Het omgekeerde hartmodel voor de interstitiële transudate-collectie van het Geïsoleerde Rat Hart

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om hart interstitiële vloeistof uit het geïsoleerde, geperfuseerde rat hart te verzamelen. Om het interstitiële transudaat fysisch te scheiden van coronaire veneuze effluentperfusaat, wordt het geperfereerde hart van Langendorff omgekeerd en wordt de transudaat (interstitiële vloeistof) gevormd op het hartoppervlak verzameld met behulp van een zachte latexdop.

Samenvatting

Het onderhavige protocol beschrijft een unieke aanpak die het verzamelen van cardiale transudaat (CT) in staat stelt uit het geïsoleerde, zoutoplossing-geruceerde rat hart. Na de isolatie en retrograde perfusie van het hart volgens de Langendorff techniek, wordt het hart omgekeerd in een ondersteboven positie en wordt mechanisch gestabiliseerd door een ballonkatheter die in de linker ventrikel wordt ingebracht. Vervolgens wordt een dun latexdop - voorheen gegoten die overeenkomt met de gemiddelde grootte van het rathart - over het epicardiale oppervlak geplaatst. De uitlaat van de latexdop is verbonden met siliconenbuis, met de distale opening 10 cm onder het basisniveau van het hart, waardoor een kleine zuigvorming wordt veroorzaakt. CT die voortdurend op het epicardiale oppervlak wordt geproduceerd, wordt verzameld in ijskoude flesjes voor verdere analyse. De snelheid van CT-vorming varieerde van 17 tot 147 μl / min (n = 14) in controle- en infarcte harten, die 0,1-1% van het coronaire veneuze effluentperfusaat vertegenwoordigt. Proteomische analyse en hoge perfoRmance vloeistofchromatografie (HPLC) bleek dat de verzamelde CT een breed spectrum van eiwitten en purinergische metabolieten bevat.

Inleiding

Hartfalen (HF) is de belangrijkste doodsoorzaak bij mensen wereldwijd ¹ . HF komt vaak voor door myocarditis, ischemische beledigingen voor het myocardium, en linker ventriculaire remodeling, wat leidt tot de progressieve verslechtering van de hartcontractiele functie en de levenskwaliteit van de patiënten. Hoewel de vooruitgang in cardiologie en hartchirurgie de HF-sterfte aanzienlijk verlaagd heeft, dienen zij alleen als voorbijgaande "vertragers" van een onvermijdelijk progressief ziekteproces dat significante morbiditeit draagt. Daarom onderstreept het huidige gebrek aan effectieve behandeling de noodzaak om nieuwe moleculaire doelen te identificeren die HF kunnen voorkomen of zelfs keren. Dit omvat veranderingen in de extracellulaire matrix, ongecontroleerde cardiale immuunrespons en interacties tussen hart- en niet-cardiale cellen ² .

Het is belangrijk om te erkennen dat de micro-omgeving die hartcellen aan direc zijn blootgesteldTly vormt de immuun- en regeneratieve reactie van het gewonde hart. In het geïsoleerde, zoutoplossende hart wordt CT op het hartoppervlak gegenereerd in de vorm van kleine druppels die afkomstig zijn uit de interstitiële vloeistofruimte ( dwz micro-omgeving), zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden ^{3 , 4 , 5} . Daarom kan analyse van de CT (interstitiële vloeistof) helpen bij het identificeren van factoren die hart metabolisme en contractiele functie ⁶ regelen of de immuuncelfuncties beïnvloeden na migratie in het gewond hart. Eventueel kan dit leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van HF.

De collectie van CT uit muizenharten is technisch uitdagend. In regelmatige Langendorff-perfuse harten is de exclusieve collectie CT moeilijk omdat het mengsel van de CT met coronair isY veneuze effluent perfusaat verdient onvoorspelbaar elke concentratie van metabolieten / enzymen die vrijkomen uit de interstitiële ruimte. Een mogelijke strategie om deze beperking te overwinnen is het veneuze effluent uit te sluiten door de pulmonale kannulering en de pulmonale ader ⁷ gelijktijdig te ligeren. Deze werkwijze is echter geconfronteerd met problemen die verband houden met de kanulatie en ligatie van de pulmonale slagader en ader, waardoor potentiële lekkage van veneus effluent in het harttranssudaat wordt veroorzaakt. Het concept van het gebruik van een omgekeerd hartmodel werd voor het eerst geïntroduceerd door de groep Kammermeier, die het geïsoleerde, geperfumeerde hart in een omgekeerde positie omgekeerde en een dun latexdop op het epicardiale oppervlak plaatste om CT continu aan te nemen zonder de vervuiling van het veneuze effluent ^{8 , 9} . Met behulp van deze procedure bleek CT te beschikken over een zeer gevoelige maatregel van de metabolieten die uit het hart ⁹ vrijkomen,De capillaire overdracht van vetzuren ⁸ en virale deeltjes ¹⁰ .

Meer recentelijk hebben paracriene factoren die de lokale immuunrespons kunnen reguleren en cardiale angiogenese ¹¹ kunnen vergroten, betrokken bij de gunstige effecten van stamcellen gebaseerde therapie bij hartziekten. De analyse van CT in het omgekeerde hart kan helpen om deze individuele paracriene factoren chemisch te identificeren. Daarnaast kan CT helpen bij het identificeren van de factoren die betrokken zijn bij de in vivo activering van immuuncellen in het hart.

De gedetailleerde beschrijving van de CT-collectie van het hartoppervlak, dat hier wordt verschaft, is experimenteel nuttig voor onderzoekers die het interactie van immuuncellen, fibroblasten, endotheelcellen en cardiomyocyten interpreteren met betrekking tot de algemene hartfunctie. Zoals hierboven vermeld, draagt ​​de interstitiële vloeistof de informatie voor cel-naar-celcommunicatie binnen het hart, whHet kan gemakkelijk worden beoordeeld door de collectie van CT. De gedetailleerde technische beschrijving, inclusief een videoprotocol om CT van het omgekeerde hart te verzamelen, zou de toekomstige toepassing van deze unieke techniek moeten vergemakkelijken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door het lokale regelgevende agentschap ( LANUV van Nordrhein-Westfalen, Duitsland) en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van dierlijk gebruik. Dieren werden gevoed met een standaard chow dieet en kreeg kraanwater ad libitum . Alle apparatuur en chemicaliën die nodig zijn voor elke stap van het experiment zijn verkrijgbaar in de Tabel .

1. Voorbereiding van de Latex Cap en Intraventriculaire Ballon

1. Maak een aluminium schimmel met een freesmachine die overeenkomt met de gemiddelde grootte van het rat hart (lichaamsgewicht van 300-350 g). Polijst de vorm met superfijn (10/0) ​​emery papier.
   OPMERKING: De gedetailleerde metrics van de mal zijn weergegeven in figuur 1A .
2. Maak de nek van de aluminiumvorm op de freesmachine verticaal om de latexdop te bereiden.
   OPMERKING: De freesmachine laat de matrijs langzaam roteren. Alternatief kan een elektrische motor gebruikt worden. li>
3. Giet 20 ml vloeibare latex (commercieel aangekocht, zie de Tabel van Materialen ) in een 50 ml glazen beker.
4. Laat de vorm dalen tot het gehele lichaam van de vorm in de latexoplossing wordt gedompeld.
5. Til de vorm langzaam (5 cm / min) langzaam op terwijl u draait.
6. Houd de vorm nog 15 minuten langer in rotatie totdat de latex op het oppervlak van de mal wordt gestoldeerd.
7. Voeg ongeveer 1 g talkpoeier toe aan het oppervlak van de mal (al bedekt met een dun latex film) om schade te voorkomen tijdens het losmaken.
8. Verwijder voorzichtig met de vingers de reeds gedroogde latexdop van het vormoppervlak; De latex cap is nu klaar voor gebruik ( figuur 1B ).
9. Sluit de uitlaat van de latexdop aan op 15 cm siliconenpijp (ID = 0,2 mm), die later gebruikt wordt voor de verzameling van CT.
10. Vul de ventriculaire latexballon met water en bevestig hem stevig op een L-vormige metalen canule die is verbonden met een 1 ml, watergevulde spuit (> Figuur 1C).
    OPMERKING: Dit wordt gebruikt om de rechtop positionering van het hart te waarborgen (zie hieronder).
11. Zorg ervoor dat de ballon luchtdicht is door meerdere afblaas- / opblaasproeven met de bijgevoegde 1 ml spuit uit te voeren.
12. Verbind de canule via een driewegstop naar een drukomvormer voor de toekomstige meting van de intraventriculaire ontwikkelde druk ( Figuur 1C ).

2. Bereiding van Krebs-Henseleit Buffer (KHB) en het Langendorff Perfusion System

1. Stel een Langendorff perfusie systeem in door gebruik te maken van een constante stroom (aangedreven door een roller pomp) of constante druk (gegenereerd door statische druk in een glazen kolom) modus.
   OPMERKING: Details van de Langendorff hartpreparatie zijn eerder beschreven ¹² .
2. Bereid 2 L van een gemodificeerd KHB (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4 · 7H20, 1,21 K2HP04 , 2,52 CaCl2 · 2H20, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucose en 2,0 natriumpyruvaat).
   1. Weeg alle chemicaliën maar CaCl ₂ en los ze op in 1,8 liter dubbel gedistilleerd water in een 2-liter fles.
   2. Bubble het medium met carbogen (95% O2 / 5% CO2) gedurende tenminste 5 minuten voor evenwicht (pH: 7,4) onder magnetisch roeren.
   3. Voeg 0,74 g CaCl2 .2H20 toe en breng het totale volume op tot 2 liter met dubbel gedestilleerd water.
   4. Ga verder met roeren en bubbel het medium met carbogen gedurende nog eens 5 minuten.
   5. Filter de KHB door een 0.2 μm filter om kleine deeltjes te elimineren die de microcirculatie van het hart kunnen belemmeren.
3. Bereiding van het Langendorff perfusiesysteem.
   1. Plaats het gefilterde KHB in een voorverwarmd waterbad (38 ° C); Blijf borrelend met carbogeen om een ​​druk van 100 cmH2O insidue te genererenE het KHB reservoir.
   2. Verbind het reservoir met de glazen kolom om 100 cmH ₂ O hydrostatische druk te bepalen voor de Langendorff perfusie met KHB; Blijf de KHB in de kolom blijven bubberen met carbogen.
   3. Stel de temperatuur van het verwarmingssysteem in, zodat de temperatuur bij de aorta canule uitlaat 37 ° C is.
   4. Zorg ervoor dat het buissysteem belvrij is.
   5. Oxygenate het KHB met carbogen gedurende nog eens 5 minuten totdat de PO ₂ in het KHB 500-600 mmHg bereikt (gemeten door een bloedgasanalysator).
4. Stel het perfusiesysteem in om met een constante druk van 100 cmH 2O of bij een constante stroom van ongeveer 10-20 ml / min te draaien met handmatig schakelen. Alternatief, gebruik een verwisselbare STH pomp controller om direct over te schakelen naar de perfusie modus.

3. Isolatie en Cannulatie van het Hart

OPMERKING: Mannelijke Wistar ratten met lichaamsgewichten van 300-350 g werden gebruikt, zodat de afmetingen van de harten overeenstemmen met de voorgegoten latex cap. Ratten ondergaan een ligatie van de linker arteriële aflopende (LAD) gedurende 50 minuten, gevolgd door reperfusie of sham opereren. Details van de methode voor de inductie van myocardinfarct (MI) werden elders gerapporteerd ¹³ . De omkerende experimenten in de infarctdieren werden 5 dagen na de operatie uitgevoerd.

1. Verdovende ratten met behulp van een isofluraan verdamper (2% V / V) verbonden met een dierenhouderkamer (20 L).
2. Breng de ratten naar een operatietafel (niet temperatuurgestuurd) nadat de verdoving bereikt is.
3. Hef de huid en spier net onder de sternum met behulp van tang en snijd de onderste rand van de ribben met zware scharen.
4. Gebruik fijne scharen, maak een kleine snede in het diafragma, aan de ribmarge. Knip de ribben caudaal om een ​​flap van de hele ventrale borstwand te maken.
5. Pak het hart voorzichtig met de duim aNd-index en middelste vingers en haal het langzaam omhoog omhoog zodat de hartvaten lichtjes worden gestrekt.
6. Accijns het hart tot de aorta volledig is blootgesteld.
7. Plaats het hart in een 100 ml beker die 50 ml ijskoud KHB (4 ° C) bevat en verplaats het naar het perfusieapparaat.
8. Monteer het hart onmiddellijk via de aorta op een druppelende canule en stevig vast met een hechting (4-0). Vermijd luchtbellen die in het hart komen.
9. Dien de constante perfusiedruk toe (100 cmH ₂ O). Als alternatief kan een volle stromingssnelheid (beginnend met 20 ml / min) worden toegepast.
   Opmerking: De tijd vanaf de opening van de thorax naar de gehechtheid van het hart tot de perfusie canule moet ongeveer 3 minuten in de handen van een ervaren operator nemen.

4. Terugkerend-hartmodel

1. Draai de aorta canule voorzichtig tot de achterste wand van het hart in een gezichtsbezichting staat .
2. Verwijder het bindweefsel met een schaarOm de opening van het linker atrium bloot te stellen, waardoor het klaar is voor intraventriculaire canulatie.
3. Plaats de ontlate latexballon die via een linker atrium in het linker ventrikel aan een stijve katheter is bevestigd.
4. Blader de ballon totdat het de hele ventriculaire holte invult (het opblaasvolume is vooraf gemarkeerd op de spuit).
5. Keer het hart om tot het ondersteboven is, ondersteund door de intraventriculaire ballonkatheter.
6. Zoals getoond in figuur 1C , stabiliseert het omgekeerde hart mechanisch in een staande positie met behulp van de intraventriculaire ballon met een stijve metalen katheter.
7. Pas de positie van het hart aan om overmatige verdraaiing van de aortische wortel te vermijden.
8. Stel de diastolische druk in op 3-5 mmHg (gemeten door de intra-ventriculaire ballon, zie figuur 1C ).
9. Let op het epicardiale oppervlak van het hart en zorg ervoor dat kleine druppels vormen.
10. Plaats de latex cap oNto het oppervlak van het hart door het voorzichtig te duwen om het hele hart met de vingers te bedekken.
11. Zorg ervoor dat de latexdop het merendeel van het ventriculaire oppervlak bedekt.
12. Verwijder de luchtbellen, indien aanwezig, in de dop en de buis door zachtjes te zuigen met een 1 ml spuit.
13. Verstel de distale opening van de CT-slangen tot 10 cm onder het horizontale niveau van het hart.
    OPMERKING: Deze procedure zorgt voor een kleine zuiging door negatieve hydrostatische druk.
14. Verzamel druppels CT in een 1,5 ml collectie buis geplaatst in ijs gemengd 1: 1 met NaCl. Verzamel ongeveer 0,15-1,5 ml CT.
    OPMERKING: Het ijs / NaCl mengsel stabiliseert de temperatuur in de verzamelbuis tot onder nul (ongeveer -4 ° C).
    OPMERKING: De bemonsteringstijd hangt af van het experimentele doel. De stromingssnelheid van de CT is ongeveer 27 ± 20 μl / min in schuimbeheerde dieren (n = 3) en 100 ± 47 μl / min voor de coronaire ligaten (n = 11).
15. Weeg en snap-freeze CT-monstersIn vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C voor latere metingen.

5. Analyse van de CT

1. Gebruik de CT-vloeistof voor de analyse van metabolieten, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag.
   OPMERKING: De gegevens in Figuur 2 en Figuur 3 werden verzameld uit een constante druk perfusie (100 cmH20) en ongeveer 0,15-1,5 ml CT vloeistof werd verzameld binnen een periode van 10 minuten. Deze tijd en volume waren voldoende voor de proteomische (minimum: 50 μL, Figuur 2 ) ¹⁴ en HPLC (minimum: 20 μL; Figuur 3 ) analyse van verschillende purines.

Resultaten

Het omgekeerde hartmodel maakt het mogelijk om hart interstitiële transudaat in een geïsoleerde retro-perfuse rat hart te maken ( Figuur 1A- C ). Bij perfusie bij een constante druk van 100 cmH20 var de mate van interstitiële vloeistofvorming tussen 17 en 147 μl / min, wat 0,1-1% van het coronaire veneuze effluent in het geïsoleerde hart bedroeg.

Het eiwitgehalte van de CT, ...

Discussie

Het omgekeerde hartmodel is gebaseerd op de gevestigde Langendorff-hart perfusie-techniek ¹² en wordt uitgevoerd door het hart in een omgekeerde positie te omkeren en deze positie vast te houden door middel van een starre intra-ventriculaire ballonkatheter. Op deze manier kan cardiale interstitiële transudaat fysiek gescheiden zijn van coronaire veneuze effluentperfusaat, die door de zwaartekracht van de basis van het hart druppelt. De CT kan continu worden verzameld door middel van een dunne en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Omgekeerd hart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Omgekeerd hart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Omgekeerd hart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Omgekeerd hart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemische stoffen
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemische stoffen
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemische stoffen
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemische stoffen
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemische stoffen
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemische stoffen
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemische stoffen
Balance	VWR	SE 1202	Weegchemicaliën
Double Distilled Water	Millpore	-	Oplossen van chemicaliën
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparaat
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparaat
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparaat
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparaat
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparaat
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparaat
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparaat
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparaat
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparaat
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparaat
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparaat
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Buizen schoonmaken
100% ethanol	Merck	64-17-5	Buizen schoonmaken
Wistar Rats	Janvier	-	Dieren
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Chirurgische instrumenten
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Chirurgische instrumenten
Big Forceps	AESCULAP	-	Chirurgische instrumenten
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Chirurgische instrumenten
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Omgekeerd hart model