Methodenartikel

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

DOI:

10.3791/55917

⸱

14 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Von Willebrand-factor (VWF) is een multimeric glycoproteïne stollingsfactor die bemiddelt adhesie van bloedplaatjes en aggregatie op sites van endothelial schade en dat draagt factor VIII in de omloop. VWF wordt gesynthetiseerd door endotheliale cellen en ofwel constitutively in het plasma wordt vrijgegeven of is opgeslagen in gespecialiseerde organellen, Weibel-Palade instanties (WPBs), genaamd voor op afroep release in antwoord op hemostatische uitdaging. Procoagulatie en proinflammatoire stimuli kunnen snel leiden tot WPB exocytose en VWF release. De meerderheid van de VWF uitgebracht door endotheliale cellen circuleert in het plasma; echter wordt een deel van VWF verankerd aan het endotheel celoppervlak. Onder voorwaarden van fysiologische schuintrekken, kunt endotheel-verankerd VWF binden aan bloedplaatjes, vormen een VWF-bloedplaatjes tekenreeks die de infectiehaard voor de vorming van trombose vertegenwoordigen kan. Een kamer-stroomsysteem kan worden gebruikt om het visueel waarnemen van de vrijlating van VWF uit endotheliale cellen en de daaropvolgende bloedplaatjes vastleggen op een wijze die reproduceerbaar zijn en relevant zijn voor de pathofysiologie van VWF-gemedieerde trombose vorming. Met behulp van deze methode, endotheliale cellen zijn gekweekt in een flow kamer en vervolgens gestimuleerd met secretagogues voor het opwekken van WPB exocytose. Gewassen bloedplaatjes zijn dan geperfundeerd over de geactiveerde endotheel. De bloedplaatjes zijn geactiveerd en vervolgens binden aan de verlengde VWF tekenreeksen in de richting van vloeistofstromen. Met behulp van extracellulaire histonen als een stimulans procoagulatie- en proinflammatoire, waargenomen we verhoogde VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming op Histon behandeld endotheliale cellen ten opzichte van onbehandelde endotheliale cellen. Dit protocol beschrijft een kwantitatieve, visuele en real-time de beoordeling van de activering van VWF-bloedplaatjes interacties in modellen van trombose en hemostase.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombose is een belangrijke oorzaak van kindersterfte wereldwijd1 en kan ontwikkelen in reactie todysregulated bloedplaatjes activering en trombine generatie in de slagaders van beide veinsand. Plasma niveaus van VWF zijn een belangrijke regulator van de bloedstolling, waarbij lage niveaus (< 50%) resulteren in de bloedende aandoening bekend als von Willebrand (VWD) ziekte2 en een hoog niveau (> 150%) worden geassocieerd met een verhoogd risico op veneuze3 en arteriële4 trombose.

VWF is een glycoproteïne dat multimeric wordt gesynthetiseerd door megakaryocytes en endotheliale cellen en opgeslagen in de bloedplaatjes α-korrels en WPBs, respectievelijk. Bij hemostatische uitdaging, kan VWF vrijgesteld van endothelial WPBs ketting circulerende bloedplaatjes geactiveerd endotheliale cellen5 of blootgestelde collageen op het vaartuig muur6. Verankering van VWF naar endotheliale cellen is aangetoond te worden bemiddeld door P-selectine7 en integrine αvβ38. De volgende release van bloedplaatjes α-submodule winkels kan nog meer gelokaliseerde VWF concentraties om te stabiliseren bloedplaatjes-bloedplaatjes interacties voor de vorming van de plug van bloedplaatjes, de steiger die nodig zijn voor de voortplanting van de stolling cascade en fibrine afzetting. De bloedplaatjes-bindende activiteit van VWF wordt geregeld door de multimeric structuur, met hoog-moleculair gewicht multimeren bezitten meer hemostatische activiteit9,10. In omloop fungeert VWF ook als een drager voor de stolling factor VIII.

Vloeibare schuifspanning is een essentiële regulator van VWF fysiologie. Het ontbreken van shear stress bestaat VWF in een bolvormige vorm, verhulling van bindende domeinen voor bloedplaatjes glycoproteïne Ib hechting11. Wanneer schuifspanning aanwezig is, wordt de breukzijde voor een metalloprotease, een disintegrin en metalloprotease met Thrombospondine motief (ADAMTS13), blootgesteld. ADAMTS13 cleaves naakt en bloedplaatjes versierd VWF tekenreeksen voor het regelen van de grootte van de multimer, waardoor de hemostatische activiteit12.

VWF is een acutefase-eiwit, en talrijke stimuli, zoals hypoxie13, infectie14en proinflammatoire cytokines, is aangetoond dat het bemiddelen van VWF vrijlating uit de endotheliale cellen. Gelijkaardig aan andere inflammatoire agenten, extracellulaire histonen ook is gebleken dat voor het opwekken van systemische VWF versie in muizen15,16 en de activering van trombocyten in vitro17,18, 19. Dit werd getoond te zijn afhankelijk van Histon subtype, zoals verschillen in lysine en arginine inhoud functie15kan beïnvloeden. Onze doelstellingen van de studie om een stroom-kamer model voor het onderzoek naar de invloed van lysine-rijk (HK) en arginine-rijke (HR) Histon subtypen en secretagogues op endotheel VWF release en real-time bloedplaatjes vastleggen, potentiële vroege gebeurtenissen in ontsteking-geïnduceerde trombose.

Deze stroom kamer methodologie recapituleert in vivo interacties tussen subendothelial collageen, endotheliale cellen, VWF en bloedplaatjes in een in vitro -systeem dat is visuele, reproduceerbare en kwantificeerbare. De real-time beoordeling van alle aspecten van het traject dat VWF-bloedplaatjes interacties regelt, met inbegrip van WPB secretie, bloedplaatjes activering en VWF proteolyse voorziet. Studies van VWF onder gecontroleerde shear stress omstandigheden hebben gebruikt om te evalueren van de VWD mutaties die afbreuk doen aan de VWF release en bloedplaatjes-bindende functie20, WPB fysiologie21, en VWF decolleté door ADAMTS135. We gebruiken deze methode om te kwantificeren VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming als gevolg van een inflammatoire stimulans: extracellulaire histonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studies werden goedgekeurd door het onderzoek Ethics Board van Queen's University, Canada.

1. endothelial cel stimulatie

  1. Collageen-vacht een 6-well weefselkweek plaat.
    1. 24 h op voorhand, jas een 6-well weefselkweek plaat bij 37 ° C met 1 mL van collageen buffer (50 µg Mo/mL rat staart collageen type 1 met 0,02 M ijsazijn).
    2. Was de putjes tweemaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS).
      Opmerking: Platen kunnen worden verpakt in aluminiumfolie en opgeslagen in een luchtdicht plastic zakje bij 4 ° C.
  2. Zaad de endotheliale cellen bij een dichtheid van 1 x 106 cellen per putje in 2 mL zuiver groei gemiddeld met 10% foetale runderserum (FBS). Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C (5% CO2).
    Opmerking: Hier, uitgroei endotheliale cellen van het bloed (BOECs) tussen 5 en 15 passages werden gebruikt. BOECs werden geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers met een opeenvolging van wildtype VWF met behulp van een methode waarnaar wordt verwezen in Starke et al. 22 op een wijze die vergelijkbaar is met een eerder beschreven door JoVE23.
  3. Verwijder het medium na 24 h en wassen van de cellen met HBSS.
  4. Voeg 1 mL serumvrij medium (minimale essentiële groeimedium zonder FBS) met phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; 100 nM), unfractionated Histon (UH), en HK of HR (alle 25 µg/ml) aan de cellen gedurende 2 uur bij 37 ° C (5% CO2).
    Opmerking: Deze concentratie van Histon was gebaseerd op eerdere in vitro cytotoxiciteit verslagen door Xu et al. 24 en Abrams et al.. 25 , waarmee 50 µg/mL.
  5. Het medium na 2 uur verzamelen en opslaan bij-20 ° C tot analyse.

2. VWF kwantificering door Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

  1. Jas een microplate met 100 µL van de coating van de buffer (10 mM dibasische natriumfosfaat en 145 mM natriumchloride, pH 7,2) met 10 µg/mL anti-VWF polyclonal antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
  2. Wassen van de plaat driemaal met 250 µL van was buffer (dibasische natriumfosfaat 10 mM, 500 mM natriumchloride en 0,1% Tween 20, pH 7,2).
  3. Verdun de middellange monsters 1:2 en 1:4 met was buffer en normale referentie plasma gebruiken voor een standaard curve, begin op een 1:10 verdunning.
  4. Plaat 100 µL van verdunde monsters en normen 's nachts bij 4 ° C.
  5. Wassen van de plaat driemaal met 250 µL van was buffer.
  6. Voeg 100 µL van verdunde anti-VWF, HRP-geconjugeerde detectieantilichaam (1.1 µg/µL in was buffer) voor de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Wassen van de plaat en incubeer gedurende 10 min met O-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD) reagens, volgens de instructies van de fabrikant.
  8. Stop de reactie met 100 µL van 1 M H2dus4 en lees de plaat bij 492 nm.

3. solid-phase Histone-VWF bindende Assay

  1. Een microplate jas met histonen verdund in 0,5% natrium deoxycholate 50 mM carbonaat buffer (pH 9,6) tot 10 µg/mL's nachts bij 4 ° C.
  2. Wassen van de plaat driemaal met 250 µL van PBS aangevuld met 0,1% Tween 20, incubatie gedurende 10 minuten tussen wast.
  3. Het blokkeren van de plaat met 200 µL van PBS aangevuld met 0,1% Tween-20 en 1% bovien serumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Herhaal stap 3.2.
  5. Serieel Verdun plasma bereide menselijke VWF/factor VIII complex van 200 mU/mL tot 25 mU/mL in zoute buffer (10 mM dibasische natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride en 0,1% Tween 20, pH 7,2). Voeg 100 µL aan de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  6. Herhaal stap 3.2.
  7. Detecteren van de binding van VWF aan geïmmobiliseerdet histone met 100 µL van een oplossing met PBS-0.1% Tween-20 en 1:1,000 konijn anti-VWF polyclonal antilichaam geconjugeerd met HRP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Herhaal stap 3.2.
  9. Incubeer de plaat voor 30 min met 100 µL van OPD reagens en stop de reactie met 100 µL van 1 M H2dus4. Meet de optische dichtheid bij 492 nm.

4. seeding endotheliale cellen op stroom Chambers

  1. Laad 0,5 mL van collageen-coating buffer (beschreven in stap 2.1) in een Luer-lock 1 mL spuit.
  2. Draai de Luer-lock-einde van de spuit op het reservoir van een stroom kamer dia.
  3. Druk de zuiger langzaam op totdat de hele baan is bekleed en elke reservoir vol is. Herhaal voor elke rijstrook en de zaal bij 37 ° C gedurende 24 uur uit te broeden.
  4. De buffer van de collageen-coating met een 200 μL pipet gecombineerd. Een ander spuit met 1 mL HBSS laden en druk op de zuiger langzaam te wassen elke rijstrook van de kamer van de stroom. Het wassen met een 200 μL pipet tegengestelde eind van de informatiestroom kamer gecombineerd. Herhaal dit twee keer.
  5. Pipetteer ongeveer 100 µL van een 3 x 106 cellen/mL endothelial cell (BOEC) oplossing in groeimedium met 10% FBS in de baan van een stroom-kamer.
    Opmerking: De seeding dichtheid van endotheliale cellen groter is dan de capaciteit van de zaal. Dit is om ervoor te zorgen maximale kanaal dekking; niet-aanhanger cellen worden verwijderd in de daaropvolgende wassen stap.
  6. Incubeer de zaal bij 37 ° C gedurende 24 h. verandering het medium elke 8-12 h met Luer-lock spuiten (zoals in stap 4.4). Ervoor zorgen dat er geen zichtbare bellen in de rijstroken.

5. het isoleren van bloedplaatjes uit menselijk bloed

  1. In een biologische veiligheidskast met een naald 30 G, voeg 300 µL van zuur-citraat dextrose buffer (85 mM Trinatriumcitraat citraat, 111 mM D-glucose en 71 mM citroenzuur, pH 4.5) om een toevoegingsmiddel-gratis 3 mL bloed collectie vacutainer.
  2. Volbloed van gezonde vrijwilligers (vrij van anti-bloedplaatjes en niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen voor zeven dagen) verzamelen door Venapunctie (drie buizen van elk 3 mL), na een gelijkaardig aan dat geplaatst door Bernardo et al.26protocol.
  3. Gooi de eerste buis, als het oorspronkelijke weefselschade in verband met de Venapunctie spontane bloedplaatjes activering kan veroorzaken.
  4. Voorzichtig omkeren de vacutainers drie keer te mengen het bloed met antistollingsmiddel.
  5. Centrifugeer het vacutainers bij 150 x g gedurende 15 min bij 24 ° C (kamertemperatuur).
  6. Verwijder langzaam de platelet-rich plasma (bezinken) met een pipet in een biologische veiligheidskast en zorgvuldig overbrengen naar een conische buis 15 mL. De bloedplaatjes-rijke hoeveelheid elke vacutainer overbrengen in een enkele conische buis ter voorkoming van potentiële cross-activering.
    Opmerking: De bloedplaatjes isolatie moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van bacteriële besmetting en potentiële kunstmatige bloedplaatjes en/of endotheel activering.
  7. Centrifugeer de conische buisjes bij 900 x g gedurende 10 minuten bij 24 ° C (kamertemperatuur) tot het einde van de bloedplaatjes.
  8. Pipetteer en verwijder het supernatant bloedplaatjes-armen.
  9. Wassen van de pellet zorgvuldig met 1 mL ammoniumcitraat-glucose-natrium (CGS) buffer (Natriumcitraat 13 mM, 30 mM D-glucose en 120 mM natriumchloride, pH 7.0).
    Opmerking: De bloedplaatjes verschijnt in wisp-achtige formaties als de CGS-buffer wordt toegevoegd en de pellet is zachtjes geresuspendeerde. In monsters besmet door activering van de bloedplaatjes, de bloedplaatjes zal niet gemakkelijk resuspendeer en clumpy zal verschijnen.
  10. Eenmaal volledig geresuspendeerde, centrifugeer de monsters bij 900 x g gedurende 10 minuten bij 24 ° C (kamertemperatuur).
  11. Verwijder de CGS-was buffer en resuspendeer de pellet in 3 mL Tyrode de buffer (138 mM natriumchloride, 5.5 mM D-glucose, natriumbicarbonaat 12 mM, 2.9 mM kaliumchloride en 0,36 mM dibasische natriumfosfaat, pH 7.4). Zorgen voor volledige resuspensie van de bloedplaatjes en, indien samenvoegingen worden waargenomen, gooi het monster.
  12. Voeg 1,5 µL van een 20 mM DiOC6 stockoplossing (Los 57.25 mg in 5 mL methanol) aan elke 3 mL conische buis van gewassen bloedplaatjes voor een eindconcentratie van 1 µM.
    Opmerking: DIOC6 is een groen fluorescente mitochondriale kleurstof gebruikt aan dit experiment dat etiket bloedplaatjes.
  13. Aliquoot 1 mL van de oplossing van de gewassen bloedplaatjes drie 1.5-mL microcentrifuge buizen.
    Opmerking: Het volume van de bloedplaatjes nodig voor dit experiment is berekend op basis van de grootte van de kamer van de stroom, de gewenste schuifspanning en de lengte van het experiment (stap 6.5). Dit protocol kan worden aangepast als de omstandigheden veranderen om ervoor te zorgen dat er genoeg volume voor vloeistofstromen.
  14. Gebruik de gewassen bloedplaatjes binnen 2 uur van isolatie.

6. flow apparaat vergadering

  1. Bevestig een stuk 70 cm van steriele silicone slangen (inwendige diameter van 1,6 mm) aan een mannelijke elleboog Luer connecter aan de ene kant en een vrouwelijke Luer lock-adapter op de andere.
  2. Sluit de vrouwelijke Luer lock adapter aangesloten op de buis aan een 20 mL spuit.
  3. Herhaal stap 6.1 en 6.2 tweemaal voor het genereren van drie identieke spuit-buizen-verbindingen.
  4. Gebruik een spuitpomp te genereren vloeistofstromen. Ingang van de volgende instellingen in de spuitpomp: inwendige diameter van de spuit en de stroom tarief.
    Opmerking: Een 20 mL spuit heeft een inwendige diameter van 19.55 mm. Het debiet is berekend op basis van de gewenste schuifspanning tarief/schuifspanning en de afmetingen van de kamer van de stroom. Voor de kamer van de stroom gebruikt in de huidige studie, om te bereiken 1 dyn/cm2 (waargenomen in lage veneuze shear), is een debiet van 9.37 µL/min vereist. Vanwege bewijs histonen koppelen aan veneuze trombose, is een gematigde veneuze schuintrekken van 4.45 dyn/cm2 geselecteerd. Dit is ook gebaseerd op de veronderstelling dat de buffer een soortgelijke viscositeit te water heeft. Het debiet is dan gelijk aan 41.7 µL/min. vergelijkingen gebruikt voor het berekenen van dat het debiet voor de verschillende afmetingen van de kamer van de stroom is te vinden op:
    1. De pomp in te trekken van de vloeistof met behulp van de optie van de knop op de spuitpomp instellen
  5. Laden van de drie spuiten aangesloten op buizen op de spuitpomp en strak veilig haakjes rond het spuiten en plunjers.
  6. Een mannelijke elleboog Luer hechten aan beide uiteinden van een tweede 20 cm stuk steriel silicone slangen.
  7. Een elleboog Luer verbinden met een afgestompte 18-gauge naald.
  8. Herhaal tweemaal, maken drie identieke inname systemen voor de drie rijstroken van de kamer van de stroom.
    Opmerking: De Siliconen slang en Luers kan gewassen worden met 10% bleekwater gevolgd door gedestilleerd water voor hergebruik. Het is niet aanbevolen om het hergebruik van de stroom-kamers.

7. Microscoop instellingen

  1. Gebruik een draaiende schijf Microscoop uitgerust met een volledig geautomatiseerde stadium. Verlichting met een laser-lancering waarmee 405, 458, 491, 543 en 633 nm laserlijnen uitvoeren Alle opnamen met een 20 X doelstelling. Aanpassen van alle parameters met de software van de analyse (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Selecteer de montages van het kanaal (emissie filter: 520/35), met excitatie op 491 nm, voor overname. Instellen van het elektron te vermenigvuldigen met de charge - coupled apparaat aan een elektron-te vermenigvuldigen met de winst van 150, met een belichtingstijd van 200 ms, om het verkrijgen van het volledige dynamische gegevensbereik.
    Opmerking: Bloedplaatjes worden geëtiketteerd met een groen fluorescente kleurstof, DiOC6, met maxima van de golflengte (excitatie, 482 nm, emissie, 504 nm).
  3. Pas de 491 nm laser macht tot 20%.
  4. Het centrum van alle drie rijstroken markeren en selecteer 1 μm voor z-bereik en 0,5 μm voor stap-grootte. Selecteer het aantal tijdstippen (dat wil zeggen, duur) en de tijd tussen beelden (d.w.z., interval) een opname elke 10 s; "60 keer punten" per dia selecteren De Microscoop vastleggen van beelden van de drie rijstroken en hen opslaan naar een aangewezen experiment map instellen
    Opmerking: Omdat de stroom zaal drie rijstroken heeft, de Microscoop zal nodig hebben om te schakelen tussen drie posities om de beelden te vangen.

8. VWF-bloedplaatjes String vorming

  1. Het kweekmedium verwijderen uit de stroom-zaal (uit stap 4) met gebruikmaking van dezelfde techniek als in stap 4.4.
  2. Voeg 100 µL van beide histamine (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK of HR (alle 25 µg/ml) verdund in serumvrij medium (zoals in stap 1.4) ter stimulering van de BOEC enkelgelaagde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en ambient O2-/CO2.
    Opmerking: Hoewel niet noodzakelijk voor VWF release, het uitvoeren van deze stimulatie bij 37 ° C zal verbeteren VWF exocytose27.
  3. Zorgen dat een van de drie gescheiden doorgangen van de stroom kamer blijven onbehandeld als een experimentele controle.
  4. Verwijder het medium met een injectiespuit 1 mL en 100-200 µL van PBS te wassen van de secretagogues af van het endotheel enkelgelaagde te vervangen.
  5. De zaal van de stroom op een dia staan vasculaire clips te gebruiken teneinde het Parlement in de plaats monteren.
  6. Verbindingslijn de beschikbare mannelijke Luer op het einde van de buis van de 70 cm (verbonden met de spuit) naar het reservoir van de kamer van de stroom. Herhaal voor de twee andere stroom kamer rijstroken.
  7. Start de spuitpomp Schakel de PBS wassen. Pipetteer extra PBS in de tegengestelde flow kamer reservoir om ervoor te zorgen dat de rijstroken Voer niet droog.
  8. Observeer de stroomsysteem voor gelijkwaardige stroom over alle drie rijstroken en vervolgens onderbreken de spuitpomp.
  9. Selecteer een gebied om de beelden in ongeveer het midden van elke lane, in ongeveer hetzelfde gebied tussen experimenten te vangen.
    Opmerking: De persoon die de microscoop kan worden verblind voor de experimentele omstandigheden. Deze stap zorgt u ervoor dat de Microscoop voorafgaand aan bloedplaatjes stroom is gericht (zie stap 7).
  10. Toevoegen van een vrouwelijke luer-coupler naar een 5 mL-spuit en vervolgens naar de gratis mannelijke luer-connector (stap 6,8) en dompelen de afgestompte naald in de 1,5 mL microcentrifuge buis met de gewassen bloedplaatjes oplossing (stap 5.13). Langzaam trekken de bloedplaatjes oplossing door de buis om ervoor te zorgen geen luchtbellen in het systeem.
  11. Verwijder de spuit 5 mL en de mannelijke Luer hechten aan het open reservoir van de kamer van de stroom. Herhaal voor het drie rijstroken.
  12. Start de spuitpomp en fotograferen tijdens bloedplaatjes stroom met behulp van de Microscoop en protocol-instellingen uit stap 7 voor 10 min in het donker.
  13. Na 10 min, de Luer Verbreek de inname buis op het stroom kamer reservoir en vul het reservoir met PBS om stroom over de endothelial enkelgelaagde.

9. VWF-bloedplaatjes String kwantificering

Opmerking: De continue stroom van PBS is vereist om de VWF-bloedplaatjes tekenreeks rek voor beeldanalyse. Beëindiging van de stroom zal resulteren in de VWF steeds bolvormige en VWF-bloedplaatjes tekenreeks kwantificering zal schaden. Het is essentieel om te herladen elke reservoir met PBS tijdens het opnemen van de afbeelding. HBSS kunt vervangen door PBS als cel krimpt of detachement tijdens deze stap wordt voldaan.

  1. Begin met de eerste baan, 10 beelden per dia zonder overlapping met behulp van een 20 X objectief rond midden van de dia vastleggen. Herhaal dit voor elke baan.
    Opmerking: De gebieden rondom de reservoirs moeten vermeden worden als gevolg van de turbulente schuifspanning.
  2. Met behulp van beeld processing software, de helderheid aanpassen door te klikken op "Beeld," "Aanpassen" en "Helderheid/Contrast." Sleep de schuifbalk totdat het zelfklevend bloedplaatjes goed genoeg voor de kwantificering kunnen worden bekeken.
  3. VWF-bloedplaatjes string opnemen wanneer drie of meer uitgelijnd bloedplaatjes worden waargenomen in de afbeelding. Alle VWF-bloedplaatjes snaren in een afbeelding tellen. Herhaal voor alle 10 beelden en gemiddelde voor het experiment.
    Opmerking: De persoon die de kwantificering kan worden verblind voor de experimentele omstandigheden. Het is niet nodig om co vlek voor VWF, zoals dit heeft bevestigd door onafhankelijke studies8,28,29.
  4. Herhaal het experiment minimaal drie keer om te evalueren elke secretagogue.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te beoordelen direct het effect van histones op VWF vrijlating uit de endotheliale cellen, blootgesteld we confluente BOECs serumvrij middellange met PMA (positieve controle), UH, HR en HK gedurende 2 uur. We toonden dat HK een 2-fold stijging van de VWF eiwit (VWF:Ag) in het medium van behandelde endotheliale cellen (Figuur 1 veroorzaakte). Interessant, toen BOECs werden gestimuleerd met UH en HR, er was minder VWF:Ag is gedetecteerd in het medium dan in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl de fysiologische relevantie van VWF-bloedplaatjes blijft controversieel vanwege hun snelle ontbinding bij de aanwezigheid van de VWF-splijten protease ADAMTS13 snaren, dienen ze als een kwantificeerbare in vitro model van bloedplaatjes rekrutering door VWF naar een website op die een trombose kan vormen in aanwezigheid van gelokaliseerde stijgingen van de Histon niveaus5. Bovendien, in pathologieën ADAMTS13 activiteit die ontbreekt als Trombotische trombocytopenische purpura (TTP)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alison Michels is een ontvanger van een Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs van de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR). Laura L. Swystun is de ontvanger een CIHR fellowship. David Lillicrap is de ontvanger van de Canada Research Chair in moleculaire hemostase. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie (MOP-97849) operationele CIHR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Calf-thymus unfractionated histones (UH)Worthington BiochemicalHLYReconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rijke histonen (HK)Sigma-AldrichH5505Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rijke histonen (HR)Sigma-AldrichH4830Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)Sigma-AldrichP8139Reconstituted in DMSO (20 mM)
HistamineSigma-AldrichH7125-1GReconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Jodide (DiOC6)InvitrogenD273Reconstituted in methanol (20 mM)
Konijn Anti-VWF Coating AntilichaamDAKOA0082Voor VWF ELISA
Konijn Anti-VWF Detectie Antilichaam, HRP-geconjugeerdDAKOP0026Voor VWF ELISA en histone-VWF bindingstest
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplateseBioscience44-2404-21Voor histone-VWF bindingstest
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well PlatesThermo Scientific3855Voor VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/APlasma-afgeleid humaan von Willebrand factor/factor VIII complex
Normaal ReferentieplasmaPrecision BioLogicCCNRP-05Voor VWF ELISA standaardcurve
O-Fenyleen-diamine dihydrochloride (OPD) reagensSigma-AldrichP8287Equivalent product verkrijgbaar via ThermoFisher Scientific (Catalogusnummer: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Voor cultivering en initiële zaaien van BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
Rat-tail Collageen Type 1Corning354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum MediaThermoFisher Scientific31985070Voor endotheliale cel stimulaties
METAMORPH Microscopie Automatisering en Beeldanalyse SoftwareMolecular DevicesN/A
BD Vacutainer Bloedopnamebuizen, Geen AdditiefBD Biosciences366703
µ-Slide III 0.1 (flowkamers)IbidiDit product is stopgezet. We raden aan om µ-Slide VI 0.1 (#80661) of 0.4 (# 80601) te gebruiken en de stroomsnelheid en het plaatjesvolume opnieuw te berekenen die nodig zijn om een schurringsspanning van 4,45 dyn/cm2 te handhaven
Siliconen Slang 1,6 mm ID: 5 m, gesteriliseerdIbidi10842
Luer Lock Connector Vrouwelijk: natuurlijk Polypropyleen, gesteriliseerdIbidi10825
Elbow Luer Connector Mannelijk: wit Polypropyleen, gesteriliseerdIbidi10802
Blunted 18G NaaldBD Biosciences305180
20 mL spuitenBD Biosciences302830
SpuitpompNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscoopQuorum TechnologiesN/A
BeeldverwerkingssoftwareImageJN/A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

VWF bloedplaatjesstringvormingendotheelcelkweekbloedplaatjesperfusiesecretagoogstimulatieVWF vrijgavebloedplaatjesbindingmicroscopie imaginghistonstimulatietrombosemodel

Gerelateerde artikelen