Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige techniek voor het kwantificeren van de thermodynamische parameters bestuur biomoleculaire vouwen en bindende interacties. Deze informatie is cruciaal in het ontwerp van nieuwe farmaceutische stoffen. Er zijn echter vele farmaceutisch relevante liganden chemisch onstabiele bij de hoge temperaturen gebruikt in DSC analyses. Dus is bindende interacties te meten uitdagend omdat de concentraties van liganden en thermisch-geconverteerde producten voortdurend binnen de calorimeter-cel veranderen. Hier presenteren we een protocol met behulp van thermolabile liganden en DSC voor het snel verkrijgen thermodynamische en kinetische gegevens op de vouwing, bindende en ligand conversie processen. We hebben onze methode toegepast op de aptamer van DNA MN4 dat zich aan de thermolabile ligand cocaïne bindt. Met behulp van een nieuwe globale montage analyse die goed is voor thermolabile ligand conversie, de complete set van vouwen en bindende parameters worden verkregen van een paar van DSC experimenten. Bovendien laten we zien dat de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie met slechts één aanvullende DSC dataset kan worden verkregen. De richtsnoeren voor het identificeren en analyseren van gegevens uit verschillende ingewikkelder scenario's worden gepresenteerd, met inbegrip van onomkeerbare bundeling van de Biomolecuul, langzame vouwing, langzame bindende en snelle uitputting van de thermolabile ligand.
Inleiding
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige methode om quantitating biomoleculaire bindende en opvouwbare interacties1,-2,3. De sterke punten van DSC omvatten haar capaciteit te verhelderen bindend en vouwen van mechanismen en opleveren van het desbetreffende thermodynamische parameters2,3. Bovendien, DSC kan worden uitgevoerd in de oplossing in de buurt van de fysiologische omstandigheden en vereist geen etikettering van de Biomolecuul of ligand, bijvoorbeeldmet fluorophores, spin-etiketten of....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. de monstervoorbereiding
- Zuiveren de gewenste Biomolecuul13.
Opmerking: Dit protocol gebruikt gekocht cocaïne-bindende DNA aptamer MN4 na uitwisselen tegen 2 M NaCl driemaal gevolgd door drie rondes van gedeïoniseerd water met behulp van een centrifugaal filter met een 3 kDa molecuulgewicht cut-off membraan. - Synthetiseren en zuiveren, of koop het gewenste thermolabile ligand-13.
Opmerking: MN4 bindt de thermolabile ligand cocaïne. MN4 bindt ook kinine, die wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability bij deze experimentele temperaturen. - Buffers voorbereiden do....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve gegevens voor de thermolabile ligand-DSC zijn afgebeeld in Figuur 1. De positie en de hoogte van de thermolabile ligand-gebonden piek verschuift achtereenvolgens naar beneden naar die van de niet-afhankelijke Biomolecuul aangezien de thermolabile ligand is uitgeput met elke scan (Figuur 1a). Het gratis denaturatie profiel wordt gebruikt als referentie voor het eindpunt van de thermolabile ligand conversie (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wijzigingen en probleemoplossing
De details van de analyse van de wereldwijde montage gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2 zijn eerder4beschreven. We schetsen hier, praktische aspecten van het uitvoeren en analyseren van DSC bindende experimenten met thermolabile liganden. Merk op dat een basislijn DSC verkregen voor de thermolabile ligand alleen wordt afgetrokken van het ligand + Biomolecuul datase.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
R. W. H. V werd gesteund door het McGill Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) Training Program in Bionanomachines. A. K. M. en P. E. J. werden ondersteund door NSERC subsidies 327028-09 (A. K. M) en 238562 (P. E. J.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Referenties
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
