine.
   5. Cultuur in een incubator bij 37 ° C.
3. Monolayer chondrocyt expansie
   1. Oog-sub-confluente cellen die 0,25% trypsine-EDTA gebruiken en opnieuw platen bij een dichtheid van 6.600 cellen / cm2. Verander het medium tweemaal per week.
   2. Cultuur chondrocyten in monolayers voor maximaal zes passages en beoordelen in de afdelingen 1, 2, 3, 4 en 5.

2. Genomische DNA (gDNA) Extractie

1. Verzamel cellen en resuspendeer in 500 μl lysisbuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / ml RNase A) per 10 miljoen cellen. Resuspen cellen door pipettering en snelle inversie, en incubeer vervolgens gedurende 1 uur bij 37 ° C.
2. EENDd eiwitase K bij een concentratie van 160 μg / ml cellysaat en omkeer het mengsel krachtig. Incubeer 6 uur bij 55 ° C.
3. Voeg een volume Tris pH 7,9 verzadigd fenol toe: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan het monster. Vortex of schud het monster grondig voor ongeveer 20 s.
4. Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 13.000 × g. Verwijder de bovenste waterige fase en laat de laag overbrengen naar een frisse buis.
5. Uittrekken met een gelijke hoeveelheid chloroform om fenol te verwijderen en de bovenste waterige fase over te brengen naar een frisse buis.
6. Neerslaan DNA door 0,1 monstervolume van 3 M natriumacetaat pH 8,0 en 2 volumes 100% ethanol toe te voegen.
7. Bewaar de buis bij -20 ° C 's nachts om het gDNA te precipiteren.
8. Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 16.000 xg tot pellet gDNA.
9. Was het monster driemaal met 70% ethanol en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 2 minuten bij 13.000 x g.
10. Verwijder de supernatanT zorgvuldig en dan luchtdrogen. Resuspendeer het DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. DNA Methylation Profiling

1. Gebruik een DNA-methyleringskit om de bisulfietomzettingsreactie uit te voeren met een totaal van 500 ng van het genomische DNA volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens in 10 μl elutiebuffer (50 ng / μl).
2. Voer het DNA-methyleringprofiel uit met behulp van een commerciele kit volgens het protocol van de fabrikant.

4. Dot Blot Analysis

1. Denatureer het geïsoleerde DNA (1 mg per monster) in 0,1 M NaOH gedurende 10 minuten bij 95 ° C. Neutraliseer het DNA met 1 M NH ₄ OAc op ijs, en verdun vervolgens tweevoudig. Spot 2 μL van het seriële verdunde genomische DNA op een N ⁺ membraan.
2. Zet het membraan bij 80 ° C gedurende 30 minuten.
3. Blok de niet-specifieke antilichaam bindingsplaatsen door het N ⁺ -membraan in 5% BSA in TBS-T gedurende 1 uur aan te slikken. Gebruik een 10 cm Petri-schotel als reactieIonkamer bij kamertemperatuur.
4. Na het wassen van 5 minuten driemaal in TBST, incubeer het membraan met een muis anti-5-methylcytosine (5-mC) monoklonaal antilichaam (1: 1000) in TBS-T bij 4 ° C overnacht.
5. Was het membraan gedurende 5 minuten driemaal in TBS-T en daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam incubatie met HRP-geconjugeerde schaap anti-muis immunoglobuline-G (IgG) (1: 5000) in TBS-T.
6. Was het membraan gedurende 5 minuten driemaal in TBS-T.
7. Voeg het enzym substraat toe aan het membraan en incubeer gedurende 5-10 minuten. Visualiseer het secundaire antilichaam signaal met behulp van een chemiluminescentie kit volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten

Chondrocyten werden gekweekt in een monolaag tot passage 6 (P6). Chondrocyten vertoonden progressieve fenotypische veranderingen met opeenvolgende passages van de monolaagkweek. De P0 chondrocytemorfologie was rond, terwijl de cellen sterk geknipt en plat werden met opeenvolgende passages tot P6 ( Figuur 1 ). Deze morfologische verandering is kenmerkend voor het chondrocyt dedifferentiatie proces. Ondertussen blijkt uit de warmtekaart dat het algemene methyleringsniveau ...

Discussie

Chondrocyten dedifferentiation in vitro compromiseert het resultaat van ACI ernstig in de behandeling van kraakbeen defect reparatie ^{11 , 12} . Om het ACI-resultaat te optimaliseren is het van cruciaal belang om het gebruik van gedifferentieerde chondrocyten ^{13 te} vermijden. Studies hebben aangetoond dat algemeen DNA methyleringsniveau geassocieerd wordt met de mate van chondrocytedifferentiatie ^{4 ,}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
DMEM	Gibco Inc.	11965–092	Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
[header]
Equipment
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE