Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Samenvatting

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Samenvatting

Von Willebrand-factor (VWF) is een multimeric glycoproteïne stollingsfactor die bemiddelt adhesie van bloedplaatjes en aggregatie op sites van endothelial schade en dat draagt factor VIII in de omloop. VWF wordt gesynthetiseerd door endotheliale cellen en ofwel constitutively in het plasma wordt vrijgegeven of is opgeslagen in gespecialiseerde organellen, Weibel-Palade instanties (WPBs), genaamd voor op afroep release in antwoord op hemostatische uitdaging. Procoagulatie en proinflammatoire stimuli kunnen snel leiden tot WPB exocytose en VWF release. De meerderheid van de VWF uitgebracht door endotheliale cellen circuleert in het plasma; echter wordt een deel van VWF verankerd aan het endotheel celoppervlak. Onder voorwaarden van fysiologische schuintrekken, kunt endotheel-verankerd VWF binden aan bloedplaatjes, vormen een VWF-bloedplaatjes tekenreeks die de infectiehaard voor de vorming van trombose vertegenwoordigen kan. Een kamer-stroomsysteem kan worden gebruikt om het visueel waarnemen van de vrijlating van VWF uit endotheliale cellen en de daaropvolgende bloedplaatjes vastleggen op een wijze die reproduceerbaar zijn en relevant zijn voor de pathofysiologie van VWF-gemedieerde trombose vorming. Met behulp van deze methode, endotheliale cellen zijn gekweekt in een flow kamer en vervolgens gestimuleerd met secretagogues voor het opwekken van WPB exocytose. Gewassen bloedplaatjes zijn dan geperfundeerd over de geactiveerde endotheel. De bloedplaatjes zijn geactiveerd en vervolgens binden aan de verlengde VWF tekenreeksen in de richting van vloeistofstromen. Met behulp van extracellulaire histonen als een stimulans procoagulatie- en proinflammatoire, waargenomen we verhoogde VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming op Histon behandeld endotheliale cellen ten opzichte van onbehandelde endotheliale cellen. Dit protocol beschrijft een kwantitatieve, visuele en real-time de beoordeling van de activering van VWF-bloedplaatjes interacties in modellen van trombose en hemostase.

Inleiding

Trombose is een belangrijke oorzaak van kindersterfte wereldwijd¹ en kan ontwikkelen in reactie todysregulated bloedplaatjes activering en trombine generatie in de slagaders van beide veinsand. Plasma niveaus van VWF zijn een belangrijke regulator van de bloedstolling, waarbij lage niveaus (< 50%) resulteren in de bloedende aandoening bekend als von Willebrand (VWD) ziekte² en een hoog niveau (> 150%) worden geassocieerd met een verhoogd risico op veneuze³ en arteriële⁴ trombose.

VWF is een glycoproteïne dat multimeric wordt gesynthetiseerd door ....

Protocol

Deze studies werden goedgekeurd door het onderzoek Ethics Board van Queen's University, Canada.

1. endothelial cel stimulatie

1. Collageen-vacht een 6-well weefselkweek plaat.
   1. 24 h op voorhand, jas een 6-well weefselkweek plaat bij 37 ° C met 1 mL van collageen buffer (50 µg Mo/mL rat staart collageen type 1 met 0,02 M ijsazijn).
   2. Was de putjes tweemaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS).
      Opmerking: Platen kunnen worden verpakt in aluminiumfolie en opgeslagen in een luchtdicht plastic zakje bij 4 ° C.
2. Zaad de endotheliale cellen bij een dichtheid van 1 ....

Resultaten

Om te beoordelen direct het effect van histones op VWF vrijlating uit de endotheliale cellen, blootgesteld we confluente BOECs serumvrij middellange met PMA (positieve controle), UH, HR en HK gedurende 2 uur. We toonden dat HK een 2-fold stijging van de VWF eiwit (VWF:Ag) in het medium van behandelde endotheliale cellen (Figuur 1 veroorzaakte). Interessant, toen BOECs werden gestimuleerd met UH en HR, er was minder VWF:Ag is gedetecteerd in het medium dan in .......

Discussie

Terwijl de fysiologische relevantie van VWF-bloedplaatjes blijft controversieel vanwege hun snelle ontbinding bij de aanwezigheid van de VWF-splijten protease ADAMTS13 snaren, dienen ze als een kwantificeerbare in vitro model van bloedplaatjes rekrutering door VWF naar een website op die een trombose kan vormen in aanwezigheid van gelokaliseerde stijgingen van de Histon niveaus⁵. Bovendien, in pathologieën ADAMTS13 activiteit die ontbreekt als Trombotische trombocytopenische purpura (TTP).......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Calf-thymus unfractionated histones (UH)	Worthington Biochemical	HLY	Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rijke histonen (HK)	Sigma-Aldrich	H5505	Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rijke histonen (HR)	Sigma-Aldrich	H4830	Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125-1G	Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Jodide (DiOC6)	Invitrogen	D273	Reconstituted in methanol (20 mM)
Konijn Anti-VWF Coating Antilichaam	DAKO	A0082	Voor VWF ELISA
Konijn Anti-VWF Detectie Antilichaam, HRP-geconjugeerd	DAKO	P0026	Voor VWF ELISA en histone-VWF bindingstest
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates	eBioscience	44-2404-21	Voor histone-VWF bindingstest
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates	Thermo Scientific	3855	Voor VWF ELISA
Humate-P	CSL Behring	N/A	Plasma-afgeleid humaan von Willebrand factor/factor VIII complex
Normaal Referentieplasma	Precision BioLogic	CCNRP-05	Voor VWF ELISA standaardcurve
O-Fenyleen-diamine dihydrochloride (OPD) reagens	Sigma-Aldrich	P8287	Equivalent product verkrijgbaar via ThermoFisher Scientific (Catalogusnummer: 34006)
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Voor cultivering en initiële zaaien van BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092
Rat-tail Collageen Type 1	Corning	354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media	ThermoFisher Scientific	31985070	Voor endotheliale cel stimulaties
METAMORPH Microscopie Automatisering en Beeldanalyse Software	Molecular Devices	N/A
BD Vacutainer Bloedopnamebuizen, Geen Additief	BD Biosciences	366703
µ-Slide III 0.1 (flowkamers)	Ibidi		Dit product is stopgezet. We raden aan om µ-Slide VI 0.1 (#80661) of 0.4 (# 80601) te gebruiken en de stroomsnelheid en het plaatjesvolume opnieuw te berekenen die nodig zijn om een schurringsspanning van 4,45 dyn/cm2 te handhaven
Siliconen Slang 1,6 mm ID: 5 m, gesteriliseerd	Ibidi	10842
Luer Lock Connector Vrouwelijk: natuurlijk Polypropyleen, gesteriliseerd	Ibidi	10825
Elbow Luer Connector Mannelijk: wit Polypropyleen, gesteriliseerd	Ibidi	10802
Blunted 18G Naald	BD Biosciences	305180
20 mL spuiten	BD Biosciences	302830
Spuitpomp	New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM	N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscoop	Quorum Technologies	N/A
Beeldverwerkingssoftware	ImageJ	N/A