Methodenartikel

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

DOI:

10.3791/55812

⸱

14 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integratie Site (IS) analyses zijn een kritisch onderdeel van de studie van retrovirale integratie sites en hun biologische betekenis. In recente retrovirale gentherapie studies zijn IS-assays, in combinatie met sequentie van volgende generatie, gebruikt als een cel-tracking tool om clonale stamcelpopulaties te identificeren die dezelfde IS delen. Voor de nauwkeurige vergelijking van repopulerende stamcelklonen binnen en over verschillende monsters, zijn de detectiegevoeligheid, data reproduceerbaarheid en hoge doorvoercapaciteit van de assay een van de belangrijkste analysekwaliteiten. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol- en data-analyse workflow voor bidirectionele IS analyse. De bidirectionele assay kan tegelijkertijd zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse vector-gastheerverbindingen ordenen. Vergeleken met conventionele unidirectionele IS sequencing benaderingen, verbetert de bidirectionele aanpak de detectiesnelheden van IS en de karakterisering van integratie gebeurtenissen aan beide einden van tHij richt zich op DNA. De hier beschreven gegevensanalysepijplijn identificeert en noemt identieke IS-sequenties door meerdere stappen van vergelijking die de kaart IS sequenties op het referentiegenoom en sequentiefouten bepalen. Met behulp van een geoptimaliseerde testprocedure hebben we onlangs de gedetailleerde repopulatiepatronen van duizenden Hematopoietische Stamcellen (HSC) klonen gepubliceerd na transplantatie in rhesus macaques, die voor het eerst het exacte tijdspunt van HSC-repopulatie en de functionele heterogeniteit van HSC's in de Primaat systeem. Het volgende protocol beschrijft de stap-voor-stap experimentele procedure en data-analyse workflow die identieke IS sequenties nauwkeurig identificeert en kwantificeert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retrovirussen zetten hun genomische DNA in het gastheergenoom op verschillende plaatsen in. Deze unieke eigenschap, die kan bijdragen tot de ontwikkeling van kanker en andere vormen van virale pathogenese, heeft het ironische voordeel dat deze virussen zeer toegankelijk zijn voor cellulaire engineering voor gentherapie en basisbiologisch onderzoek. De virale integratieplaats (IS) - de locatie op het gastheergenoom waarin een vreemd DNA (virus) is geïntegreerd - heeft belangrijke implicaties voor het lot van zowel de geïntegreerde virussen als de gastheercellen. IS-analyses zijn gebruikt in verschillende biologische en klinische onderzoeksinstellingen om retrovirale integratie site selectie en pathogenese, kankerontwikkeling, stamcelbiologie en ontwikkelingsbiologie 1 , 2 , 3 , 4 te bestuderen. Geringe detectie gevoeligheid, slechte data reproduceerbaarheid, en frequente cross-contaminatie zijn onderDe belangrijkste factoren die de toepassingen van IS-analyses beperken tot huidige en geplande studies.

Er zijn veel IS-analysetechnologieën ontwikkeld. Restrictie-enzym gebaseerde integratie site assays, waaronder Linker-Gemedieerde (LM) Polymerase Chain Reaction (PCR) 5 , inverse PCR 6 en Lineaire Amplification-Gemedieerde (LAM) PCR 7 , zijn het meest gebruikt. Het gebruik van plaatsspecifieke restrictie-enzymen genereert echter een voorspanning tijdens het ophalen van de IS, waardoor slechts een subset van integrogen (een vreemd DNA geïntegreerd in het gastheergenoom) in de nabijheid van de te herstellen restrictieplaats 4 wordt verkregen. Analyse technologieën die vector IS meer grondig beoordelen zijn ook in de afgelopen jaren geïntroduceerd. Deze assays gebruiken verschillende strategieën, waaronder Mu transposon-gemedieerde PCR 8 , nonrestrictive (nr) -LAM PCR 9 , type II-restrictie-enzym-mBewerkte spijsvertering 10 , mechanische afscheiding 11 en willekeurige hexamer-gebaseerde PCR (Re-free PCR) 12 , om genomische DNA's te fragmenteren en IS te amplificeren. Huidige technologieën hebben verschillende niveaus van detectiegevoeligheid, genoomdekking, doelspecifieke eigenschappen, hoge doorstroomcapaciteit, complexiteit van testprocedures en voorspellingen bij het detecteren van de relatieve frequenties van doelwitplaatsen. Gezien de verschillende kwaliteiten van de bestaande analyses en de verschillende doeleinden waarvoor ze kunnen worden gebruikt, moet de optimale assayaanpak nauwkeurig worden geselecteerd.

Dit werk bevat gedetailleerde experimentele procedures en een computergegevensanalyse-workflow voor een bidirectionele analyse die de detectiesnelheden en sequentiekwantificatierugtheden aanzienlijk verbetert door tegelijkertijd de IS stroomopwaarts en stroomafwaarts van het geïntegreerde doel DNA te analyseren (zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de analyseprocedures ). Deze aanpak biedt ookS zijn de middelen om het retrovirale integratieproces te karakteriseren (bijvoorbeeld de getrouwheid van de duplicatie van de doelplaats en variaties in de genomische sequenties van stroomopwaartse en stroomafwaartse invoegingen). Andere bidirectionele methoden zijn voornamelijk gebruikt voor het klonen en sequenties van beide uiteinden van het doel DNA 11 , 13 , 14 . Deze analyse is uitgebreid geoptimaliseerd voor de hoge doorvoer en reproduceerbare kwantificering van vectorgemarkeerde klonen, met behulp van de goed gevestigde LM-PCR-methode en berekeningsanalyse-mapping, en voor het kwantificeren van zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse verbindingen. Biregionale analyse met het TaqαI- enzym heeft bewezen bruikbaar voor high-throughput clonale kwantificering in preklinische studies 2 , 15 van stamcellen gentherapie. Dit papier beschrijft een gewijzigde methode met een meer frequente snijder (RsaI / CviQI - motief: GTAC) die verdubbelt tHij kansen om integrogen te detecteren in vergelijking met een Taqal-gebaseerde assay . Gedetailleerde experimentele en data analyse procedures die GTAC motief enzymen gebruiken voor lentivirale (NL4.3 en zijn derivaten) en gamma-retrovirale (pMX vectoren) vector IS analyse worden beschreven. De in de assay gebruikte oligonucleotiden zijn vermeld in Tabel 1 . In het aanvullende document wordt een intern scriptie script voor IS sequentie analyse gegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opwaartse (links) - en downstream (rechts) -junctie sequentie bibliotheken genereren

  1. DNA linkerbereiding:
    1. Bereid een 10 μL linker-DNA-oplossing op door 2 μL 100 μM LINKER_A-oligo's (eind: 20 μM), 2 μl 100 μM LINKER_B-oligo's (eind: 20 μM), 2 μl 5 M NaCl (eind: 1 M) toe te voegen en 4 μL nuclease-vrij water in een PCR-buis. Zie tabel 1 voor de linker sequenties.
    2. Incubeer de linker-DNA-oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten in een PCR-instrument, stop het programma, en zet het PCR-instrument uit. Laat de linker oplossing in het instrument gedurende 30 minuten langzaam afkoelen van het linker-DNA. De linker-DNA-oplossing kan bij 4 ° C worden opgeslagen.
  2. LTR-specifieke biotine-primer extensie:
    1. Gebruik een UV-Vis spectrofotometer om de DNA-concentratie en 260/280 nm waarden van het genomische DNA van in vivo te bepalenOf in vitro experimenten. Verdun 1-2 μg monster genomisch DNA tot een eindvolume van 170 μl genomische DNA-oplossing met behulp van nuclease-vrij water.
    2. Bereid een 200 μL PCR-reactie op door 2,5 μl elk van 10 μM HIV-1-specifieke biotinprimers (L-BP en R-BP in tabel 1 : totaal 10 μL voor vier lentivirusspecifieke primers) te mengen, 20 μL 10X thermostabiele DNA polymerase buffer, 4 μl 10 mM dNTPs (eind: 200 μM van elk dNTP), 3 μL 2,5 U / μl thermostabiel DNA-polymerase en 163 μl genomisch DNA.
      OPMERKING: Gebruik voor gammaretrovirale vectoren (pMX-vectoren) 5 μL elk van twee 10 μM pMX-specifieke biotinprimers (L-BP en R-BP: totaal 10 μL) in plaats van de vier hierboven genoemde HIV-1-specifieke biotinprimers.
    3. Verdeel de oplossing in vier PCR-buizen (elk 50 μl) en voer een enkele verlengingscyclus onder de volgende conditie: 94 ° C gedurende 5 minuten, 56 ° C gedurende 3 min, 72 ° C voor 5Min en 4 ° C voor opslag.
    4. Pool alle vier PCR reacties in een 2 ml microcentrifuge buis en volg de PCR zuivering procedure van de PCR zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer (5-voudige waterverdunde elueringsbuffer die in de kit wordt geleverd). Ga onmiddellijk met stap 1.3.1 of sla het geëlueerde DNA op -20 ° C op.
  3. RsaI en CviQI spijsvertering
    1. Bereid een 100 μL spijsverteringsreactie door het toevoegen van 50 μl DNA (uit stap 1.2.4), 10 μl 10x buffer A en 2 μL (20 U) van RsaI-enzym. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument.
    2. Voeg 1 μL (10 U) CviQI-enzym aan de reactie toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C in een PCR-instrument. Ga onmiddellijk verder met stap 1.4.1
  4. Blunt einde:
    1. Bereid een 4,5 μl mengsel dat 2,5 μL DNA Polymerase I groot (klenow) fragment en 2 μL 10 mM dNTPs bevat. Overdracht 181; L van het mengsel aan het DNA-monster uit stap 1.3.2. Het totale volume zal 102 μL zijn. Meng goed door vortexing en incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.6.1.
  5. Bereiding van streptavidine kralen:
    1. Vortex de streptavidine-kraaloplossing kort en verplaats 50 μL naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis. Verwijder de supernatant met behulp van de magnetische stand en was de kralen met 200 μL bindende oplossing.
    2. Resulteer de kralen in 100 μl bindende oplossing en plaats de buis weg van de magnetische stand. Ga onmiddellijk door met stap 1.6.1.
  6. Streptavidine kraal binding:
    1. Vervolg 100 μL monster DNA (stap 1.4.1) naar de 100 μL opnieuw gesuspendeerde kraaloplossing (stap 1.5.2) en meng zorgvuldig door pipetteren om eventuele schuimvorming van de oplossing te vermijden. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 uur op een roterend wiel of een rol.
    2. Gebruik de magnetische stand om de kralen te vangen en de supernatant te weggooien. Was de kralen tweemaal in 400 μl wasoplossing en tweemaal in 400 μl 1x T4 DNA ligase buffer (verdund uit 10X oplossing met behulp van nuclease-vrij water).
    3. Resulteer de kralen in 200 μl 1x T4 DNA ligase buffer (verdund uit 10X oplossing met behulp van nuclease-vrij water) en plaats het weg van de magnetische stand. Ga direct door met stap 1.7.1.
  7. Linker ligatie:
    1. Bereid een 400 μl ligatie-reactieoplossing in een 2 ml microcentrifugebuis door 0,5 μl van de DNA linker (stap 1.1.2), 10 μl 10x T4 DNA ligase buffer, 20 μl 5X T4 DNA ligase buffer (die 25% polyethyleen bevat Glycol), 5 μl T4 DNA ligase, 164,5 μL nuclease-vrij water en 200 μl van de opnieuw gesuspendeerde kralen (stap 1.6.3). Plaats de reactiebuis op het roterende wiel en incubeer gedurende 3 uur (of 16 ° C / N) bij RT (22 ° C).
    2. Was de kralen tweemaal met de wasoplossing en tweemaal met 1X thermostabiele DNA-polymerasebuffer (verdund uit 10x oplossing met nuclease-vrij water) met behulp van de magnetische stand.
    3. Resulteer de kralen in 50 μl 1x thermostabiele DNA polymerase PCR buffer en plaats het weg van de magnetische stand. Ga onmiddellijk door met stap 1.8.1 of bewaar bij maximaal één dag bij 4 ° C.
  8. Pre-amplificatie van zowel de linker als de rechter kruis DNA:
    1. Bereid een 200 μl PCR-reactie op door 10 μl 10 μM 1L-primer toe te voegen, 10 μl 10 μM 1R-primer, 20 μl 10 μM primer Link1 (Tabel 1), 10 μl 10X thermostabiele DNA polymerase buffer, 4 μl 10 mM dNTP's (eind: 200 μM van elk dNTP), 8 μl (20 U) thermostabiele DNA-polymerase en 88 μl nuclease-vrij water aan de opnieuw gesuspendeerde kralen (50 μl) van stap 1.7.3.
    2. Aliquot het reactiemengsel in 4 PCR buizen (elk 501; L) en PCR uitvoeren met de volgende conditie: 94 ° C incubatie gedurende 2 minuten; 25 cycli van 94 ° C gedurende 20 s, 56 ° C gedurende 25 s en 72 ° C gedurende 2 minuten; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Pool alle 4 PCR reacties in een 2 ml microcentrifuge buis en volg de PCR zuivering procedure van de PCR zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer.
    4. Bepaal de DNA-concentratie en 260/280-nm waarden met behulp van een UV-Vis spectrofotometer; Het DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot klaar voor de volgende stap. Ga verder met stappen 1.9.1 / 1.10.1 (optioneel) of direct met stappen 1.11.1 / 1.12.1.
  9. Verwijderen van het interne DNA-amplicon aan de linkerzijde (optioneel):
    1. Vervoer tot 100 ng PCR DNA-product van stap 1.8.4 naar een 2 ml microcentrifugebuis en pas het volume aan op 10 μL met behulp van nuclease-vrij water.
    2. Bereid een restrictie-enzymreactie voor die specifiek op de interne D van de linkerzijde richtNA amplicon.
      OPMERKING: De reactieconditie kan verschillen afhankelijk van de keuze van het enzym. Bijvoorbeeld, wanneer u het interne DNA van de linkerzijde van NL4.3-gebaseerde lentivirale vectoren verwijdert, voegt u 1 μL pvuII , 2 μl buffer B en 7 μl nuclease-vrij water toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.11.1 of opslaan bij -20 ° C.
  10. Het interne DNA-amplicon van de rechterzijde verwijderen (optioneel):
    1. Ga verder als in stap 1.9.1.
    2. Bereid een restrictie-enzymreactie op die specifiek gericht is op het rechter DNA-amplicon van de rechterkant.
      OPMERKING: Bij het verwijderen van het interne DNA van de rechterzijde van NL4.3-gebaseerde lentivirale vectoren voegt u bijvoorbeeld 1 μL sfoI , 2 μL buffer B en 7 μL nucleasevrij water toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.12.1 of opslaan bij -20 ° C.
  11. Links-junctie-specifieke versterking:
    1. Bereid een 50 μL PCR-reactie op door 5 μL DNA van stap 1.8.4 (of uit de optionele stap 1.9.2) te mengen, 5 μl 10 μM 2L-primer (eind: 1 μM), 5 μl 10 μM primer Link2 (Eind: 1 μM), 5 μl 10x thermostabiele DNA-polymerase buffer, 1 μl 10 mM dNTPs (eind: 200 μM van elk dNTP), 2 μl (5 U) thermostabiel DNA-polymerase en 27 μL nuclease-vrij water.
    2. Voer de PCR uit met de volgende conditie: 94 ° C incubatie gedurende 3 minuten; 8-15 cycli van 94 ° C gedurende 20 s, 56 ° C gedurende 25 s en 72 ° C gedurende 2 minuten; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Versterkte DNA kan bij -20 ° C worden opgeslagen. * Cyclusnummer optimalisatie wordt voorgesteld.
    3. Volg de PCR-zuiveringsprocedure van de PCR-zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer. Bepaal de DNA-concentratie en 260/280 nm waarden.
  12. Directe kruisingsspecifieke versterking:
    1. Alle procedures zijn identiek aan "Links-kruisingsspecifieke versterking" (stappen 1.11.1-1.11.3), behalve voor het gebruik van verschillende primers; Gebruik de rechter-kruisingsspecifieke primer (2R-primer, zie tabel 1 ) in deze stap.
  13. PCR amplicon lengte variatie test:
    1. Analyseer de variaties van de PCR ampliconlengte door 2% agarosegel-elektroforese of capillaire elektroforese te verrichten ( Figuur 2 ).
      OPMERKING: Dit is een essentiële stap om de voltooiing van de testprocedures te bevestigen en een ruwe beoordeling van IS-patronen te maken op basis van de PCR-bandpatronen. Het gezuiverde PCR amplicon uit stappen 1.11.3 en 1.12.3 kan gebruikt worden voor verschillende DNA sequencing platforms. Ga door met de juiste monstervoorbereidingsprocedures voor sequentiebepaling met klassieke ketenbeëindiging (Sanger) of volgende generatie sequencing. Het DNA kan bij -20 ° worden opgeslagen; C.

2. Computational IS Sequence Analysis

  1. Voorbereiding van gegevensbestanden:
    1. Bereid drie invoerdatabestanden op: een fasta-formaat volgorde gegevensbestand (Test_data.fa in aanvullende gegevens), een tsv-bestand voor de zoekmotieven voor vector- en linkersequenties (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in aanvullende gegevens) en een tsv-bestand voor restrictie-enzyminformatie (Enzyme.tsv in aanvullende gegevens).
      OPMERKING: Deze bestanden zijn vereist voor het demultiplexeren, afsnijden van vector- en linkersequenties en het verwijderen van interne vectorsequenties ( Figuur 3A ). Uitgebreide stap-voor-stap instructies voor het implementeren van de berekeningswerkstroom worden in het bestand README.txt in de aanvullende gegevens verstrekt.
  2. Computational analysis:
    1. Run demultiplexing en trimmen scripts.
      OPMERKING: De ruwe sequentie wordt verwerkt voor demultiplexing en voor de trimminG van de vector-, linker- en primersequenties (zie STEP-1 in het aanvullende README.txt-bestand).
    2. Voer het mapping commando uit (zie STEP-2 in het bestand README.txt) om de verwerkte sequenties op het referentiegenoom te plannen met behulp van een BLAST-achtig uitlijngereedschap (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Voer het kwantitatieve IS analyse script uit (zie STEP-3 in het README.txt bestand).
      OPMERKING: Twee uitvoerbestanden (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt en Final_count.txt) worden gegenereerd. Meer details over mapping- en sequentie-opnamestrategieën zijn te vinden in het bestand "README.txt" in de aanvullende gegevens en in eerdere publicaties 2 , 15 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bidirectionele IS-analyse genereerde verschillende grootte van PCR-ampliconen voor zowel de stroomopwaartse (links) en downstream (rechts) vectorhost-kruispunten ( Figuur 2 ). De grootte van een PCR-amplicon is afhankelijk van de locatie van het dichtstbijzijnde GTAC-motief stroomopwaarts en stroomafwaarts van een integroom. De assay produceerde ook interne DNA-PCR-ampliconen: retrovirale sequenties in de buurt van het polypurine kanaal en de primerbindin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bidirectionele assay maakt het mogelijk simultaan te analyseren van zowel de stroomopwaartse (links) en downstream (rechts) vector-gastheer-DNA-verbindingssequenties en is bruikbaar in een aantal gentherapie-, stamcel- en kankeronderzoeksoepassingen. Het gebruik van GTAC-motiefenzymes (RsaI en CviQI) en de bidirectionele PCR-aanpak verbetert de kansen om een ​​integraal (of een klonale populatie) te detecteren in vergelijking met eerdere TCGA- motiefenzym ( TaqaI ) gebaseerde assays

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 en R56 HL126544; De National Science Foundation Grant DMS-1516675; De Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); En het KRIBB initiatief programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Thermostabiele DNA-polymeraseAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Thermostabiele DNA-polymerase bufferAgilent600424PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) oplossingsmixNew England BiolabsN0447LdNTP-oplossingsmix (elk 10 mM)
PCR-buisjesVWR International53509-304PCR-stripbuisjes met individueel bevestigde doppen
Microcentrifugebuisje van 2 mlMolecular Bioproducts3453microcentrifugebuisjes
PCR-zuiveringskitQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lrestrictie-enzym
CviQINew England BiolabsR0639Lrestrictie-enzym
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart-buffer
DNA-Polymerase I groot (klenow) fragment New England BiolabsM0210LBlunting
streptavidine-kralenoplossingInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER-kit
Binding SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER-kit
WasoplossingInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER-kit
magnetische standaardThermoFisher12321DDynaMag™-2 Magneet
T4 DNA-ligaseNew England BiolabsM0202LT4 DNA-ligase
10X T4 DNA-ligase bufferNew England BiolabsB0202ST4 DNA-ligase reactiebuffer
5X T4 DNA-ligase bufferInvitrogen 46300-018T4 DNA-ligase buffer met polyethyleenglycol-8000
UV-Vis-spectrofotometerFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lrestrictie-enzym
sfoInew England BiolabsR0606Lrestrictie-enzym
Buffer Bnew England BiolabsB7203SNEB-buffer 3.1
Nuclease-vrij waterIntegrated DNA Technologies11-05-01-14
Capillaire elektroforeseQiagen9001941QIAxcel capillaire elektroforese
Veriti 96-well Fast Thermal CyclerThermo Fisher Scientific4375305PCR-instrument
Roterend wiel (of Roller)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
DNA-maatstafQiagen929559QX maatstaf (100 - 2.500 bp)
DNA-maatstafQiagen929554QX maatstaf (50 - 1.500 bp)
DNA-uitlijningsmarkeringenQiagen929524QX DNA-uitlijningsmarkering
genomc DNANiet beschikbaarNiet beschikbaarSteekproef genomc DNA van in vivo of in vitro experimenten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150(1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543(2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284(2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bidirectionele PCR methodologieanalyse van integratieplaatsenworkflow voor clonale kwantificeringhematopo tische stamcelvector gastheer junctionscapillaire elektroforesedata analysepipelinePCR zuiveringskitstreptavidine beadbinding

Gerelateerde artikelen