Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Samenvatting

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Samenvatting

Het CRISPR / Cas9 genoom engineering systeem heeft de biologie revolutionair gemaakt door het mogelijk te maken voor nauwkeurige genoom-editing met weinig moeite. Geleid door een enkele gids RNA (sgRNA) die specificiteit verleent, klooft het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de target locus. De DNA-pauze kan zowel niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) of homologiregerichte reparatie (HDR) veroorzaken. NHEJ kan kleine deleties of invoegingen introduceren die tot frame-shift mutaties leiden, terwijl HDR mogelijk maakt voor grotere en nauwkeuriger storingen. Hier presenteren wij protocollen voor het genereren van knock-out-cellijnen door koppeling van gevestigde CRISPR / Cas9 methoden met twee opties voor downstream selectie / screening. De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, waarbij eiwitproductie wordt beoordeeld op dot-immunoblot op een hoge doorvoerwijze. De HDR-aanpak gebruikt twee sgRNA-cut-sites die het gen van belang richten. Samen met een voorziene HDR-sjabloon kan deze methode worden verwijderdVan tientallen kb, ondersteund door de ingevoegde selecteerbare weerstandsmelder. De passende toepassingen en voordelen van elke methode worden besproken.

Inleiding

Stabiele genetische veranderingen bieden een voordeel ten opzichte van transiënte methoden van cellulaire perturbatie, die in hun efficiëntie en duur variabel kunnen zijn. Genomische bewerking is de laatste jaren steeds vaker geworden door de ontwikkeling van doelspecifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) ^{6 , 7 , 8 , 9} En RNA-geleidende nucleasen afgeleid van het geclusterde, regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) systeem ¹⁰ .

De CRISPR / Cas9-bewerkingsmachines zijn aangepast aan een immuunsysteem dat bacteriën en archea gebruiken om te beschermen tegen virale infectiesAss = "xref"> 11 ^{, 12 , 13} . In dit proces worden korte 20-30 nt-fragmenten van invallende virale sequentie opgenomen in een genomische locus als "spacers", geflankeerd door herhaling van eenheden ^{14 , 15} . Opvolgende transcriptie- en RNA-verwerking genereert kleine CRISPR-geassocieerde RNA's ¹⁶ (crRNAs) die samen met een trans-activerende crRNA ¹⁷ (tracrRNA) samenstellen met het effector Cas9 endonuclease. De crRNA's verschaffen derhalve specificiteit voor Cas9-targeting, het begeleiden van het complex om complementaire virale DNA-sequenties te kloppen en verdere infecties ^{18 , 19 te} voorkomen. Elke "protospacer" -sequentie in het geteikende DNA kan dienen als de bron van het crRNA, zolang het direct 5 'is naar een kort protospacer naburig motief (PAM), NGG in het geval van S. pyogenes Cas9 ^{20. De afwezigheid van de PAM-sequentie in de buurt van het spacer in de gastheer CRISPR locus onderscheidt zichzelf en niet-zelf, waardoor het voorkomen van de gastheer wordt voorkomen. Vanwege zijn universaliteit en flexibiliteit is dit biologische systeem krachtig aangepast voor genomische bewerking, zodat bijna elke PAM-aangrenzende DNA-site kan worden gericht. In deze versie versmelt een verdere wijziging van het crRNA en tracrRNA in een enkelvoudige RNA-component (sgRNA) die in het Cas9-eiwit 21 geladen is.}

Bij expressie van Cas9 en een sgRNA in eukaryote cellen, splitst het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de gerichte locus. Bij afwezigheid van een geschikt gebied van homologe sequentie fixeert de cel deze pauze via niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) ^{22 , 23 , 24} , die typisch kleine deleties of zelden invoegingen introduceren. Wanneer u een open doel richtLeestraject leidt de reparatie waarschijnlijk tot een translationele frameshift die een niet-functioneel eiwitproduct produceert. In tegenstelling, wanneer deze wordt voorzien van een exogeen sjabloon met grote gebieden van homologie, kan de cel de dubbelstrengpauze repareren door homologie gerichte reparatie ^{25 , 26} . Deze route zorgt voor grotere nauwkeurige deleties, vervangingen of invoegingen in het genoom, gekoppeld aan de introductie van excisabele selectiemarkeringen ²⁷ .

Hier presenteren we protocollen voor het genereren van knock-out cellijnen door middel van een van deze twee CRISPR / Cas9 methoden ( Figuur 1A ). De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, en vereist dus een beetje voorafgaande voorbereiding. Als u deze methode gebruikt, leid u RNA's die complementair zijn met exons in de buurt van het 5'-uiteinde van het transcript, dat waarschijnlijk een knock-out zal produceren, ontworpen moeten worden. Sinds de modificatIonen in het genoom in dit geval zijn klein, screening voor knock-out klonen is gebaseerd op dot blots, waar het eiwit product wordt beoordeeld op een high-throughput manier. We gebruiken de generatie van ELAV-achtige 1-eiwit (ELAVL1) knock-out lijnen als voorbeeld. De tweede aanpak is gebaseerd op homologie gerichte reparatie (HDR) en maakt gebruik van twee sgRNA-cut-sites die het gen of gebied van belang richten, waardoor er tientallen kb's kunnen worden verwijderd. Een plasmide met twee gebieden van homologie die de splitsingsplaatsen flankert, verschaft een vervangende sjabloon ( Figuur 1B ), waarbij een selecteerbare weerstandsmerker wordt geïntroduceerd die de efficiëntie van knock-out generatie verhoogt. Deze methode kan ook worden aangepast om genmodificaties te introduceren met goed ontworpen homologie armen. In dit geval zorgt de integratie van een nieuw DNA fragment voor PCR-gebaseerde screening ( Figuur 1C ). Hier gebruiken we de generatie van Pumilio RNA bindende familielid 2 (PUM2) knock-out lijnen als voorbeeld.

Protocol

1. Identificatie van Homologie Regio's rond de gewenste verwijdering

OPMERKING: Uitsluitend nodig als u op basis van de selectie op basis van een selectie gaat.

1. Selecteer twee gebieden, aanvankelijk 1,5-2 kb, aan weerszijden van de gewenste verwijderingslokus, die als homologiewapens in het HDR-sjabloon zal dienen ( Figuur 1A ). Identificeer regio's die BsaI-herkenningssites ontbreken op beide strengen (GGTCTC) om klonen te vergemakkelijken. Als BsaI-sites onontkoombaar zijn, gebruik dan een alternatief type IIs restrictie-enzym (BsmBI, SapI, BbsI) en modificeer de overeenkomstige plaatsen in het ontvanger plasmide (pUC19-BsaI), donor plasmide van resistentie marker (pGolden-Neo of pGolden-Hygro) en Homologie arm PCR product overhangen.

2. Generatie van Cas9-sgRNA Expression Plasmiden

1. Definieer de targeting site (s) voor mutagenese. Voor de single-cut, selectievrije methode, target 5 'proximale coderingsexonen om de kans op een niet-fu te verhogenNctionele mutatie. Voor de twee-snijmethode selecteer twee sites die zo veel mogelijk van het gen overschrijden.
   OPMERKING: in onze ervaring worden deleties tot 53 kb efficiënt gemaakt.
2. Voer 200 tot 300 bp van de gerichte regio sequentie in in het design tool crispr.mit.edu. Voor selectiegebaseerd klonen gebruik 200-300 bp van de geïdentificeerde homologegebieden die proximaal zijn voor de verwijderingslokus ( Figuur 1A ). Selecteer 2-3 van de meest gerangschikte sgRNA's per doelgebied om rekening te houden met verschillen in hun activiteit en om onafhankelijke klonen te isoleren die niet dezelfde potentiële off-target-effecten delen.
3. Om duplexvormige oligonucleotiden te ontwerpen met geschikte overhangen voor invoeging in het expressieplasmide, laat de eindige PAM-sequentie (NGG) weg en voeg een 5'-CACC overhang toe, gevolgd door een G naar de topstreng oligo. Voor de bottom-strand-oligo voegt u een 5'-AAAC overhang toe aan de omgekeerde complementaire doelsequentie, gevolgd door een 3'-C, als eenHieronder gelust:
   
4. Voeg synthetische oligonucleotiden in die overeenkomen met de sgRNA's in het pSpCas9 (BB) plasmide onder gebruikmaking van Golden Gate kloning ²⁸ zoals beschreven in het Zhang lab protocol ²⁹ .

3. Generatie van Homologie Gerichte Reparatie Sjabloon Plasmiden

OPMERKING: Uitsluitend nodig als u op basis van de selectie op basis van een selectie gaat. Het homologie-gerichte reparatie template plasmide bestaat uit een geneesmiddel resistentie cassette gevlankerd door twee gebieden die complementair zijn aan het genoom net buiten de twee sgRNA target sites ( Figuur 1B ).

1. Uit de ruimere homologiegebieden die in stap 1.1 geïdentificeerd zijn, selecteert 800-1000 bp ²⁶ niet meer dan 5-10 bp weg van de ontworpen Cas9-snijplaatsen, om te dienen als de homologiewapens ( Figuur 1A ). Zorg ervoor dat u de sgRNA niet opneemtTarget site en zijn PAM in de homologie armen, omdat dit CRISPR / Cas9 splitsing van het sjabloon plasmide zelf zal veroorzaken. Als de homologiewapens interne BsaI-sites bevatten, gebruik dan alternatieve sgRNA-sites.
2. PCR versterkt homologie armen uit genomisch DNA met behulp van een high-fidelity DNA polymerase, volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers met extra 5'-sequentie die BsaI sites (GGTCTC) introduceert en unieke overhangen aan beide uiteinden van het homologiegebied. De overhangen moeten behoorlijke sequenties bevatten om de juiste montage volgorde en oriëntatie te genereren, zoals hieronder beschreven ( Figuur 1B ):
   Linker homologie arm FP overhang: 5 'GGGTCTCA GGCC
   Linker homologie arm RP overhang: 5 'GGGTCTCT CACG
   Right homology arm FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
   Rechter homologie arm RP overhang: 5 'GGGTCTCT CCAC
3. Controleer homologie armen voor de juiste amplifIcatie via gelelektroforese alvorens verder te gaan.
4. Monteer de rechter- en linker homologie arm regio's met de weerstandscassette in een HDR template plasmide door Golden Gate kloning ²⁸ . Gebruik pGolden-Neo of pGolden-Hygro plasmiden ³⁰ als de bron van loxP-flankerde weerstandscassettes (loxP-PGK-Neo-pA-loxP of loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Gebruik pUC19-BsaI, een gemodificeerd pUC19 met BsaI plaatsen in het meervoudige kloningsgebied en geëlimineerde BsaI plaatsen elders, als de ontvanger vector (beschikbaar op aanvraag). Gebruik een verhouding van 1: 1: 1: 1 voor de drie inserts en vector.
   1. Bereid het volgende reactiemengsel ^{30 op} :

      Right homology arm PCR product	0,06 pmol (30-40ng)
      Linker homologie arm PCR product	0,06 pmol (30-40ng)
      PGolden-Neo plasmide (100 ng / μl)	1 &# 181; L
      PUC19-BsaI plasmide (100 ng / μl)	1 μl
      2x T7 DNA ligase buffer	5 μl
      BsaI (10 U / μl)	0,75 μl
      T7 DNA-ligase (3000 U / μl)	0,25 μl
      Water	Tot 10 μl

   2. Gebruik de volgende thermocycler parameters: 37 ° C gedurende 5 min, 20 ° C gedurende 5 min. Herhaal gedurende 30 cycli.
   3. Behandel het kloningsproduct met een exonuclease volgens de instructies van de fabrikant om het overgebleven, gelineariseerd DNA te verteren.
   4. Transformeer het reactiemengsel in een bevoegde E. coli stam volgens het protocol dat aan de cellen is toegevoerd, en plaat op ampicilline bevattende schotels.
5. Om klonen te identificeren met het juiste sjabloonsamenstel, voer bacteriën uitAl colony PCR om de homologie arm subregio's van het gemonteerde inzetstuk te versterken (aangezien het hele inzet te groot kan zijn om betrouwbaar te vermenigvuldigen). Gebruik een primerglans aan de flankerende plasmide-sequentie en een tweede primer die complementair is aan de rand van de weerstandscassette ( Figuur 1B , de sequentie is gebruikelijk voor zowel Neo als Hygro-inserts), waardoor een montageafhankelijk product wordt verkregen dat ongeveer 200 bp langer is dan De bevatte homologie arm:
   PUC19-Bsal-Links: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
   Resistance-Left: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
   PUC19-BsaI-Rechts: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
   Resistance-Right: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
   1. Kies bacteriële kolonies met steriele tandstokjes en schud de bacteriën in 20 μL water. Verhit bij 95 ° C gedurende 15 minuten, en draai in een tafelsentrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten. Plaats onmiddellijk op ijs.
   2. Bereid het volgende PCR-mengsel voor ^{31 <}/ Sup>:

      Verdun koloniesjabloon	1,25 μl
      10x Taq reactiebuffer	1,25 μl
      20mM dNTPs	0,25 μl
      10 μM Voorwaartse primer	0,25 μl
      10 μM Reverse Primer	0,25 μl
      Taq Polymerase	0,25 μl
      Water	9 μl

   3. Gebruik de volgende thermocycler parameters: 95 ° C gedurende 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min / kb), herhaal gedurende 25 minuten, 72 ° C gedurende 2 min.
   4. Controleer het PCR-product voor de juiste amplicongrootte door agarosegel-elektroforese.
   5. Optioneel, miniprep plasmide DNA uit individuele kolonies met correcte invoeggrootte en sequentie thE homologie arm regio's door Sanger sequencing met de hierboven genoemde amplificatie primers.

4. Transfectie van CRISPR-componenten in gekweekte cellen

1. Voor transfectie: cultuur T-REx293 cellen in DMEM media aangevuld met 10% FBS bij 37 ° C en 5% CO2.
2. Plaat cellen op 6-putjes platen en groeien tot ongeveer 70% confluency. Breng een put in voor een niet-getroffen controle.
3. Transfect cellen met 2,5 μg totaal plasmide met behulp van een commercieel transfectie protocol. Tegelijkertijd handhaaft u de niet-getransfecteerde controle.
   OPMERKING: De transfectiemethode en de efficiëntie variëren afhankelijk van het celtype. Bepaal de juiste transfectiemethode voor het systeem voorafgaand aan het experiment.
   1. Voor transfectie van cellen met selectie, gebruik 0.75 μg Cas9-sgRNA 1 (linker cut), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (rechter snij) en 1,0 μg homologe recombinatie template.
   2. Voor transfectieOp cellen zonder selectie, gebruik 2.5 μg Cas9-sgRNA plasmide.

5. Drug Selection

1. 48 uur na transfectie, behandel de cellen met het juiste geneesmiddel (Neomycin / Hygromycin). Voer de selectie uit totdat alle cellen in de niet-getransfecteerde controle sterven (meestal 3-5 dagen voor Neo, 7-14 dagen voor Hygro).
   OPMERKING: Gebruik concentraties van 500 μg / ml en 10 μg / ml voor respectievelijk Neomycin en Hygromycin voor T-REx293 cellen. Voor andere celtypes kan het nuttig zijn om een ​​voorafgaande titratie van geneesmiddel op niet getransfecteerde cellen uit te voeren om de effectieve concentratie te bepalen.

6. Isolatie van klonale populaties

1. Groei cellen tot 100% samenvloeiing in het oorspronkelijke goed na selectie. Zaadcellen in 96 putjes platen bij een dichtheid van 0,33 cellen per putje.
   OPMERKING: Het zaaien van drie platen met 96 putjes is een goed uitgangspunt om isolatie van meer dan één juiste kloon te verzekeren, maar meer of minder kan nodig zijn depEindigt op sgRNA en HDR efficiënties.
2. Volg kolonies over een periode van 2-4 weken, tot de kolonies zichtbaar zijn voor het oog. Kies zichtbare kolonies met een steriele pipettaart en keer opnieuw in nieuwe putjes om monolaaggroei te stimuleren. Bij gebruik van suspensiecellen kunnen zelfs lagere zaaddichtheden worden gebruikt om een ​​groter deel van enkelkolonieputjes te waarborgen.

7. Screening Kandidaten

1. Screening kandidaten zonder gebruik van selectie: dot blot
   1. Groei individuele klonen tot 50-100% samenvloeiing. Verwijder de monolaag van cellen door pipettering in de put.
   2. Aliquot 90 μL van het totale volume van 100 μl aan een schone microcentrifugebuis. Spin af bij 6000 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten, verwijder de media en lyse celpelletjes in 10 μl 1x Lysis Buffer of 1x SDS-laadbuffer (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% broomfenolblauw, 40% Glycerol, 100 mM DTT). Voeg 90 μL nieuwe media toe aan de rest van de cellen in de welIk ga verder voortplanten.
   3. Pipetteer 1 μL cellysaat op een droog nitrocellulosemembraan om een ​​punt te vormen. Blot elk monster tweemaal op twee afzonderlijke membranen, waardoor twee identieke patronen van monsters ontstaan.
   4. Blok de membranen in 5% melk in TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris base, tot 1 L gedestilleerd water, pH 7,4) ³¹ gedurende 1 uur bij kamertemperatuur Met rocking, hier en gedurende de procedure).
   5. Blot gebruik maken van het primaire antilichaam tegen het doel eiwit op een membraan en het primaire antilichaam voor een controle eiwit (tubuline, GAPDH, of enig ander eiwit dat niet verwacht wordt te veranderen) anderzijds. Gebruik de aanbevolen verdunning van primaire antilichamen (0.2 μg / ml voor ELAVL1 en 0,1 μg / ml voor Pum2 in dit geval) in TBST + 5% melk. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
   6. Was 3 keer met TBST gedurende 5 minuten.
   7. Incubeer elk membraan met een geschikt HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in TBST + 5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   8. Was 3 keer met TBST gedurende 5 minuten.
   9. Breng chemiluminescentie-substraatoplossing aan (zie Materiaaltafel) volgens de instructies van de fabrikant en beeld het gescheurde membraan op een digitale chemiluminescentie beeldmaker.
   10. Bepaal puntintensiteiten voor de doel- en controle-eiwitten met behulp van de juiste software.
   11. Elimineer kandidaten met een laag controle eiwit signaal, en bereken de achtergestelde subtracted ratio's van het doel om eiwitintensiteiten voor de resterende kandidaten te regelen. Selecteer de kandidaten met de laagste verhoudingen voor doorgang en verdere validatie door western blot.
2. Screening kandidaten met het gebruik van selectie: kolonie PCR
   1. Verzamel cellysaat met behulp van een DNA prep kit (zie Material Table ).
      1. Dupliceer individuele kolonies in een nieuwe 96 put en groei tot 100% confluency.
      2. Verwijder media uit een set van de klonen, aEn resuspenderen cellen in 30 μl extractiebuffer uit de kit. Vervoer naar een schone 1,5 ml microcentrifuge buis.
      3. Verhit de oplossing tot 96 ° C gedurende 15 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
      4. Voeg 30 μl stabiliseringsbuffer uit de kit. Goed mengen.
   2. Identificeer wildtype en monoallele / biallele mutantlijnen door kolonie PCR.
      1. Ontwerp twee afzonderlijke sets van PCR-primers (voor de linker- en rechterkant van de target locus) om regio's rond de homologiewapen te versterken, gebaseerd op succesvolle of mislukte integratie van de weerstandscassette ( Figuur 2C ). Aan elke kant, gebruik een gemeenschappelijke primer (rood) die buiten de homologie arm ontkieft. Gebruik het met een bijbehorende gepaarde primer die complementair is aan de endogene sequentie, die het homologiegebied (blauw) uitstrekt, om te testen voor het wildtype allel. Gebruik een andere gepaarde primer, complementair aan de ingebouwde weerstandscassette (zie primers in sectie2.3), om te testen voor de gewenste mutatie.
      2. (Aanbevolen) Validateer de primer sets met behulp van cellysaat uit de oorspronkelijke geselecteerde bulkcellenpopulatie, aangezien het een mengsel van zowel WT als mutante allelen bevat ( Figuur 2D ).
      3. Bereid het volgende reactiemengsel voor:

         Cellysaat	0,5 μl
         10x KOD buffer	1,25 μl
         25 mM MgSO4	0,75 μl
         2 mM dNTPs	1,25 μl
         10 μM Voorwaartse primer	0,375 μl
         10 μM Reverse Primer	0,375 μl
         KOD polymerase	0,25 μl
         Water	7,75 μl

      4. Gebruik de volgende thermocycler condities: 95 ° C gedurende 2 minuten, (95 ° C gedurende 20 s, Primer Tm gedurende 10 s, 70 ° C gedurende 20 s / kb) herhalen gedurende 25 cycli.
      5. Visualiseer het PCR-product door agarosegel-elektroforese.
   3. Herhaal het kolonie-PCR-test voor elke kant van de voorspelde integratie. Selecteer en uitbreid kandidaten die de aanwezigheid van integratie en geen endogeen sequentieproduct voor de verwijderde regio tonen.
   4. Valideer positieve kandidaten door western blot en / of RT-qPCR.

8. Controleer de genomische mutatie door sequencing

1. Isolatie van genomisch DNA van mutante cellijnen door fenol chloroform extractie ³¹ .
2. PCR versterken het sgRNA doelgebied met behulp van primers met 5'-overhangen die BsaI-restrictieplaatsen toevoegen aan elk einde.
   OPMERKING: Voor klonen die zijn bewerkt met HDR, waar beide allelen identiek kunnen zijn, kan het PCR-product direct worden gesorteerd.
3. Kloneer het versterkte gebied in pUC19-BsaI door Golden Gate-kloning.
4. Transformeer het reactiemengsel in een bevoegde E. coli stam.
5. Miniprep plasmide DNA van 6-10 individuele kolonies en sequentie het gekloneerde gebied door Sanger sequencing.

Resultaten

Voor de opwekking van ELAVL1 knock-out lijnen was een robuust antilichaam beschikbaar, zodat het bewerken met behulp van enkele sgRNA's ( Figuur 1A , links) werd uitgevoerd, gevolgd door prik-immunoblot. Drie sgRNA's werden onafhankelijk getransfecteerd om efficiënties te vergelijken en doelwitseffecten in de resulterende klonen uit te sluiten. Na het verzamelen en blottende cellysaten van klonale bevolkingen op twee nitrocellulosemembranen werden de...

Discussie

Het CRISPR / Cas9-systeem heeft de mogelijkheid tot efficiënte generatie van stabiele genomische modificaties mogelijk, die een meer consistent alternatief bieden voor andere transiënte manipulatiemethoden. Hier hebben wij twee methoden voor de snelle identificatie van CRISPR / Cas9 gen-knockouts in zoogdiercellijnen voorgesteld. Beide methoden vereisen weinig cellulair materiaal, zodat het testen in vroege stadia van klonale cultuur kan worden gedaan, waardoor tijd en reagentia bespaard kunnen worden. Om de efficiëntie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Competent E. coli cellen
plasmide prep kit
pSpCas9(BB) plasmid	Addgene	42230	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzym	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase	NEB	M0318L	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer	ThermoFisher	BY5	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase	NEB	M0494A	HA amplificatie
pUC19-BsaI			Gemodificeerd pUC19 plasmide, gemuteerde bestaande BsaI-plaats en twee naar buiten gerichte BsaI-plaatsen geïnsert na BamHI/EcoRI digestie
pGolden-Neo	Addgene	51422	Weerstandscassette
pGolden-Hygro	Addgene	51423	Weerstandscassette
BsaI enzym	NEB	R3535S	Homologiearm constructie
T7 DNA ligase	NEB	M0318L
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K
Toothpicks			bacteriële PCR
Taq polymerase			bacteriële kolonie PCR
HEK293 menselijke cellen
DMEM	Corning	10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Penicilline-Strep (opt.)	Gibco	15140-122
6 wel platen	BioLite	12556004
TransIT-LTI Transfectie Reagens	Mirus	MIR2300	alleen voor lipofectie
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	alleen voor lipofectie
G418 (Neomycin)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Hygromycine	Sigma Aldrich	H3274-250MG
96 wel platen	ThermoFisher	12556008
Passive Lysis Buffer, 5x	Promega
1x SDS lading buffer			recept beschreven in protocol
Nitrocellulose Membraan	Bio-Rad	162-0115
TBST			recept beschreven in protocol
Gedehydrateerde melk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075	voor HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen
Extracta DNA prep voor PCR	Quantabio	95091-025
KOD polymerase	Novagen	71316