Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Samenvatting

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Hier beschrijven we een protocol om te evalueren van sarcoplasmic reticulum Ca^{2 +} reserve en diastolische calcium functie voor het verwijderen in cardiomyocytes door een calcium imaging systeem.

Samenvatting

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Cardiale sarcoplasmic reticulum (SR) fungeert als een Ca^{2 +} reservoir voor contractie, welke reuptakes intracellulaire Ca^{2 +} tijdens ontspanning. De SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractibility, en de verwijdering van intracellulaire Ca^{2 +} is essentieel voor de diastolische hartfunctie. Onder sommige pathofysiologische aandoeningen, zoals diabetes en hartfalen, kunnen verminderde calcium mijnen en SR Ca^{2 +} winkel in cardiomyocytes worden betrokken in de voortgang van cardiale dysfunctie. Hier beschrijven we een protocol om SRCa^{2 +} reserve en diastolische Ca^{2 +} verwijdering te evalueren. Kortom, een enkele cardiomyocyte werd enzymatisch geïsoleerd en de intracellulaire Ca^{2 +} fluorescentie aangegeven door Fura-2 werd opgenomen door een calcium imaging systeem. Gebruiken cafeïne voor inducerende totale SR Ca^{2 +} release, vooraf wij een automatische perfusie schakelaar programma interlinking het stimulatie en de perfusie-systeem. De mono-exponentiële curve-fitting werd vervolgens gebruikt voor het analyseren van verval tijd constanten van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten. Dienovereenkomstig, de bijdrage van de SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) en Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX) te verwijderen van de diastolische calcium werd geëvalueerd.

Inleiding

Intracellulair calcium ([Ca^{2 +}]_ik) recycling speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes¹. Zoals we weten, initieert de calcium-geïnduceerde Ca^{2 +} release de excitatie-contractie koppeling, die vertalen het elektrische signaal naar contractie. Membraan depolarisatie activeert de sarcolemmal L-type Ca^{2 +} kanalen, die ertoe Ca^{2 bewegen +} van de SR in het cytoplasma via ryanodine receptoren 2 (RyR2 vrijwaart). De tijdelijke verhoogde cytoplasmatische Ca^{2 +} initieert samentrekking van myofibrils. Tijdens de diastole, cytoplasmatische Ca^{2 +} is reuptaken in de SR door middel van de SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) en gepompt uit de cardiomyocyte via de nb⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX)². Dit proces leidt tot contractie-ontspanning recycling in de cardiomyocyte.

De cardiale SR is een netwerk van intracellulaire membraan dat de contractiele machines omringt. Het fungeert als een Ca^{2 +} reservoir voor contractie, en het reabsorbs intracellulaire Ca^{2 +} tijdens ontspanning. De SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractility. Ondertussen, de verwijdering van intracellulaire Ca^{2 +} is essentieel voor cardiale diastole. Sommige pathofysiologische omstandigheden, zoals diabetes en hartfalen, verminderde Ca^{2 +} inklaring en depressief SR Ca^{2 +} kan winkel in cardiomyocytes worden betrokken in het proces van cardiale dysfunctie^{2,3 ,4}.

Voor het meten van SR Ca^{2 +} release en diastolische Ca^{2 +} verwijdering in cardiomyocytes, er zijn twee veelgebruikte methoden: de integriteit van de NCX huidige gebaseerd op patch-clamp^5,6, en de cafeïne-geïnduceerde Ca ^{2 +} pulse gebaseerd op Ca^{2 +} fluorescentie imaging^7,8,9. De voormalige aanpak hangt af van het feit dat de Ca^{2 +} vrijgelaten uit de Slowaakse Republiek grotendeels uit de cel door NCX gepompt is. Deze aanpak wordt echter beperkt door de eis van geavanceerde apparatuur en bekwame bediening. In de huidige studie beschrijven we een handige aanpak om te beoordelen van SR Ca^{2 +} reserve en Ca^{2 +} verwijdering in myocytes door het meten van een cafeïne-geïnduceerde Ca^{2 +} puls op basis van een Ca^{2 +} fluorescentie imaging systeem. Kort, intracellulaire Ca^{2 +} fluorescentie wordt aangegeven door Fura-2. Door koppeling van de stimulatie systeem en perfusie systeem, presenteren we een programma voor het schakelen van de perfusie en pacing systeem automatisch. 10 mM cafeïne werkte te snel bewegen totaal Ca^{2 +} release in de SR. De exponentiële afname tijd-constanten zijn (Tau) van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten zijn verkregen van mono-exponentiële curve passend, die de bijdrage van de SERCA en NCX aan diastolische Ca^{2 +} verwijdering dienovereenkomstig weerspiegelen.

Protocol

alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij experimentele Research Center, China Chinese medische academie en Zhejiang Universiteit.

1. bereiding van de oplossing

1. bereiden alle oplossingen zoals beschreven in tabel 1.

2. isolatie van links ventriculaire (LV) Cardiomyocytes

Opmerking: LV cardiomyocytes zijn geïsoleerde enzymatisch met behulp van een Langendroff perfusie systeem zoals eerder beschreven ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Opzetten van de Langendroff perfusie systeem. Vul de perfusie-systeem met normale Tyrode (NT) oplossing, de temperatuur vastgesteldop 36,5 ° C en elimineren alle luchtbellen in de buis.
2. Wegen en anesthetize van een rat Sprague-Dawley door intraperitoneale injectie (ip) van Chloraalhydraat (400 mg/kg). De verdoving status bevestigen door de beoordeling van de staart of teen snuifje reactie na 5 min.
3. Open de buikholte onder de xiphoid process met een chirurgische scissor, heffen de xiphoid process, en open de borst met de schaar. Verwijderen van het hartzakje, iets til het hart met een gebogen Tang, identificeren van de aortaboog en afgesneden van het hart door de schaar in de hoofdmap van de aorta.
4. Het hart overbrengen in een schotel van 60 mm en wassen met NT oplossing. Houd de aorta met twee micro-ontrafeling pincet, mounten op de canule Langendorff perfusie en vervolgens stevig het afbinden van de aorta naar de canule met behulp van chirurgische hechtingen.
   Opmerking: Een geschoolde operator kan eindigen dit proces binnen 15 s.
5. Perfuse het hart met 30 mL NT om te herstellen van de omloop van de kransslagaderen. Schakel het perfusaat tot 30 mL Ca ^{2 +}-vrije Tyrode oplossing (10 mM Taurine, 1 mg/mL BSA) om te stoppen met de hartslag. Vervolgens schakelen het perfusaat Collagenase A isolatie oplossing (0,6 mg/mL) voor een enzym vertering.
   NB: Gebruik Collagenase A voor experimenten met diabetische ratten of Collagenase II voor experimenten zonder diabetesratten.
6. Na vertering voor 20-25 min, snel omzetten in de perfusie-oplossing de Ca ^{2 +}-vrije Tyrode oplossing om te stoppen verdere vertering. Houdt het hart met een tang, afgesneden van de canule en het hart in een 35-mm-schotel met KB oplossing te plaatsen (Zie tabel 1).
7. Ontleden de LV muur met een schaar en pincet. Afgesneden van het atrium, rechterventrikel en Atrioventriculaire junction gebied. Het resterende weefsel is de LV; Breng dit in een nieuwe 35-mm schotel met KB oplossing. Het LV-weefsel in kleine stukjes gehakt.
8. Voorzichtig de stukken met een gefilterde kunststof druppelaar Pipetteer en resuspendeer in 10 mL KB oplossing.
9. Filteren de cellen met 150 µm diafragma RVS filter, en overdracht aan een centrifugebuis 15 mL. Centrifugeer bij 150 x g gedurende 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de myocytes in 10 mL KB oplossing, gratis regelen voor 6 min, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL KB oplossing.
   Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd bij 36 ° C in oplossingen vergast met 100% O ₂.

3. Calcium herinvoering

1. na afwikkeling van gedurende 20 min. in KB oplossing, verwijder het supernatant en resuspendeer de myocytes met calcium herinvoering oplossing A (0.3 mM Ca ^{2 +}, 4.5 mL Ca ^{2 +}-gratis Tyrode oplossing, 1,5 mL NT oplossing) voor 10 min.
2. Herhaal de bovenstaande procedure met calcium herinvoering oplossing B (0.3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-gratis Tyrode oplossing, 3 mL NT oplossing).
3. Herhaal de bovenstaande procedure met NT oplossing (1.2 mM Ca ^{2 +}) voor het zuiveren van de beschikbare myocytes. De geïsoleerde LV myocytes worden opgeslagen in deze oplossing en bestuderen ze binnen 4-6 h.

4. Set Up van perfusie System

1. verbinden de instroom-buis met de NT oplossing voor kamer perfusie ( figuur 1A).
2. Voor naald perfusie van het target-myocyte, sluit u de multi vat spruitstuk tip (b.v., perfusie potlood, hierna potlood voortaan), opgelost in de micromanipulator, aan de klep gecontroleerde perfusie systeem. NT oplossing en 10 mM cafeïne oplossing toevoegen aan elke kolom van het potlood ( figuur 1A).
3. Luchtbellen in de buizen om te voorkomen dat de lucht blokkade evacueren.
4. Het aantal infuus van de micron tip het potlood voor 10 s, en het handmatig aanpassen van de regulator van de stroom de stroom om snelheid te houden met een geschatte snelheid van 3 infuus/10 s.

5. Metingen van intracellulaire Ca ^{2 +} Transiënten- en verkorting van de Sarcomeer ^{7 , 8 , 9}

1. Pipetteer 10 µL celsuspensie op de dia cel getallen tellen door een teller van de cel onder de Microscoop en de dichtheid te berekenen. Verdun myocytes een geschatte concentratie van 50.000 cellen/mL.
2. Toevoegen de Fura-2 acetoxymethyl (AM) voorraad (een calcium gevoelige kleurstof) in een 1 mL suspensie van myocytes om de uiteindelijke concentratie aan 2 µM. houden in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
3. Centrifuge bij 150 g voor 30 s en resuspendeer de cardiomyocytes met NT oplossing 2 keer.
4. Zet het licht uit en houden van de cellen in het donker. Plaats de myocytes in de zaal van de perfusie gedurende 15 minuten. Start de kamer perfusie (1,5 mL/min) met NT oplossing. De myocytes tempo met 1 Hz veld stimulatie met behulp van een stimulator (Golf duur 4.0 ms, pulse amplitude 8.0 V) voor 5 min.
5. Selecteer een myocyte met goede vorm (vorm van de staaf, scherpe rand en schakel kruis strepen) en stabiele gestimuleerd kramp (geen spontane samentrekking) onder de 10 x microscopische objectief. Vervolgens de microscopische zoomfactor wijzigen tot 40 x en draaien van de oriëntatie van de camera CCD om te houden van de myocyte in een horizontale positie.
6. Frame de één myocyte door de cel framing-adapter aan te passen. Zorg ervoor dat de achtergrond duidelijk.
7. Bloot de myocytes aan het licht dat wordt uitgestraald door een Xenon lamp, met 340 of 380 nm golflengte excitatie filters, en beeld de myocytes via een 40 x doelstelling. Detecteren van fluorescentie signaal op 510 nm. In de tussentijd, noteer de Sarcomeer lengte wijzigingen van de myocytes en registreren met behulp van de soft-edge-module tegelijk.
8. Record fluorescentie door een dual-excitatie fluorescentie fotomultiplicator systeem. Voer het opnameprogramma voor het calcium imaging systeem, klikt u op " bestand/nieuw bestand " een nieuwe opnamebestand te maken, en klik op de " start " knop synchroon fluorescentie en Sarcomeer recordlengte.

6. Beoordeling van SR Ca ^{2 +} Reserve en diastolische Ca ^{2 +} functie voor het verwijderen ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink de " Aux Out " haven in de stimulator met de " analoog In " poort op het ventiel controlesysteem (b.v., de bevelhebber van de klep, Zie Tabel van materialen) door een BNC-kabel (om te synchroniseren de TTL-signaal).
2. Preset een programma voor het schakelen van de perfusie-kleppen automatisch als eerder beschreven ^{8 , 9}; Gedetailleerde stappen voor operatie worden vermeld als volgt.
   1. Preset de parameters in de klep controle software volgens tabel 2, en klikt u op de " Download " knop voor het downloaden van de volgorde in het programma geladen. Klik op de " Triggeh " knop om de trigger functie.
      Opmerking: Het controlesysteem van de klep kan de volgorde uitvoeren na ontvangst van de TTL-signaal.
   2. Definitie van de stimulator aan reeks mode en stel de parameters volgens tabel 3.
3. Instellen de stimulator op " S1 stap " aan het tempo van de LV beginnen myocytes op 1 Hz. de perfusie van de naald op de snelheid van 1,5 mL/min met NT oplossing.
   Opmerking: Omdat de snelheid van de naald-stream sneller dan zaal perfusie is, de lichtbreking van de naald-stream is anders dan de lichtbreking van kamer perfusie. Het verschil van licht breking geeft aan het aantal effectieve naald perfusie, die de target myocyte omringt.
4. Selecteer een doel-myocyte onder de microscopische weergave van laag vermogen (in de volgorde van stroomafwaarts naar upstream) en zorg ervoor dat het kan worden bereikt door de micro-punt van het potlood. De Microscoop vergroting naar 400 x wijzigen Draaien van de oriëntatie van de camera CCD om te houden van de myocyte in de horizontale positie. De rechthoekige opening onder de cel framing adapter op een geschikte venster dat wordt gevuld met de myocytes aanpassen. Ervoor zorgen dat er minimale achtergrond; andere myocytes of dode cel puin in dit venster niet toegestaan.
5. Pas de positie van het potlood vast op de micromanipulator, en zorgvuldig plaats de micro tip op de afstand van de straal van de target myocyte veld visie onder 400 x Microscoop vergroting.
6. Aanpassen van het bereik van de stream naald zodat het meestal betrekking hebben op de target myocyte en ervoor te zorgen dat de myocyte kan niet worden weggevaagd door de naald stroom.
7. Na 60 s fundamentele pacing, roll de cursor van de stimulator aan de " D2 stap ".
   Opmerking: De rest van protocol zal automatisch worden uitgevoerd door de stimulator- en controlesysteem van de klep. Op basis van de bovenstaande instelling, het protocol kan automatisch worden uitgevoerd zoals in figuur 2A, 1 Hz fundamentele pacing met NT oplossing voor 60 s. Vervolgens onderbreken pacing en vertraging voor 2 s, snel overschakelen naar 10 mM cafeïne perfusie voor 15 s (functioneel om vrij te geven Ca ^{2 +} opslag in de SR), en ga vervolgens terug naar NT oplossing.
8. Aan het einde van de opname, detecteren de fluorescentie van de achtergrond voor individuele myocytes. Klik op de " onderbreken " knop als u wilt onderbreken het bestand opnemen, de microscopische weergave verplaatsen naar een nabijgelegen leeg gebied. Klik op de " record " knop om de opname te hervatten seconden, en het opnemen van numerieke 340 en 380 nm intensiteitswaarden voor achtergrondcorrectie.
9. Open de " bewerking/constante " dialoogvenster en vul de waarden in de " achtergrond " vormen, respectievelijk; de software Fura 2 verhouding waarden door af te trekken van de achtergrond kunt corrigeren.

7. Data analyse ⁹

1. voor metingen van calcium Transiënten en Sarcomeer verkorten de fundamentele pacing stadium, het gemiddelde van de kramp pulsen en vervolgens analyseren dynamische parameters, zoals calcium transiënten, de tijdconstante van calcium voorbijgaande verval (Tau-1 Hz), met behulp van de software automatisch.
   Opmerking: Als de software het verval segment niet goed past, exporteert u de daling trace voor handmatige mono-exponentiële curve-fitting.
2. Voor cafeïne geïnduceerde calcium pulsen, selecteert u alleen de pols met een steile Golf voor analyse van de functie voor het verwijderen van calcium. Uitsluiten van de cellen met de signaal verstoring, abnormale hartslag of die weg midway stroomde.
3. Meten van de amplitude van de cafeïne-geïnduceerde calcium pols (Ca-cafeïne, een index van SRCa ^{2 +} reserve).
4. Verkrijgen van de constante voor cafeïne geïnduceerde calcium pulse (Tau-cafeïne) het verval door mono-exponentiële curve passend (10 s duur) handmatig uit de software ( figuur 2C).

Resultaten

Hier, we illustreren streptozotocin (STZ) - geïnduceerde diabetesratten (DM) en leeftijd-matched Sprague - Dawley (SD) ratten bijvoorbeeld. 8-week-oude mannelijke SD ratten (200 ± 20 g) ontving een enkele intraperitoneale injectie van STZ (70 mg/kg, ip) voor de DM groep of citraat buffer voor de controlegroep. Een week na toediening van de STZ, ratten met bloedglucose > 16.7 mmol/L diabetische werden beschouwd. Na 8 weken werden de LV myocytes enzymatisch geïsoleerd. Na de herintroduc...

Discussie

Calcium flux vrijgelaten uit de SR is de belangrijke Ca^{2 +} bron voor systole in het hart. Zekere hoogte, de amplitude van SR Ca^{2 +} inhoud en de fractionele Ca weerspiegelen^{2 +} vrijgelaten uit de SR de SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor cardiale contractie. Aan de andere kant, hangt de Ca^{2 +} reserve voor SR af van het vermogen van SR Ca^{2 +} reuptake, Ca^{2 +} lekken van SR en hun balans over de SR tijdens de diastole^12,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutamic	Alfa Aesar	A15031
Taurine	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436