Methodenartikel

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

DOI:

10.3791/55818

⸱

30 juni 2017

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitbreiding van Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), een belangrijke regulator van vasculaire functie door paracrine signalering, is direct gerelateerd aan de ontwikkeling van hypertensie tijdens obesitas. De omvang van hypertrofie en hyperplasie hangt af van de plaats van de depot, het geslacht, en het type van adipocyte progenitorcel (APC) fenotypes aanwezig. Technieken die zijn gebruikt voor APC en preadipocytenisolatie in de afgelopen 10 jaar, hebben de nauwkeurigheid verbeterd waardoor individuele cellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van specifieke celoppervlakmarkers. Isolatie van APC en adipocyten kan echter een uitdaging zijn als gevolg van de fragiliteit van de cel, vooral als de intacte cel moet worden behouden voor celcultuurtoepassingen.

Magnetisch geactiveerde Cell Sorting ( MCS) verschaft een methode om een ​​groter aantal levensvatbare APC per gewicht eenheid van vetweefsel te isoleren. APC geoogst door MCS kan worden gebruikt voor in vitro protocollen om prea uit te breidenDipocyten en onderscheiden ze in adipocyten door gebruik te maken van groeifactorcocktails die het mogelijk maken om te analyseren van het prolifische en adipogene potentieel dat door de cellen wordt bewaard. Dit experiment was gericht op de aorta en mesenterische PVAT depots, die een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van hart- en vaatziekten tijdens de expansie. Deze protocollen beschrijven methoden om een ​​gedefinieerde populatie APC te isoleren, uit te breiden en te differentiëren. Dit MCS-protocol maakt het mogelijk om isolatie te gebruiken in elk experiment waarbij celsortering nodig is met minimale apparatuur of training. Deze technieken kunnen verdere experimenten helpen om de functionaliteit van specifieke celpopulaties te bepalen op basis van de aanwezigheid van celoppervlakmarkers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), vanwege de nabijheid van bloedvaten, is een belangrijke paracrine signalering component in vasculature functie 1 . Uitbreiding van dit vetweefsel is afhankelijk van het fenotype van de aanwezige 2 , 3 Adipocyte Progenitor Cells (APC). Isolatie van cellen uit vetweefsels is moeilijk aangezien primaire adipocyten fragiel, vloeibaar en omvangrijk zijn. Bepaalde isolatietechnieken kunnen ook het celfenotype en de morfologie veranderen door de inflammatoire eiwitsynthese te verhogen en de adipogene genuitdrukking 4 te verminderen , waarbij het belang van een protocol dat de integriteit van de cellen handhaaft, benadrukt.

Cultuur van primaire cellen en specifieke preadipocyt subpopulaties geeft een reductieve aanpak van in vivo groei en handhaaft equivalente cellulaire genetische make-up 5 , hoewel werkende tiIk met deze cellen is beperkt vanwege verslechtering met veroudering of senescentie 6 . Preadipocyten uit verschillende adipose depots, waaronder subcutane en omale depots, tonen ook verschillen in proliferatie 7 , die het belang benadrukken van het verzamelen van cellen uit specifieke anatomische plaatsen. Voorlopercellen van non-PVAT white adipose depots zijn gekenmerkt in eerdere studies 7 , 8 , 9 , maar minder is bekend over PVAT APC fenotypen.

De hier beschreven technieken maken het mogelijk om specifieke en gedefinieerde APC populaties te analyseren met een minimale impact op hun morfologie, levensvatbaarheid en potentieel om te prolifereren en te differentiëren. Magnetisch geactiveerde Cell Sorting (MCS) is vatbaar voor downstream toepassingen, zoals cultuur, als de kralen oplossen zonder de cel te veranderen. MCS is ook economisch, en zodra het antilichaam conCentraties zijn gestandaardiseerd, de behoefte aan flow cytometrie assays is minimaal. In vitro studies met PVAT precursoren kunnen ook een beeld geven van het potentieel dat deze primaire cellen kunnen hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures die in dit artikel worden beschreven, volgen de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) van de Michigan State University. Alle buffers en media moeten beschermd zijn tegen licht.

1. Bereiding van buffers, media en instrumenten

  1. Bereid Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered oplossing (KRBB): 135 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 1 mM magnesiumsulfaat, 0,4 mM kaliumfosfaat dibasisch, 5,5 mM glucose, 1% antibiotica / antimycotisch (10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 μg / ML streptomycine, 25 μg / ml amphotericin B) en 10 mM HEPES (pH = 7,4). Deze oplossing is stabiel gedurende 3 weken wanneer het steriel wordt gehouden en bij 4 ° C.
  2. Bereid Collagenase Type 1 Oplossing: 1 mg / ml in KRBB met 4% Bovine Serum Albumin (BSA). Deze oplossing moet bij 37 ° C gehouden worden en is stabiel gedurende 4 uur.
  3. Bereid Erythrocyt Lysis Buffer Oplossing: 154 mM ammoniumchloride, 10 mM kaliumbicarbonaat, En 0,1 mM EDTA. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C.
  4. Bereid MCS Blocking Buffer: DMEM / F12 Media Base, 10% Fetaal Bovine Serum (FBS), 5% Normaal Donkere Serum, 40 μL / mL F (ab) Fragment Ezel Anti-Rat IgG. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C.
  5. Bereid MCS Buffer Oplossing: Fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Houd bij maximaal een maand bij 4 ° C. De-gasoplossing door verwarmen tot 37 ° C in een glazen houder en daarna een vacuüm gedurende 15 s aanbrengen. Laat ongebruikt gebufferd verzegeld.
  6. Bereid Stromale Vasculaire Fractie (SVF) Basal Media: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetaal Kalf Serum (FCS), 1% Antibiotica / Antimycotische (10.000 Eenheden / ml Penicilline, 10.000 μg / mL Streptomycine, 25 μg / Ml amphotericin B), 44,05 mM natriumbicarbonaat, 100 μM ascorbinezuur, 33 μM biotine, 17 μM pantothenaat, 2 mM L-glutamine en 20 mM HEPES. Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
  7. Bereid APC &# 160; Media: Basaalmedia met extra groeifactoren inclusief epidermale groeifactor 10 ng / ml), leukemie-remmende factor (10 ng / ml), bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (10 ng / ml) en basale fibroblastgroeifactor 5 ng / ml). Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
  8. APC-inductiemedium voorbereiden: APC-medium met 10% FBS, 2,5 μg / ml insuline, 0,5 mM 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 μM dexamethason en 200 pM T3 (triiodothyronine schildklierhormoon). Blijf steriel en bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.

2. Adipocyten Progenitors Isolatie

  1. Anesthetiseer de rat volgens de institutionele richtlijnen. Plaats de rat in dorsale recumbency. Bevestig diepte van de verdoving via een teenknijp en het verlies van de reflexrespons op deze pijnlijke stimulus.
    OPMERKING: Dit protocol gebruikt 10 weken oude Sprague Dawley ratten en 70 mg / kg pentobarbital, afgeleverd via een intraperitoneale injectie.
  2. Maak een verticale middenlijn incisie wMet een schaar langs de sternum in het thoraxgebied en naar het perinealgebied. Toegang tot de buikholte en blootstelling aan de superieure mesenterische slagader, de kleine mesenterische weerstandsvaten (mPVAT) en de thoracale aorta (aPVAT).
    1. Verbind alle verbindingen met de mesenterie en aorta en verwijder vaten van dieren. Isoleer PVAT door gebruik te maken van een dissectiemicroscoop en Petri schaal gevuld met KRBB om vaten te bekijken en PVAT te isoleren.
    2. In dit experiment, verzamelen gonadale (GON) adipose om een ​​non-PVAT adipose depot te vertegenwoordigen. Plaats geïsoleerde vetpadsjes op ijs in KRBB met 10 mM HEPES (pH = 7,4).
    3. Plaats in een biosafety-kap ongeveer 50 mg weefsel op een 1,7 ml buis met 1 ml collageenase type I-oplossing en maalvlees met weefselschaar (1 - 3 mm stuks).
  3. Digest monsters door incubatie bij 37 ° C in een rotisserie incubator (of incubator met een orbitale shaker) gedurende 1 uur. In een biosafety kap, sequentief filter verteerde materiaal door 100 en 40 Μm celspijpers in een 50 ml buis. Centrifuge resulterend filtraat bij 4 ° C gedurende 10 min bij 300 x g.
    OPMERKING: Alle stappen in het protocol vanaf hier naar voren moeten in een biosafety-kap worden uitgevoerd om de cellen steriel te houden.
  4. Haal supernatant af en pellets resuspenderen die de SVF-cellen bevatten in 1 ml EXHROCYTE Lysis Buffer Oplossing en overbrengen naar een 1,7 ml microfuge buis. Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen licht en centrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 300 x g.
  5. Haal supernatant af en verwijder de resterende celpellet in SVF Basal Media. Verzamel een 20 μL submonster om levende cellen met Trypan Blue Solution te tellen.
    OPMERKING: het aantal afzonderlijke SVF-cellen kan per site verschillen. Gemiddeld aantal SVF geoogst per mg weefsel zijn: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .

3. Magnetisch geactiveerde celsortering

_content "> OPMERKING: APC isoleren van SVF op basis van CD34- en PDGFRα-celoppervlakmarkeringen door alle stappen bij 4 ° C uit te voeren.

  1. Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Haal supernatant af en verwijder de celpelletjes in MCS Blocking Buffer bij 1 x 106 cellen / ml en incubeer gedurende 20 minuten.
    OPMERKING: Cell suspensies van 1 x 10 6 - 2 x 10 8 cellen / ml kunnen effectief gescheiden worden.
  2. Incubeer cellen met 5 μl FITC-geconjugeerde Muis anti-CD34 (1 μg / 1 x 106 cellen) gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 xg en 4 ° C.
    1. Incubeer met 4 μl anti-FITC microbeads en 96 μl MCS buffer (totaal volume van 100 μl) gedurende 5 min bij 4 ° C in het donker om CD34 + en CD34 - cellen te scheiden.
  3. Bevestig de magnetische scheider op de stand en plaats de MultiSort (MS) kolom, met de kolomvleugels naar voren, in de scheider. Plaats een 5 mlCollectiebuis onder de MS-kolom in de bovenbuishouder.
  4. MS Column voorbereiden door te spoelen met MCS Buffer Solution. Breng 500 μL MCS Buffer boven op de kolom en laat de buffer doorlopen. Verwijder afvalwater en vervang de collectiebuis.
  5. Laad antilichaam gemerkt celsuspensie op de bereide MS Column. Verzamel doorstroming met ongemerkte cellen.
  6. MS-kolom wassen met 500 μl afgegasde MCS-buffer 3x. Verzamel ongemerkte cellen die doorgaan en combineren met de doorstroming van de vorige stap.
  7. Verwijder MS Column uit de magnetische scheider en plaats deze op een nieuwe collectiebuis. Pipetteer 1 ml MCS buffer op de MS Column. Spoel de fractie met de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk stevig af, maar langzaam, met behulp van de zuiger die bij de kolom wordt geleverd, om niet overmaat gas in de kolom toe te laten.
    OPMERKING: geïsoleerde cijfers zullen per site verschillen. Gemiddelde cijfers CD34 + APC geïsoleerd uit de SVF populatie perMg weefsel zijn: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 .
  8. Spincellen gedurende 5 minuten bij 300 × g en 4 ° C. Incubeer de CD34 + fractie verzameld in 10 μl van een 1: 200 oplossing / 1 x 106 cellen Konijn anti-PDGFRa gedurende 30 min bij 4 ° C.
    1. Centrifugeer cellen opnieuw gedurende 5 minuten bij 300 xg en 4 ° C. Incubate gemerkte cellen met 4 μl anti-konijn IgG microbeads en 96 μl MCS buffer door stappen 3.3 tot 3.7 te herhalen om te isoleren.
      OPMERKING: geïsoleerde cijfers zullen per site verschillen. Gemiddelde aantallen PDGFRα + APC geïsoleerd uit de CD34 + populatie per mg weefsel zijn: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, dat is 0,5 - 10% van de eerder geïsoleerde populatie.

4. Celcultuur en Adipogenese Inductie

  1. Cultuur de SVFEn APC in 6-Well weefselkweekplaten in basale media met vervanging elke 2 dagen. Na 3 seriële passages, plaat in zwarte 96-Well weefselkweekplaten bij 1x10 2 cellen / putjes voor proliferatiebepalingen, die geëvalueerd worden op 8, 24, 48 en 96 uur en bij 50.000 cellen / put in platen met 24 putjes of 10.000 cellen / put in 48-Weefselkweekplaten voor adipogenese-assays, die kwalitatief en kwantitatief zijn.
  2. Supplement APC basale media gedurende 48 uur na confluentie en voorafgaand aan inductie met botmorfogen eiwit 4 (3,3 nmol / L) zoals aangegeven 10 voor differentiatie. Induceer cellen na 48 uur 100% confluency (dag 0) met behulp van de APC Inductie Media om de cellen te incuberen.
  3. Na 48 uur, verander de media om cellen in APC Inductiemedia zonder IBMX en dexamethason te behouden, gedurende 14 dagen met mediawijzigingen om de 48 uur.
  4. MCS isolatie gevalideerd door FACS.
    1. Neem een ​​50 μl (50.000 cel) submonster van magnetisch scheidenAted cellen en wassen met FACS oplossing.
    2. Centrifuge cellen en resuspenderen in 100 μl van een 1: 1.000 oplossing van ezel anti-konijn IgG Dylight 405 om de PDGFRα + cellen te labelen. Incubeer gedurende 30 minuten beschermd tegen licht en bij 4 ° C.
    3. Wascellen en resuspenderen in 200 μl 2% formaldehyde oplossing tot de tijd voor analyse met behulp van 488 nm (FITC) en 405 nm (Dylight 405) filters op een flow cytometer.
      OPMERKING: Lipide accumulatie door gekweekte cellen wordt kwantitatief beoordeeld met behulp van een lipofiele adipogenese fluorescentie test in een microplate reader die fluorescentie meet en preadipocyten gebruiken als kalibratoren voor lipide accumulatie. Lipide accumulatie wordt ook kwalitatief gemeten door lipide kleurstofverf en beeldvorming uitgevoerd op een omgekeerde microscoop uitgerust met een camera, waardoor het percentage van de totale cellen die lipide waarneembaar of niet bevat, bevat. Elke plaatlezer die fluorescentie met excitatie bij 485 nm en emissie bij 572 kan metenNm is geschikt voor analyse, evenals elke microscoop met een camera die digitale beelden kan vastleggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferatieve capaciteit van preadipocyten en adipogeen potentieel van adipocytprecursoren zijn kenmerken die in vitro worden gehandhaafd 11 . In vitro proliferatie van geïsoleerde SVF en APC uit aPVAT, mPVAT en GON van mannelijke ratten werd geëvalueerd op 8, 24, 48 en 96 uur na plating onder toepassing van een kwantitatieve DNA-analyse. Er werden geen plaatsverschillen in SVF-expansiesnelheid op elk moment waargenomen, behalve de APC van aPVAT...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De centrale focus van het onderhavige experiment is de isolatie, expansie en adipogene inductie van APC van PVAT depots. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van APC op basis van de identificatie van cellen die de oppervlakte markers CD34 en PDGFRα uitdrukken. Deze oppervlakte-eiwitten werden eerder geïdentificeerd op APC met hoge proliferatiecijfers en het potentieel om te onderscheiden in witte of bruine adipocyten in verschillende adipose depots 14 , 1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Contreras en Watts Laboratories en Dr. William Raphael. Deze experimenten werden ondersteund door NHLBI F31 HL128035-01 (weefselvertering protocol standaardisatie), NHLBI 5R01HL117847-02 en 2P01HL070687-11A1 (dieren) en NHLBI 5R01HL117847-02 (celisolatie en cultuur).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Weefseldissectie
Dissectie-schalenHandgemaakt met siliconen
CultuurpetrischaalPyrex7740 Glas
Siliconen ElastomerDow CorningSylgard 170Kit
Gevlochten zijden hechtdraadHarvard Apparatus51-7615SP104
Stereomicroscoop MZ6Leica10447254
Stereomaster Microscoop VezeloptieklichtbronFisher Scientific12562-36
Vannas ScharenGeorge Tiemann & Co160-150
SplintertangGeorge Tiemann & Co160-55
WeefselsescharenGeorge Tiemann & Co105-400
KRBB Oplossing
NatriumchlorideSigma-Aldrich7647-14-5
KaliumchlorideSigma-Aldrich7447-40-7
MagnesiumsulfaatSigma-Aldrich7487-88-9
Kaliumfosfaat DibasicSigma-Aldrich7758-114
GlucoseSigma-Aldrich50-99-7
Antibioticum/AntimycoticumCorning30-004-CI
HEPESCorning25-060-CI
Weefseldigestie
Collagenase Type 1Worthington BiochemicalLS004196
Rundserumalbumine (BSA)Fisher Scientific9048-46-8
Rode Bloedcel Lysis BufferBioLegend4203011X Werkende Oplossing
WaterbadThermo-Fisher Scientific2876Reciproke Schudende Bad
BioveiligheidscabinetThermo-Fisher Scientific1385
Rotisserie IncubatorDaiggerEF4894C
100 µm CelzevenThermo-Fisher Scientific22-363-549Geel
40 µm CelzevenThermo-Fisher Scientific22-363-547Blauw
HemocytometerCole-ParmerUX-79001-00
Trypan BlauwSigma-Aldrich93595
Celisolatie
OctoMACS KitMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 MediumCorning90-090Medium Basis
Fetaal Rundserum (FBS)Corning35016CVUSA Oorsprong
Normaal EzelsserumAbCamAB7475
Anti-CD34Santa CruzSC-7324FITC-geconjugeerd
Anti-PDGFRαThermo-Fisher ScientificPA5-17623
Ezel Anti-Konijn IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
Fosfaat-Gebufferde Saline (PBS) 10XCorning46-013-CM1X Werkende Oplossing
EDTAFisher Scientific15575020
Celcultuur
CO2 CelincubatorThermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i 
6-Well PlatenCorning3516TC-Behandeld
48-Well PlatenCorning3548TC-Behandeld
96-Well Platen, Zwarte MuurCorning353376TC-Behandeld
NatriumbicarbonaatSigma-Aldrich144-55-8TC-Behandeld
Fetaal Kalfserum (FCS)Corning35011CVUSA Oorsprong
AscorbinezuurSigma-Aldrich50-81-7
BiotineSigma-Aldrich58-85-5
PantothenaatSigma-Aldrich137-08-6
L-GlutamineCorning61-030
Bots Morfogenetisch Proteïne 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
Epidermaal Groeifactor (EGF)PeproTech400-25
Leukemie Inhibitory FactorPeproTech250-02
Trombocyt-afgeleide Groeifactor BBProspec BioCYT-740
Basic Fibroblast Groeifactor (bFGF)PeproTech450-33
InsulinCorning25-800-CRITS Oplossing
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
DexamethasonSigma-Aldrich50-02-2
T3 (Triiodothyronine)Sigma-Aldrich6893-023
Celanalyse
CyQUANT Proliferatie AssayThermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed Fluorescerende Assay ReagensLonzaPT-7009
Oil Red O Lipidverf ReagensSigma-AldrichO1391In Oplossing
M1000 Microplate ReaderTecan
Eclipse Omgekeerde MicroscoopNikon
Digital Sight DS-Qil CameraNikon
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
  2. Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
  3. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  4. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  5. Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  6. Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
  7. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  8. Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
  9. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  10. Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
  11. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  12. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  13. Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
  14. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
  15. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
  16. Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
  17. Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
  18. Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
  19. Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).
  20. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
  21. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  22. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  23. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adipocytprogenitorcellenstromale vasculaire fractiecelexpansieprotocollenCD34 markerisolatiePDGFR alfa positieve cellenweefselkweektechniekenproliferatie assayprotocollen

Gerelateerde artikelen