Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform

Summary

De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.

Abstract

De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van complexe deterministische en stochastische factoren die de ruimtelijke verdeling en de activiteiten van gemeenschapsleden dramatisch kunnen veranderen. We hebben een microwell array platform ontwikkeld dat kan worden gebruikt om tegelijkertijd duizenden bacteriële gemeenschappen snel te monteren en te volgen. Dit protocol benadrukt het nut van het platform en beschrijft het gebruik ervan voor het optisch bewaken van de ontwikkeling van eenvoudige, twee-leden gemeenschappen binnen een ensemble arrays binnen het platform. Deze demonstratie maakt gebruik van twee mutanten Pseudomonas aeruginosa , onderdeel van een reeks mutanten die ontwikkeld zijn om de pathogeniciteit van type VI af te studeren. Chromosomale inserts van either mCherry of GFP genen vergemakkelijken de constitutieve expressie van fluorescerende proteïnen met verschillende emissie golflengten die kunnen worden gebruikt om gemeenschapslid overvloed en plaats binnen elke microwell te controleren. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methoD voor het monteren van mengsels van bacteriën in de putten van de matrix en gebruikmaking van time-lapse fluorescentie beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse om de relatieve groei van elke ledenpopulatie mettertijd te meten. Het zaaien en monteren van het microwell platform, de beeldprocedures die nodig zijn voor de kwantitatieve analyse van microbiële gemeenschappen binnen de matrix, en de methoden die kunnen worden gebruikt om interacties tussen microbiële soorten te ontdekken die allemaal besproken zijn.

Introduction

Microbiële gemeenschappen worden gevormd door zowel deterministische factoren, zoals de structuur van het milieu, en stochastische processen, die samenhangen met celdood, verdeling, eiwitconcentratie, aantal organellen en mutatie ¹ . Binnen de natuurlijke omgeving kan het bijna onmogelijk zijn om de individuele impact van deze invloeden te analyseren op de samenstelling van de gemeenschap en de activiteit. Verduisterd door natuurlijke structuren en begraven in een chemisch en biologisch milieu, is het uitermate uitdagend om de leden van de gemeenschap te identificeren en hun spatiotemporale verdeling verder te oplossen in het natuurlijke milieu. Niettemin hebben recente inspanningen het belang van ruimtelijke organisatie over de gemeenschapsfunctie onderstreept en gewezen op de noodzaak om in beide lopende studies ^{2 , 3 , 4} rekening te houden met zowel de overvloed van de leden als de organisatie.

HetHet is duidelijk dat de lokale chemische omgeving ( dat wil zeggen de beschikbaarheid van voedingsstoffen en secundaire metabolieten), de fysieke structuur ( bijv. Grondarchitectuur, plantaardige wortels, oceaandeeltjes of darmmicrovilli), aanwezigheid of afwezigheid van zuurstof en de introductie van Pathogene soorten hebben allemaal invloed op de samenstelling, de architectuur en de functie van microbiële gemeenschappen ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Niettemin blijven traditionele technieken voor culturen die deze factoren nalaten te vangen, nog steeds overwinnen. Gemeenschapssamenstelling ( bijv. De aanwezigheid van medeafhankelijke soorten), fysieke binding, signaalmolecuulconcentratie en directe cel-celcontact zijn alle belangrijke factoren voor het vormen van een microbiële gemeenschap en kunnen verloren gaan in cOnvruchtbare cultuuromstandigheden. Deze eigenschappen zijn moeilijk te repliceren in een bulk vloeibare cultuur of op een agarplaat. De beschikbaarheid van microfluïdische, micropattering en nanofabricatie technieken die de replicatie van belangrijke fysieke en chemische eigenschappen van natuurlijke omgevingen mogelijk maken, heeft echter veel onderzoekers mogelijk gemaakt om bacteriële gemeenschappen te bouwen om hun interacties ^{12 , 13 , 14} te bestuderen en om synthetische omgevingen te ontwikkelen die Naboots natuurlijke omstandigheden ^{4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} .

Dit protocol beschrijft een methode om een ​​microwell array-apparaat te fabriceren en gedetailleerde experimentele procedures die kunnen worden gebruikt om de functie te functionaliserenE putten in de matrix en bacteriën groeien, zowel als enkel-species kolonies en in multi-lid gemeenschappen. Dit werk laat ook zien hoe bacteriën die zijn gemodificeerd om fluorescerende reporter eiwitten te produceren, gebruikt kunnen worden om de bacteriële groei binnen de putjes te monitoren over de tijd. Een soortgelijke matrix werd eerder gepresenteerd en toonde aan dat het mogelijk is om de groei van enkel-species kolonies van Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) in microwellen te volgen. Door de grootte van de put en de zadedichtheid te moduleren, kunnen de startomstandigheden van duizenden groeivergronden parallel worden gevarieerd om te bepalen hoe de initiële inoculatieomstandigheden het vermogen van de bacteriën om te groeien beïnvloeden ²¹ . Het huidige werk maakt gebruik van een licht gewijzigde versie van de microwell array die op het vorige werk bouwt door de simultane vergelijking van meerdere arrays mogelijk te maken en door een robuuster experimenteel protocol te gebruiken. De array die in dit werk wordt gebruikt bevat meerdere subarrays, of array ensemBles, die wells van verschillende afmetingen bevatten, variërend van 15 tot 100 μm in diameter, die op drie verschillende plaatsen ( dwz 2x, 3x en 4x de brede diameter) zijn aangebracht. De arrays worden geëtst in silicium en de groei van de bacteriën die in de siliconenrails worden gezaaid, wordt geactiveerd door de arrays te verzegelen met een deklaag die is bekleed met een middellangige agarosegel. P. aeruginosa mutanten die ontworpen zijn om het type VI secretiesysteem te bestuderen worden in deze demonstratie gebruikt.

De hier gepresenteerde resultaten bouwen naar het uiteindelijke doel van het analyseren van multimember gemeenschappen binnen microwell arrays, waardoor onderzoekers de overvloed en de organisatie van bacteriën in situ kunnen controleren, terwijl de chemische omgeving wordt gecontroleerd en gecontroleerd. Dit zou uiteindelijk inzichten moeten geven in de "regels" die de ontwikkeling en opvolging van de gemeenschap regelen.

Protocol

1. Silicon Microwell-array Fabrication

1. Parylene coating
   1. Deponeren tussen 1-1,5 μm parylene N op siliciumplaten met gebruik van een in de handel verkrijgbaar parylene bekledingssysteem volgens de specificaties en instructies van de fabrikant (instellingen: Vaporizer setpoint = 160 ° C; Ovnstellingspunt = 650 ° C).
      OPMERKING: Ongeveer 6 g parylene N geladen in een kamer geeft coatings 1-1,5 μm dik.
2. fotolithografie
   1. Spin-coat de parylene N-gecoate wafers met adhesie promotor, 20% hexamethyldisilazaan (HMDS) en 80% propyleenglycol monomethylether acetaat (PGMEA) (zie de tabel van materialen ) bij 3000 rpm gedurende 45 s. Vul een 2 ml transferpipette met adhesiepromotor en strooi het over de gehele wafel. Laat de wafel ongeveer 10 seconden zitten voordat het droog wordt.
   2. Vul een 2 ml transferpipette met positief naarNe fotoresist (zie de Tafel van Materialen ) en geef de fotoresist in het midden van de wafel. Spin bij 3.000 rpm gedurende 45 s om een ​​resist coating te geven die ongeveer 1,5 μm dik is.
   3. Zacht-bak de monsters op een kookplaat bij 115 ° C gedurende 1 minuut.
   4. Gebruik een contact-aligner en fotomasker met het gewenste velpatroon om het monster bloot te stellen aan ultraviolet licht. De spin-coated wafer door het patroonfotomask gedurende 6 s blootstellen, waardoor een geschatte dosis van 60-80 mJ / cm2 wordt gemeten bij 365 nm.
   5. Ontwikkel het patroon door het monster in ontwikkelaar (<3% tetramethylammoniumhydroxide in water te onderdompelen, zie de Tabel van Materialen ) gedurende 2 minuten. Spoel met DI water en droog met schone, droge stikstof.
      OPMERKING: De gebieden van fotoresist die aan UV blootgesteld worden, moeten tijdens de ontwikkeling worden opgeheven.
3. Reactief ionen etsen
   1. Gebruik een zuurstof plasma ets om de blootgestelde paryleen te verwijderenHelemaal naar het siliconen substraat.
      OPMERKING: Het recept kan gemoduleerd worden om de etsnelheid van het parylene te wijzigen. Voor paryleen diktes tussen 1 en 5 μm, gebruik een recept met 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O ₂ , 10 W RF en 2.000 W ICP op een gereedschap Reactive Ion Etching (RIE). Na het etsen en verwijderen van de blootgestelde parylene laag, moet het patroongebied ( dat wil zeggen de blootgestelde silicium) glanzend en zilver uitzien.
   2. Gebruik een diep RIE (DRIE, bv. Bosch DRIE) etsproces om in de silicium te etsen.
      OPMERKING: De ets rate en duur bepalen de putdiepte. Een volledige cyclus van het Bosch-proces (een 3 s-afleverstap: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C ₄ F ₈ , 10 W RF en 1,750 W ICP gevolgd door een 10 s etch-proces: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF ₆ , 8 W RF en 1,750 W ICP) komt overeen met ongeveer 1 μm etsdiepte. De putten die in deze demonstratie worden gebruikt, variëren van 3 tot 3,5 μm diep.
   3. VVerifieer de etsdiepte met behulp van fysieke profilometrie.
      1. Laad het monster in een fysieke profilometer (zie de Tabel van Materialen ).
      2. Zet het monster vacuüm in en druk op de handmatige belastingknop.
      3. Focus het systeem op het monster door op de "Focus" knop te drukken. Plaats een passende functie voor meting op het scherm.
      4. Scan het monster. Niveau het profiel en meet de functiediepte.
      5. Noteer de ets rate en modelleer de daaropvolgende etstijden om de gewenste diepte te bereiken.
         OPMERKING: De metingen omvatten de diepte van de siliciumput, de dikte van de gedeponeerde parylene en de dikte van de fotoresist. Het controleren van de dikte van elke laag gedurende de gehele procedure is noodzakelijk om de juiste diepte te bereiken.

2. Bacteriële Cultuur en Zaaien ( Figuur 1a )

1. Begin kolonies op Luria Broth (LB) agarplaten uit glycerolvoorraden en gebruik binnen twee weken. Kies kolonies van de gewenste stammen van LB-agarplaten en begin de nachtelijke culturen van P. aeruginosa. Incubeer de overnachtende culturen gedurende ongeveer 18 uur bij 37 ° C terwijl u bij 220 rpm in R2A medium schudt.
   OPMERKING: Kolonies moeten binnen twee weken plating worden geplukt om ervoor te zorgen dat de mutaties en fluorescerende reportergen behouden blijven. Alle P. aeruginosa-werkzaamheden moeten onder BSL-2-omstandigheden worden uitgevoerd.
2. Gebruik een diamant schrijver om de siliconenwafel in de afzonderlijke chips te plaatsen die de ensembles van verschillende maten en pitch-well arrays bevatten. Zorg ervoor dat elke chip de volledige aanvulling van de groottes en afmetingen bevat voor de studie.

Figuur 1: Fabricage- en celzaadprocedure. (A) Microwell arrays aOpnieuw geëtst in siliconenwafels bedekt met een dunne laag parylene (i). Om de putjes nat te maken en / of te functioneren, wordt een eiwitoplossing toegevoegd in een druppel bovenop de arrays (ii). De eiwitoplossing wordt verwijderd, de wafels worden gedroogd en een nieuwe oplossing die de gewenste bacteriën bevat, wordt toegevoegd (iii). De bacteriële oplossing wordt na een incubatieperiode verwijderd en de wafers laten drogen, waardoor bacteriën in de putjes en op het oppervlak achterblijven (iv). De oppervlak-geassocieerde bacteriën worden verwijderd met parylene lift-off, waardoor bacteriën die in de microwells schoon zijn gezet, nog steeds levensvatbaar zijn door het 2% glycerolmedium, waardoor de putjes gehydrateerd worden (v). De siliciumchips worden dan op een kant van de agarose gel-beklede glazen deklaag geplaatst, die bacteriële groei in de microwellen voedt (vi). ( B ) Lay-out van sub-arrays op een enkel silicium apparaat. Elke sub-array bevat een reeks identieke putten. De diameter van de microwells over alle sub-aRrays variëren in diameter van 5-100 μm en zijn georganiseerd op 2x, 3x of 4x de diameter van de diameter van de diameter, die wordt aangeduid door de witte tot donkergrijze kleuren op het schematische onderpaneel. Wanneer de putdiepte ondiep is (<10 μm), zijn de 5 en 10 μm bril diameters zelden nuttig, doorgaans door een gebrek aan cellen die deze zeer kleine putjes koloniseren. In dit werk werden alleen de gegevens uit putten met 15-100 μm diameters geanalyseerd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Zoals blijkt uit Figuur 1b bevat een complete chip sub-arrays van putten, met een diameter tussen 5 en 100 μm, met drie verschillende toonhoogtes ( dwz 2x, 3x en 4x de diameter) die 4 keer herhalen.

3. Plaats een 150 μL druppel van 500 μg / ml Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS oplossingBovenop de matrix om de microwellen te nat. Incubeer de BSA-oplossing gedurende 1 uur op de chip bij RT in een vochtige kamer.
   1. Creëer de kamer door de bodem van een lege pipette tip box te vullen met Fosfaatbufferde Zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Andere stoffen, zoals specifieke lectines, kunnen in plaats van BSA worden gebruikt om het oppervlak van de microwellen te functionaliseren.
4. Terwijl u siliciumchips incubateert met BSA-oplossing, centrifugeer de culturen bij 2.500 rpm (overeenkomend met gemiddeld 950 xg) gedurende 5 minuten en zet ze vervolgens opnieuw in 500 μl vers R2A medium met 2% glycerol.
   1. Bepaal de OD van de cultuur met behulp van een UV-vis spectrometer bij 600 nm. Pas het aan op een OD van 0,02 met 2% glycerol R2A medium.
      OPMERKING: De glycerol helpt om te voorkomen dat de putjes uitdrogen tijdens parylene lift-off.
5. Na incubatie, verwijder de BSA oplossing en spoel 3x met PBS door de vloeistofdruppel te verwijderen en te vervangenT die de siliconen microwell array bedekken. Droog onder stikstof.
6. Voeg 150 μl 0,02 OD culturen toe aan elk van de droge arrays die in een vochtige kamer zijn geplaatst. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C om de bacteriën toe te laten aan de putmuren.
   OPMERKING: Koeling is niet nodig voor incubatie. De incubatietijd van 4 ° C kan worden gebruikt om de groei van bacteriën te voorkomen voordat beeldvorming begint, zodat men de ruimtelijke organisatie van de gemeenschappen voor de groei kan visualiseren. Ruimte-temperatuur incubatie kan ook worden gebruikt. Beide protocollen resulteren in vergelijkbare groeicurven.

3. Microscoop Opstelling

1. Voordat u de bacteriële incubatie op de siliciumchips start, zet u de milieuzorgkamer op de verhoogde omgeving (zie de tabel van de materialen) aan en pas de instellingen op het bedieningspaneel aan zodat de vochtigheid (~ 100%) en de temperatuur (30-32 ° C, zie stap 3.2) kunnen evenwichten voordat u monsters toevoegt.
2. Niveau de monsterhouder en lijn de inTerior rond het monster met PBS-geweekte laboratoriumdoekjes (zie de Tafel van Materialen ) om de vochtigheid in de kamer naar dauwpunt te verhogen. Stel de temperatuur van de kamer op 30 ° C en die van de kamerklep tot 32 ° C om condensatie op het beeldvlak te verminderen.
   OPMERKING: De glijhouder past in de levende celkamer met een pakking die ongeveer 1 cm dik is. De monsterhouder wordt geëgaliseerd met behulp van een bubbelniveau dat bovenop de monsterhouder wordt geplaatst. De steekproefhouder kan lichtjes worden gekanteld en in de pakking verzegeld blijven worden.
3. Terwijl culturen op de siliciumchips incuberen, moet u de stopschakelaar voor de kwiklamp minstens 30 minuten handmatig inschakelen voor afbeelden. Schakel de camera en geautomatiseerde microscoopstadia handmatig in. Open de software die gebruikt wordt om de microscoop en randapparatuur te bedienen en zorg ervoor dat de apparatuur door de software wordt herkend.
   OPMERKING: Vergroting is 10X met NA = 0.3.

4. Voorbereiding van agarose bedekte glazen dekjes

1. Magnetron voorheen bereid agarose oplossingen ( dwz 2% agarose in R2A medium) tot een vloeibare toestand is bereikt, ongeveer 60 s.
2. Vouw de achterkant van een 75 mm x 22 mm, # 1.5 glazen deksel met ethanol en plaats deze in de lengte, centraal, over een glazen glijbaan van 2 x 3 "(50 x 75 mm). Plaats twee PDMS afstandhouders (dikte van ~ 1 mm) Langs de lange randen van de deklip en verplaats de glazen deklip zodat ongeveer 1 mm van de deklip de rand van de glijbaan overhangt.
3. Giet 5 ml vloeibare agarose-oplossing bovenop de glazen deklaag, net genoeg om het volledig te bedekken en plaats een tweede 2 x 3 "glazen glijbaan bovenop de montage om de vloeibare agar tussen de deksel en de glijbaan te" sandwichen ".
   OPMERKING: Hiermee wordt de diepte van agarose geregeld, waardoor de totale dikte van de deklaag en geharde agarose gelijkwaardig is aan de PDMS-afstandhouders.
4. Laat de glazen glazen glijglas-glijslip-agarose-glazen glijmiddel toe totdat de agarose-oplossing begint te stollen; Vervolgens overbrengen naar een koelkast. Verwijder na 15 minuten de overmatige vaste agarose en snijd de glazen deklaag om. Verplaats deze naar een schone gerecht en plaats het in de koelkast tot het gebruik.

5. Afdichting van de putten met een Agarose-coated Overlap en Imaging

1. Nadat de incubatieperiode van de bacterie is voltooid, verwijder de agarose bedekte deklaag uit de koelkast en berei de siliciumchips als volgt op.
   1. Doe de siliciumchips in ultracure water, een voor een, voor 10 s elk. Zet ze op hun randen op een lab wipe of weefsel totdat de meeste overmaat vloeistof uit de randen van de chips is gedronken.
   2. Snijd een stukje tape om de randlengte van elke siliciumchip aan te passen. Plaats de band op de parylene die het silicium bekleedt en gebruik het om de parylene coating snel af te spoelen.
   3. immedIedere geschilde chip in ieder omdraaien en plaats elke chip zodanig dat de microwell-array zijde (en contact maakt met) de agarose-gecoate zijde van een agarose bedekte deklaag. Zorg ervoor dat u de chip niet verplaatst of verplaatst nadat het aan de agarose raakt om de groei van bacteriën buiten de putjes te voorkomen.
2. Plaats de gemonteerde microwell array / agarose coverlip in de schuifhouder van de scene-top milieucontrole kamer op de miscroscope.
   1. Gebruik omgevingslicht of gericht licht ( bijv. Een zaklamp) om interessante arrays te lokaliseren. Gebruik de commerciële software die de geautomatiseerde fase controleert om deze posities op te slaan (zie de tabel van materialen). Zet het omgevingslicht of het aanstuurlicht uit nadat de posities zijn opgeslagen.
   2. Open de "ND Acquisition" paneel in de commerciële software.
      OPMERKING: Dit paneel bevat een menu voor automatisch opslaan naar een specifieke map, evenals programmeerbare beeldverwerving. Voor deze experimenten, Worden de "Tijd", "XY" en "λ" menu's gebruikt.
   3. Om de locaties in de software op te slaan, klik op het menu 'XY' en controleer vervolgens een leeg vak aan de linkerkant voor elke positie die moet worden opgeslagen. Klik ook op de knop "Inclusief Z".
3. Verkrijg beelden over de tijd op de gewenste golflengten en 10 vergrotingen met behulp van de juiste fluorescentiefilterblokken (zie de Tabel van Materialen).
   1. Gebruik de besturingssoftware en opgeslagen arrayposities om naar elke opgeslagen locatie te gaan en op de putjes te concentreren. Klik op elke XY locatie in de opgeslagen lijst en pas de focus aan met behulp van het Green Flourescence Protein (GFP) filter. Bewaar de nieuwe z-positie door op de pijl te klikken die naar de z-locatie wijst.
      OPMERKING: dit proces kan tijdrovend zijn. Overweeg het voorzorgsmaatregelen om de winst te verhogen en het neutrale dichtheidsfilter te gebruiken om de lichtintensiteit te verminderen om fotobakken te voorkomen.
   2. Bepaal de z-asafstand tussen brandpunten voor elke golflengte door het verschil in de z-aspositie op te nemen wanneer deze op het oppervlak van de array is gericht. Kies 2-3 locaties uit de matrix met de gemengde rode / groene bacteriënpopulatie en focus met behulp van het RFP-filter (Red Fluorescence Protein).
      1. Trek de afstand tussen de brandpunten af ​​met behulp van de GFP- en RFP-fluorescentiefilters en voeg die focal plane-aanpassing toe onder het menu "λ".
         OPMERKING: Als de array bijvoorbeeld wordt geconcentreerd in het GFP-kanaal op een z-locatie van 50 μm, en dezelfde array in het RFP-kanaal wordt weergegeven op 55 μm, voeg dan +5 naast de RFP optische configuratie in de "λ "Menu.
   3. Begin de tijdverwerving van het beeldverhaal.
      OPMERKING: Voor de hier getoonde experimenten werden RFP- en GFP-afbeeldingen voor elke arraypositie met intervallen van 30 minuten verkregen met behulp van multi-dimensional image acquisition via een commerciële software die controleertDe camera, de sluiter, het filterwiel en het gemotoriseerde podium.
      1. Stel het interval in op 30 minuten en de "duur van het experiment" tot 24 uur onder het menu "Tijd". Klik op 'Nu uitvoeren'.
         OPMERKING: Met het vak 'Tijd', 'XY' en 'X' wordt het programma verplaatst naar elke locatie ( dwz de opgeslagen XYZ-locaties), een afbeelding in één golflengte verplaatst, de z-positie verplaatst Om rekening te houden met focal plane verschillen ( dwz lambda of golflengte controle), neem de tweede afbeelding, ga verder naar de volgende array locatie (multipoint) en loop dit met 30 minuten intervallen (time-lapse).
4. Verkrijg beelden voor verlichtingscontrole.
   OPMERKING: Gebruik de menu's "ND Acquisition," "Time" en "XY" om afbeeldingen van 4 locaties te maken, 25x elk.
   1. Neem een ​​serie van 100 "darkfield" afbeeldingen door alle lichtbronnen uit te schakelen en te nemenEen "afbeelding" van een standaard dia. Deze beelden zullen camera geluid opnemen. Gebruik de langste belichtingstijd die wordt gebruikt tijdens de timelapse (stap 5.3.3).
   2. Neem een ​​serie van 100 "verlichtingsveld" afbeeldingen door een standaardglijbaan ( dwz uniforme RFP of GFP-intensiteit) op een paar verschillende locaties af te beelden om de ongelijke verlichting bij de gegeven experimentele omstandigheden vast te leggen. Kies een belichtingstijd die het signaal maximaliseert zonder verzadiging te bereiken.

6. Analyse

1. Bewerk de beeldstapels met behulp van een beeldanalysesoftware ( bijv. ImageJ).
   1. Omzetten van de overgenomen beelden naar tiff-bestandsformaat met behulp van de commerciële software. Upload afbeeldingen in de beeldanalysesoftware door op "Bestand"> "Import"> "Beeldsequentie" te klikken.
   2. Maak een "Correctiebeeld" door alle "darkfield" en "illumination field" afbeeldingen te berekenen. aftrekkingT het gemiddelde "darkfield" beeld van het gemiddelde "verlichtingsveld" beeld door "Process"> "Image Calculator" te kiezen. Selecteer de twee afbeeldingen, "Image1" en "Image2" en vervolgens "Subtract" in het veld "Operation". Klik op 'OK'.
      1. Voor een gemiddelde, laad de correctie (of darkfield) afbeeldingen, klik op "Afbeelding"> "Stacks"> "Z Project"> "Gemiddelde Projectie."
   3. Voer beeldregistratie indien nodig uit. Vervolgens, voer achtergrondaftrekking uit door te klikken op 'Process'> 'Achtergrond trekken'. Voer een straal in (bijvoorbeeld 125) in het veld "Radius" en selecteer "Sliding Paraboloid."
   4. Voer verlichtingscorrectie uit met behulp van 'Process'> 'Calculator Plus'. Kies de volgende parameters: operation, divide; I1, goed beeld; I2, correctiebeeld; K1, correctiebeeld betekenen; En k2, 0. Klik op "CreAt New Window. "
      OPMERKING: Deze dataset heeft geen registratie nodig, maar in andere werkzaamheden werd de ImageJ Plugin StackReg gebruikt bij de "Vertaling" -transformatie. Voor de achtergrondaftrekking gebruikt u dezelfde schuifparaboloidstraal voor elke beeldset. Bijvoorbeeld, als de grootste bronnen die zijn afgebeeld, een pixelradius hebben van 100, gebruik dan een straal groter dan 100 ( bijvoorbeeld 125) voor elke beeldset.
2. Bepaal de groei van elke stam in de microwells.
   1. Selecteer regio's van interesse (ROI's) rond elke microwell in de gewenste arrays met behulp van de ImageJ "MicroArray" plugin.
      1. Klik in het menu "MAP" op "Reset Grid." Geef rijen, kolommen en diameter op (op basis van de putgrootte en het aantal op de array; zie figuur 1b ). Selecteer 'cirkel' in het menu 'ROI-vorm'.
      2. Houd de "Alt" -toets ingedrukt terwijl u de bovenste linker ROI selecteert met de muis om t te verplaatsenHij ROI array. Houd de "shift" toets ingedrukt terwijl u de linker ROI selecteert om de grootte van de array te wijzigen. Houd de "shift" -toets ingedrukt terwijl u een ROI selecteert van de rechterkant van het array, maar niet aan de hoeken om de afstand van de ROI's te wijzigen.
      3. Gebruik de bovenstaande opdrachten om de ROI-array over de putjes in een afbeelding te passen. Klik op 'Meet RT'.
         OPMERKING: De plugin exporteert de gewenste metingen van elke ROI. Gebruik drie ROI-maten, waardoor concentrische ringen rond de putjes worden gecreëerd om lokaal het achtergrondsignaal te verzamelen ( dwz het signaal van de middelste ring die van de buitenste ring afgetrokken is) en fluorescentiemetingen ( dwz het signaal van de binnenring).
   2. Verzamel de gegevens in een spreadsheet software en bereken het achtergrondsignaal. Importeer het naar een aangepaste scripting software voor verdere analyse.
3. Gegevensorganisatie en analyse
   1. Importeer de gegevens en organiseer de gegevensVerzameld in ImageJ in een matrix in de volgende volgorde voor alle tijden: kolom 1, sub-array nummer; Kolom 2, goed rij; Kolom 3, goed kolom; Kolom 4, gemiddelde intensiteit; Kolom 5, achtergrondintensiteit; En kolom 6, gemiddelde intensiteit - achtergrondintensiteit.
      1. Scheid de resultaten van de mCherry en GFP acquisitie in verschillende matrices. Sla de resultaten op van elke sub-array en elke kleur in een andere cel in een cel array.
         OPMERKING: Deze organisatie maakt het eenvoudiger om tussen beeldgegevens en meetresultaten te bewegen, de gegevens te reinigen en ervoor te zorgen dat de metingen de data accuraat vertegenwoordigen.
   2. Pas voor de autofluorescentie van P. aeruginosa .
      OPMERKING: In experimenten waarbij de co-cultuur van GFP- en mCherry-stammen wordt betrokken, moet een mCherry-only chip geanalyseerd worden om de relatie tussen mCherry en groene autofluorescentie te bepalen.
      1. Plot het mCherry-versus-GFP signaal van alle mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 putten te allen tijde-punten om de relatie tussen het mCherry-signaal en de autofluorescentie in het GFP-kanaal te bepalen. Trek het autofluorescentiesignaal van de co-culturen af.
   3. Plot de trajecten en pas een gewijzigde logistieke vergelijking aan elk traject toe om parameters te extraheren met de minste vierkanten die passen in een spreadsheetsoftware of een aangepaste scriptsoftware.
   4. Zoek naar correlaties tussen en tussen GFP en mCherry traject parameters.

Results

Het hier gepresenteerde experimentele platform is ontworpen voor high-throughput en high-content studies van bacteriële gemeenschappen. Het ontwerp maakt het mogelijk om duizenden gemeenschappen, die groeien in putten van verschillende maten, tegelijkertijd te analyseren. Met dit microwell-array-ontwerp kan de afhankelijkheid van de uiteindelijke gemeenschaps samenstelling op de initiële zaaddichtheid, de grootte van de put en de chemische omgeving worden bepaald. Dit werk demonstreert d...

Discussion

In dit artikel werd een microwell array-apparaat en experimentele protocollen gepresenteerd die een hoge-doorvoer en een hoogwaardige analyse op basis van live-cellen op basis van de analyse van de bacteriële gemeenschap mogelijk maken. Terwijl de focus van de demonstratie hier was om de effecten van contactgemedieerde type VI-secretie op gemeenschapsontwikkeling te bestuderen, werden de arrays ontworpen om flexibel te zijn en tegemoet te komen aan de studie van een breed scala aan microbiële gemeenschappen en microbe-m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Parylene N	Specialty Coating Systems	CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater	Specialty Coating Systems	Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550μm dikte, Prime, 10-20 resistiviteit, N/Phos<100>,
adhesion promoter	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 adhesie promotor
postive tone photoresist	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Eigendom van Dow)	Microposit S1818 Positieve Fotoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool	Oxford Instruments	Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth	TEKnova	R0005
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Multimode Plate Reader	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
Automated Stage	Prior	ProScan III
CCD camera	Nikon	DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip	Nexterion	High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides	Ted Pella	2273
Physical Stylus Profilometer	KLA Tencor	P-6
lab wipes	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss
filter cubes	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)