Methodenartikel

Kwantificering van buikpigmentatie in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55732

⸱

1 juni 2017

 , 
1Department of Biology, Lake Forest College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pigmentatie is een morfologisch eenvoudig maar zeer variabel kenmerk dat vaak adaptieve betekenis heeft. Het heeft uitgebreid gediend als model om de ontwikkeling en evolutie van morfologische fenotypes te begrijpen. Abdominale pigmentatie in Drosophila melanogaster is bijzonder handig, zodat onderzoekers de loci kunnen identificeren die onderling en intraspecifieke variaties in morfologie liggen. Tot op heden is echter D. melanogaster buikpigmentatie grotendeels kwalitatief geanalyseerd, door middel van scoren, in plaats van kwantitatief, welke de vormen van statistische analyse beperken die op pigmentatiegegevens kan worden toegepast. Dit werk beschrijft een nieuwe methodologie die het mogelijk maakt om verschillende aspecten van het abdominale pigmentatiepatroon van volwassen D. melanogaster te kwantificeren . Het protocol bevat voorbeeldmontage, beeldopname, data-extractie en analyse. Alle software die wordt gebruikt voor macro-opnames en analysemogelijkhedenGeschreven voor open-source beeldanalyse. Het voordeel van deze aanpak is het vermogen om pigmentatiekenmerken nauwkeurig te meten met behulp van een methodologie die zeer reproducteerbaar is over verschillende beeldvormingssystemen. Hoewel de techniek is gebruikt om variatie in de tergal pigmentatiepatronen van volwassen D. melanogaster te meten , is de methodologie flexibel en breed toepasbaar op pigmentatiepatronen in veel verschillende organismen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pigmentatie toont een enorme fenotypische variatie tussen soorten, populaties en individuen, en zelfs bij individuen tijdens ontogenie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Hoewel er veel studies zijn over pigmentatie in een grote verscheidenheid aan dieren, is pigmentatie wellicht het beste bestudeerd in Drosophila melanogaster , waar de volledige kracht van de moleculaire genetica is gebruikt om de ontwikkelings- en fysiologische mechanismen die pigmentatie regelen en hoe deze mechanismen evolueren 1 toe te lichten , 6 . Er is veel bekend over de genen die de biochemische synthese van pigmenten regelen in D. melanogaster 7 , 8 en de genen die de temporale en ruimtelijke diVerdeling van deze biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Bovendien heeft genetische mapping de genetische loci onderliggende intra- en interspecifieke verschillen in pigmentatie in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 geïdentificeerd . De relaties tussen pigmentatie en pleiotropische eigenschappen, zoals gedrag 18 , 19 en immuniteit 19 , 20 , zijn ook onderzocht, evenals de adaptieve betekenis van pigmentatiepatronen 15 , 21 , 22 . Als zodanig is pigmentatie in D. melanogaster ontstaan ​​als een krachtige maar simpele mOdel voor de ontwikkeling en evolutie van complexe fenotypes.

Pigmentatie in volwassen D. melanogaster wordt gekenmerkt door verschillende melanisatiepatronen over het lichaam, met name op de vleugels en dorsale thorax en buik. Het is de pigmentatie van elke cutikulaire plaat (tergiet) op de dorsale buik, maar dat heeft de meeste onderzoeks aandacht gekregen. Er is aanzienlijke variatie in deze pigmentatie ( Figuur 1A -F ), door beide genetische 17 , 23 en milieu 24 , 25 factoren. De kutikula van een buiktergiet bestaat uit voorste en achterste ontwikkelingscompartimenten ( Figuur 1G ), die elk verder onderverdeeld kunnen worden, afhankelijk van pigmentatie en versiering 26 . Het voorste compartiment bevat zes kutikulaTypen (a1-a6), en het achterste compartiment omvat drie (p1-p3) ( figuur 1G ). Van deze worden de p1-, p2- en a1-kutikula typisch gevouwen onder de tergiet in onuitgespreide abdomenen, zodat ze verborgen zijn. De betrouwbare zichtbare kutikula wordt gekenmerkt door een band met zware pigmentatie, hierna aangeduid als een pigmentband, bestaande uit kutikeltypes a4 (harig met matige borstels) en a5 (harig met grote borstels), met de achterste rand van de band Meer intensief gepigmenteerd dan de voorste rand ( figuur 1G ). Voorkant van deze band is een gebied van licht gepigmenteerde harige kutikula, die achterste achterkant (a3) ​​maar niet anterior (a2) heeft. Variatie in pigmentatie tussen vliegen wordt waargenomen in zowel de intensiteit van pigmentatie als in de breedte van de pigmentband. In het algemeen is variatie het grootste in de meest achterste segmenten (abdominale segmenten 5, 6 en 7) en is lager in de meer anterior segmenten (buikzeeGents 3 en 4) 24 . Verder is er een seksuele dimorfie in D. melanogaster pigmentatie, waarbij mannen meestal volledig gepigmenteerde vijfde en zesde buiktergieten hebben ( Figuur 4C ).

In de meeste studies van buikpigmentatie in D. melanogaster is pigmentatie behandeld als een categorische of ordinale eigenschap, waarbij het patroon kwalitatief 27 , 28 , 29 of semi-kwantitatief wordt gemeten op een schaal 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Deze methoden hebben onvermijdelijk een gebrek aan precisie, en omdat ze vertrouwen op de subjectieve beoordeling van pigmentatie, is het moeilijk om de gegevens over studies te vergelijken. Verscheidene auteurs hebben de ruimtelijke dimensies van pigmentatie 38 , 39 gekwantificeerd, de intensiteit van pigmentatie van een bepaald kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 of de gemiddelde intensiteit van pigmentatie over de buiktergiet als geheel 41 , 42 , 43 . Desalniettemin meet deze kwantificatiewerkwijzen echter niet de intensiteit en de ruimtelijke verdeling van buikpigmentatie tegelijkertijd en derhalve niet de nuances van hoe pigmentatie varieert over de abdOminale tergiet Verder vereisen verscheidene van deze kwantificatiewerkwijzen 38 , 41 , 42 , 43 de dissectie en montage van de buikspieren. Dit is zowel tijdrovend en vernietigt het monster, waardoor het niet meer beschikbaar is voor aanvullende morfologische analyses. Aangezien het begrip van de ontwikkeling en evolutie van buikpigmentatie verdiept, zullen meer geavanceerde hulpmiddelen nodig zijn om snel en nauwkeurig zowel de ruimtelijke verdeling als de intensiteit van pigmentatie te meten.

Het algemene doel van deze methode is het gebruik van digitale beeldanalyse om een ​​replicabele en nauwkeuriger maatregel van de buikpigmentatie in D. melanogaster te verkrijgen . De methodologie omvat drie fasen. Ten eerste is de volwassen vlieg niet destructief gemonteerd en wordt een digitaal beeld van de dorsale buik genomen. Ten tweede, met behulp van een ImageJ macro, de gebruikerDefinieert een anterior-posterior strook pixels die zich uitstrekken van de voorkant van de a2-cuticle naar de achterkant van de a5-cuticle (groene doos, figuur 1G ) op zowel de derde als vierde buikspijkers. De gemiddelde pixelwaarde over de breedte van deze strip wordt vervolgens langs zijn lange as geëxtraheerd, waardoor een profiel wordt verkregen dat de ruimtelijke verdeling en intensiteit van pigmentatie vastlegt als het van de voorste naar de achterkant van de tergiet verandert. Ten derde wordt een R-script gebruikt om het pigmentatieprofiel wiskundig te beschrijven met behulp van een kubieke spline. Het R-script gebruikt dan de spline en zijn eerste en tweede afgeleide om de breedte van de a2-a5-kutikula, de breedte van de pigmentband en de maximale en minimumpigmenten van pigmentatie te extraheren. De methode kent dus zowel de ruimtelijke eigenschappen als de diepte van de buikpigmentatie.

Deze methodologie kwantificeert de pigmentatie van de derde en vierde abdominale tergieten,Die de focus zijn geweest van tal van eerdere studies 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ofwel uitsluitend of in combinatie met meer posterior tergieten. Hoewel minder variabel dan de vijfde en zesde abdominale tergieten, zijn de derde en vierde tergieten niet helemaal gepigmenteerd bij mannen, dus dit protocol kan zowel bij mannen als vrouwen worden toegepast. Desalniettemin, zoals hier getoond, kan het protocol worden gebruikt om pigmentatie in de vijfde en zesde buiktergieten bij vrouwen te meten. Bovendien moeten kleine wijzigingen van de scripts die gebruikt worden om de eigenschappen van het pigmentatieprofiel te extraheren, de methode toestaan ​​om de variatie in pigmentatie in een grote verscheidenheid aan andere te kwantificerenorganismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Proefmontage

OPMERKING: Bewaar dood vliegen in 70% ethanol in water voor afbeelden.

  1. Giet 10 ml 1,25% agar opgelost in kokend water in een 60 mm x 15 mm Petri-schotel en laat het instellen.
  2. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een paar fijnpuntenpincen om een ​​~ 20 mm ong, 2 mm brede, 1 mm diepe groef in het oppervlak van de gel te maken. Gebruik fijne pincet, installeer de ventrale zijde van een volwassen vlieg in de groef, met de dorsale kant van de vlieg die boven de gel uitsteekt.
    OPMERKING: De loslating van de gel zorgt voor makkelijke herpositionering zonder het monster te beschadigen. De zelfde groef kan voor meerdere exemplaren gebruikt worden, hoewel het vies, ongebruikelijk en onbruikbaar zal worden met de tijd. De gebruiker kan dan een andere groef in dezelfde gel maken. Elke plaat kan worden gebruikt om af te beelden ~ 200 vliegen.
  3. Dek het monster volledig in 70% ethanol in water om alle lichtreflecties van het wasachtige kutikula te verminderen en om vleugelschade te vermijdenSpecimen manipulatie.

2. Microscoop Setup

OPMERKING: Beelden worden verworven met behulp van een dissecterende scope, overgebrachte lichtbasis, digitale camera en gooseneck-koude lichtbron die is aangesloten op een computer die de besturingssoftware voor het besturen van beelden verhaalt. Software-instructies zijn specifiek voor Micro-Manager v1.4.20 44 , dat is een open source software die ImageJ 45 bevat .

  1. Zet de microscoop, digitale camera, dubbele gooseneck koude lichtbron en computer aan.
  2. Voer de image capture software uit om een ​​Micro-Manager venster en een ImageJ venster te openen. Klik in het ImageJ venster op "Afbeelding"> "Type"> "8-Bit" om alle beelden als 8-bit te zetten. Klik in het venster Micro-Manager op 'live' om een ​​venster 'Snap / Live' te openen met een real-time preview van de camera.
    1. Maximaliseer de grootte van het venster "Snap / Live" als neecessary. Selecteer "Grijstinten" in het vervolgkeuzemenu "Beeldschermmodus" op het tabblad "Contrast" van het venster Micro-Manager.
  3. Zet de koude lichtbron op tot de maximale intensiteit en plaats de uiteinden van elke gooseneck tot ongeveer 120 mm van het podium, een aan de linkerkant en een aan de rechterkant.
    OPMERKING: Gebruikers kunnen ook een ringverlichting gebruiken, hoewel dit een ring van gereflecteerd licht kan genereren rond de vliegbuik.
  4. Stel de microscoopvergroting handmatig in op 60X zodat het zichtveld een gebied van ongeveer 3 mm in diameter op het podium vastlegt.
  5. Plaats een micrometer van 2 mm op het podium (indien nodig verandert de achtergrond naar wit). Terwijl u naar de live-voorvertoning kijkt, richt u op de podium-micrometer en past u de belichting in het Micro-Manager-venster aan door de belichtingstijd in ms in het vak 'Belichting' in te voeren.
  6. Om de camera ruimtelijk te kalibreren, selecteert u het gereedschap "rechte lijn" in tHij ImageJ venster en teken een lijn de lengte van de podium micrometer. Klik in het venster ImageJ op 'Analyse'> 'Schaal instellen' om het venster 'Schaal instellen' te openen, voer de lengte van de micrometer in μm in het vak 'Bekende afstand' in en voer 'μm' in de 'Lengte eenheid' doos.
    1. Zorg dat het venster 'Set Scale' dan de schaal toont in 'pixels / μm'. Noteer de schaal en klik op 'OK'.
  7. Klik in het venster 'Snap / Live' op 'Stop' en dan 'Snap' om een ​​beeld van de podiummicro-meter vast te leggen.
  8. Sla de afbeelding op als een 8-bits grijsschaal TIFF om ervoor te zorgen dat de beelden eventueel opnieuw kunnen worden gehercalibreerd. Klik in het ImageJ-venster op 'Bestand'> 'Opslaan als'> 'Tiff ...' Specificeer waar het bestand in de bestandsbrowser moet worden opgeslagen, geef het bestand een naam en klik op 'Opslaan'.
  9. Schakel het podium in zwart en plaatsEen Petri schotel met een vlieg gemonteerd in agar (stappen 1.1-1.2) op het podium.
  10. Kijk door de microscoop en plaats de vlieg om ervoor te zorgen dat de dorsale middenlijn rechtop om het pigmentatiepatroon het beste te bekijken. Verplaats alle vleugels en bijlagen om ervoor te zorgen dat het zicht op de buik onbelemmerd is. Als de gepigmenteerde cuticle (a2-a5) niet zichtbaar is, druk de buik lateraal totdat het is (hoewel de buik van de vliegen in 70% ethanol in waterreeks is opgeslagen, zodat dit gewoonlijk niet nodig is).
    OPMERKING: Bij het positioneren van de vlieg mag de gebruiker een lagere vergroting (20X) gebruiken. De vergroting moet teruggestuurd worden naar 60X voordat u verder gaat.
  11. Handmatig richten op de dorsale buik van de vlieg. Pas de tips van de lichtbron handmatig aan om de schaduwen en reflecties op de dorsale buik te minimaliseren.
  12. Terwijl u naar het live voorbeeld op het computerscherm kijkt, en met het pixelwaardehistogram op het tabblad 'Contrast' in het Micro-Manager-venster,Pas de belichting aan zoals beschreven in stap 2.4 om het bereik van de pixelwaarden van het voorbeeldbeeld te maximaliseren.
  13. Verwijder de vlieg- en Petri-schotel en vervang ze met een LED (spectrale uitgang van 430-660 nm) die is verbonden met een spanningsmeter, in de stand van de weergave in dezelfde positie als de vlieg. Gebruik de LED en spanningsmeter als een lichtmeter 46 en record de spanning die wordt gegenereerd door het licht dat op de LED raakt (~ 125 mV).
    OPMERKING: De LED- en spanningsmeter worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het lichtniveau constant blijft in meerdere beeldsessies binnen een enkel experiment.
  14. Verplaats de positie of intensiteit van de lichtbron, de vergroting van de microscoop of de belichting van de camera niet langer gedurende de duur van het experiment.

3. Specimen Imaging

  1. Plaats een Petri schotel met een vlieg gemonteerd in agar (stappen 1.1-1.3) op de zwarte microscoop stage.Adjusteer de positie van de vlieg zodat de derde en viertDe buikspieren zijn zichtbaar en de dorsale middellijn is rechtop, zoals beschreven in stap 2.9. Zorg ervoor dat de vergroting 60x is voordat u verder gaat.
  2. Zet de microscoop handmatig op zodanig dat de derde en vierde dorsale buiktergieten in focus zijn. Gebruik de software voor het maken van beelden om een ​​afbeelding te verkrijgen als een 8-bits grijsschaal TIFF, zoals beschreven in stap 2.6.
    OPMERKING: Het beeld kan in kleur worden vastgelegd en vervolgens omgezet in grijstinten voor analyse.
  3. Sla de afbeelding op als "SESH000_sampleID.tiff", zoals beschreven in stap 2.7.
    OPMERKING: hier is [SESH] constant, [000] is het sessienummer en is variabel maar moet drie cijfers lang zijn en [sampleID] is wat de gebruiker wenst, hoewel het geen extra onderstreeptekens (_) moet bevatten en Moet van constante lengte zijn. [SampleID] moet gegevens bevatten over de factoren die worden gebruikt bij de analyse van de pigmentatiegegevens ( bijv. Temperatuur of afstamming), gescheiden door een onderscheidend niet-alfabetischCal karakter, zoals een streepje (-). Hiermee kunnen deze factoren gemakkelijk worden uitgebracht uit [sampleID] met behulp van standaard statistische software.
  4. Verwijder de Petri schotel uit het podium en vervang de vlieg met het volgende monster. Herhaal stap 3.1-3.3 totdat alle exemplaren zijn afgebeeld, zonder de verlichtingsniveaus, vergroting of blootstelling verder aan te passen.

4. Imaging over meerdere sessies

  1. Als afbeeldingen over meerdere sessies moeten worden overgenomen, behoudt u de lichtintensiteit, de belichting en de vergroting over de sessies. Controleer aan het begin van elke sessie de ruimtelijke kalibratie van de camera (stap 2.4) en de lichtintensiteit op het podium (gemeten door de LED / spanningsmeter, stap 2.12).
  2. Vang en bewaar een afbeelding van de podiummicro-meter (stappen 2.5-2.7) om ervoor te zorgen dat de beelden opnieuw kunnen worden geherruimteerd, indien nodig.
  3. Gebruik tenminste 15 controlespecifieken en willekeurig opnieuw in elke sessie om ze allo te herstellenW voor het opsporen en elimineren van sessie effecten. Zorg ervoor dat dubbele controle-exemplaren tussen sessies dezelfde [sampleID] maar verschillende [SESH000] hebben.
    OPMERKING: De controlespecies zijn vliegen verzameld, opgeslagen en gemonteerd identiek aan experimentele exemplaren, maar worden over de hele sessie opnieuw weergegeven. Het precieze aantal controle-exemplaren hangt af van de experimentele setup van de gebruiker. Zie de discussie voor verdere details.

5. Beeldanalyse

OPMERKING: Beeldanalyse wordt uitgevoerd in ImageJ 45 en gebruikt de macro 'Meting of Pigmentation.ijm', die als aanvullend bestand wordt geleverd.

  1. Plaats alle afbeeldingen die geanalyseerd moeten worden in dezelfde map.
  2. Start ImageJ en voer de macro 'Meting of Pigmentation.ijm' door op 'Plugins'> 'Macro'> ​​'Run' te klikken en selecteer 'Meting of Pigmentation.ijm' in de bestandsbrowser en klik op 'Open."
    OPMERKING: Alle volgende stappen zijn binnen de macro. Elke stap is een individueel macro commando.
  3. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster 'Action Required' wordt geopend, met vermelding 'Kies de map waar afbeeldingen worden opgeslagen'. Klik op "OK" en gebruik de bestandsbrowser om de map die de afbeeldingen bevat te selecteren en klik vervolgens op "kies".
  4. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster 'Action Required' wordt geopend waarin wordt aangegeven: 'Kies de map waar u de gegevens wilt opslaan'. Klik op "OK" en gebruik de bestandsbrowser om de gewenste map te selecteren voor het opslaan van de pigmentatieprofielen. Klik op 'kies'.
  5. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vraag 'Hoeveel karakters in uw voorbeeld-id?' Voer in het gegevensinvoervak ​​het aantal karakters in [SampleID] in, zoals aangegeven in stap 3.3, en klik op "OK".
  6. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vraag 'Hoe groot is uw ROI?' Voer in de gegevensinvoerbox de pixelbreedte van de voorste-Posterior strip waarlangs het pigmentatieprofiel moet worden gelezen (groene rechthoek, Figuur 1G , Figuur 2A en 2A '). Klik op "OK;" De standaardwaarde is 20 pixels.
    OPMERKING: Het pigmentatieprofiel wordt gelezen over een strookje cuticle, in plaats van een lijn, om geluid te verminderen door haar en borstels. De breedte van deze strip hangt af van de resolutie van het beeld, maar het zou moeten zijn ~ 1/20 van de breedte van de buik, in pixels.
  7. Merk op dat de macro het beeld van de eerste vlieg zal openen en in een dialoogvenster wordt gevraagd of de huidige vlieg moet worden gemeten (klik op "Ja"), om verder te gaan naar de volgende vlieg (klik op "Nee") of om de Macro (klik op "Annuleren").
  8. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vermelding "De middenlijn van de dorsale buik definiëren, van ANTERIOR naar POSTERIOR." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Teken een lijn van voor naar achterkantOm de middellijn van de dorsale buik te definiëren. Klik op "OK;" Zie figuur 2A en 2A ', gele lijn.
    OPMERKING: dit wordt gebruikt om de afbeelding te heroriënteren zodat de dorsale middenlijn horizontaal over het scherm ligt, met de linker voorzijde, waardoor de volgende stappen makkelijker worden.
  9. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vermelding "Definieer de POSTERIOR rand van Tergite 4 net achter de pigmentband." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Trek een lijn van de achterste middenlijnrand naar de rechterzijkant, zodat het midden van de lijn (gemarkeerd door een wit vierkant) net achteraf ligt aan de achterkant van de pigmentband (snijband a5). Klik op "OK;". Zie figuur 2A en 2A ', magenta lijn.
    OPMERKING: Het R- script detecteert automatisch de achterste rand van de pigmentband uit het pigmentatieprofiel.
  10. Merk op dat een dialoogVakje zal open staan ​​met vermelding "Definieer de ANTERIËRE rand van Tergite 4 aan de voorkant van de gepigmenteerde kutikula (a2)." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Trek een lijn van de voorste middenlijnrand naar de rechter-laterale rand, zodat het middelpunt van de lijn (gemarkeerd met een wit vierkant) aan de voorkant van de gepigmenteerde kutikula (cuticle a2) zit. Klik op "OK;". Zie figuur 2A en 2A ' , cyaanlijn.
    OPMERKING: Het R- script zal dit punt definiëren als de voorste rand van de gepigmenteerde kutikula van de tergiet. Op de afbeelding geeft de macro de regio van belang (ROI) weer waarna het pigmentatieprofiel wordt gelezen (groene rechthoek, Figuur 2A en 2A ', vergroot in Figuur 2B en 2B '). De macro zal ook een tweede venster openen met het pigmentatieprofiel voor de ROI ( Figuur E 2C en 2C '), waarbij de x-as de positie is, uitgedrukt als het aantal pixels van de achterste rand van het profiel en de y-as is de gemiddelde pixelwaarde in elke positie.
  11. Bekijk de percelen van het pigmentatieprofiel dat door de macro wordt geopend. Klik indien nodig op 'Live' in het profielvenster om de positie van de ROI aan te passen, zodat er geen structuren zijn (bijvoorbeeld borstels) die het pigmentatieprofiel zouden beïnvloeden. Zodra het profiel bevredigend is, klik op "OK".
  12. Herhaal stappen 5.8-5.11 voor Tergite 3.
    OPMERKING: De macro exporteert dan de pigmentatieprofielen als twee CSV-bestanden, elk met de naam "SESH000_samplename_TX_profile.csv," waar [SESH000_samplename] de afbeeldingnaam is en [TX] is respectievelijk T3 of T4 voor respectievelijk de derde en vierde tergieten.
  13. Merk op dat de macro de volgende afbeelding opent. Herhaal stappen 5.7-5.13 tot alle beelden zijn geanalyseerd.
Jove_title "> 6. Data Preprocessing, Analysis en Session Correction

OPMERKING: Alle data analyse wordt uitgevoerd in R 47 en gebruikt het script 'Analysis of Pigmentation.R'. Hieronder geeft "L ..." aan op welke regel (en) van het script voor elk deel van de analyse moet worden uitgevoerd. Zie de aanvullende informatie voor meer informatie over de wijze waarop de analyse wordt uitgevoerd.

  1. Bewerk het R- script om de werkmap (L6) in te stellen en het filepath te definiëren in de map die de.csv-profielen (L11) bevat.
  2. Voer L13-15 uit om een ​​lijst te maken van de pigmentatieprofielen die in de profielmap zijn opgeslagen.
  3. Load and run de functies "lezer" en "addPrimaryKey" (L17-41) om de profielen in een enkel gegevensframe te lezen.
  4. Bewerk het script bij L43 om de ruimtelijke kalibratie van de afbeeldingen in μm / pixels te specificeren, zoals bepaald in stap 2.5.
  5. Load and run de "adjusTments "-functie (L46-58) om de profielpositie (x-as, Figuur 2C en 2C ') van pixels-van-posterior-edge-of-ROI naar μm-van-voor-rand-of-ROI en de Profielwaarde (y-as, Figuur 2C en 2C ') van de pixelwaarde (0 = zwart, 255 = wit) naar de pigmentatiewaarde (0 = geen pigment, 255 = maximum pigment).
  6. Load and run de functie "spline.der.er" (L60-71) om de kubieke spline van de pigmentatieprofielen te genereren en de eerste en tweede derivaten ervan ( Figuur 2D -2F en 2D '- 2F ').
  7. Load en voer de functies "coördinaten" en "assmbly.coord" (L74-163) uit, om eerst de positie van de achterste (T3) en de voorste (T2) randen van de pigmentband te trekken ( Figuur 2D en 2D ';) En de achterste rand van de a2-kutikula (T1, Figuur 2D en 2D ') en vervolgens de maximale ( Pmax ) en minimale ( Pmin ) pigmentatiewaarden, respectievelijk bij respectievelijk T3 en T1.
    OPMERKING: De voorkant van de a2-cuticle is al in stap 5.9 gedefinieerd.
  8. Optioneel: Load and run de functie "chek" (L165-175) om te controleren of de functie "coördinatie" de posities T 1-3 goed herkent voor een willekeurig geselecteerd pigmentatieprofiel.
  9. Laad en voer de index- en statistische functies (L178-193) om een ​​gegevenstabel te genereren met de rubrieken 'Session', 'Sample', 'Tergite', 'id' (een concatenatie van Sample en Tergite), 'P max ' "P min ", "W band " (breedte van de pigmentband, = T3 - T2) en "W tergiet " (breedte van de gepigmenteerde cUtikels a2-a5, = T3).
  10. Load en voer de "correctie" functie (L196-234) in om een ​​data tabel te genereren die Pmax en P min registreert voor eventuele overlastfactoren die voortkomen uit sessie-effecten. Gebruik de gemiddelde toename (of daling) in P max of P min van de controle-monsters die opnieuw worden weergegeven over tijdelijk aangrenzende sessies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol werd gebruikt om het effect van de opslagtemperatuur op buikpigmentatie te onderzoeken. Uitgaande onderzoeken hebben aangetoond dat een toename van de ontwikkelingstemperatuur resulteert in een afname in de verspreiding van buikpigmentatie in verschillende soorten Drosophila , waaronder D. melanogaster 30 , 32 . Specifiek, in buiktergieten 3 en 4 neemt de mate van pigmentatie (breedte van de pigment...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methodologie zorgt voor de precieze, snelle en herhaalbare verwerving van pigmentatiegegevens in een kwantitatieve vorm die geschikt is voor meerdere downstream analyses. De methode is gebruikt om gegevens over het effect van temperatuur op buikpigmentatie in een isogene lijn vliegen te verwerven. De methodologie kan echter gebruikt worden in voorwaartse genetische studies om genen die onderliggende pigmentatieverschillen tussen individuen, populaties of soorten, of omgekeerde genetische studies zijn, te identifice...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, verleent IOS-1256565 en IOS-1557638 aan AWS. We bedanken Patricia Wittkopp en drie anonieme recensenten voor hun nuttige opmerkingen over een eerdere versie van dit artikel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dumont #5 Biology ForcepsFST11252-30
AgarSigma-Aldrich5040
Dissecting ScopeLeicaMZ16FA
BaseLeicaMDG41
CameraLeicaDFC280
Gooseneck Cold Light SourceSchottACE 1
Image Acquisition Control SoftwareMicro-Manager v1.3.20https://micro-manager.org/
Image Analysis SoftwareImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis SoftwareR 3.3.2https://www.r-project.org/
LEDThor LabsLEDWE-15
MultimeterFlukeFluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dishCelltreat Scientific Products229663
Stage micrometerKlarman Rulings, Inc.KR-867

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526(2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163(2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63(2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30(2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181(1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179(2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beeldanalysemonsterbevestigingpigmentatiekwantificeringtergietanalysemacroprotocolethanolonderdompelinggrijswaardenbeeldvormingobjectglasmicrometer

Gerelateerde artikelen