Dit artikel laat zien hoe cultuur Arabidopsis thaliana zaailingen in een twee-laag microfluidic platform dat de belangrijkste wortel en root haren op een interne optische vlak beperkt. Dit platform kan worden gebruikt voor real-time optische beeldvorming van fijne wortel morfologie alsook wat betreft hoge resolutie beeldvorming door andere middelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Root haren verhogen wortel oppervlakte voor betere opname van water en nutriënten-absorptie door de plant. Omdat ze klein in grootte en vaak bedekt zijn door hun natuurlijke omgeving zijn, zijn root haar morfologie en functie moeilijk om te studeren en vaak uitgesloten van het plantenonderzoek. In de afgelopen jaren hebben microfluidic platformen een manier om te visualiseren wortelstelsel op hoge resolutie zonder verstoring van de wortels bij overdracht naar een imaging systeem aangeboden. Het microfluidic platform hier gepresenteerd bouwt op eerdere plant-on-a-chip onderzoek door het opnemen van een twee-laag-apparaat om te beperken van de belangrijkste wortel van Arabidopsis thaliana aan hetzelfde optische vlak als de haren van de root. Dit ontwerp maakt het mogelijk de kwantificering van root haren op een cellulaire en organel niveau en ook voorkomt dat de z-as drijven bij de toevoeging van experimentele behandelingen. We beschrijven hoe bewaart u de apparaten in een staand en gehydrateerd omgeving, zonder de noodzaak voor fluidic pompen, terwijl het handhaven van een milieu van de gnotobiotic voor de zaailing. Na de optische beeldvorming experiment, kan het apparaat worden gedemonteerd en gebruikt als een basismateriaal voor atomaire kracht of scanning elektronen microscopie terwijl fijn wortel structuren intact.
Inleiding
Fijne root functies vergroten water en verwerving van de nutriënten voor de plant, verkennen van nieuwe ruimtes van de bodem en het vergroten van de totale wortel oppervlakte De omzet van deze fijne root functies speelt een belangrijke rol bij het stimuleren van de ondergrondse voedselketen1 en het aantal fijne wortels in bepaalde plantensoorten is verwacht te verdubbelen onder verhoogde atmosferische kooldioxide2. Fijne wortels zijn over het algemeen gedefinieerd als kleiner dan 2 mm diameter, hoewel nieuwe definities pleiten voor het karakteriseren van de fijne wortels door hun functie3. Net als vele fijne wortels, root haren voorzien van de functie van de opname- en absorptie maar bezetten een veel kleinere ruimte met een bosdiameter volgorde van micron. Vanwege het kleine formaat, root haren zijn moeilijk te afbeelding in situ en zijn vaak over het hoofd gezien als een onderdeel van de algemene architectuur van de wortel in veld schaal experimenten en modellen.
Ex terra root haar onderzoeken, zoals zaailingen geteeld op agar platen, de wetenschappelijke gemeenschap hebben voorzien van waardevolle informatie over cellulaire groei en vervoer4,5. Terwijl agar platen toestaan wortelstelsel te worden beeld niet-destructieve wijze en in real time, bieden ze geen hoge omgevingscontrole voor de toevoeging van experimentele behandelingen zoals voedingsstoffen, plantenhormonen of bacteriën. Een opkomende oplossing tot het vergemakkelijken van hoge resolutie imaging terwijl de komst van microfluidic platforms voor plant studies ook bieden dynamische omgevingsbeheersing geweest. Deze platforms hebben ingeschakeld, het niet-destructieve groei en visualisatie van verschillende plantensoorten voor hoge throughput fenotypering6,7,8,9, geïsoleerde chemische behandelingen 10,11,,12van de metingen van de kracht en de toevoeging van micro-organismen13. Microfluidic platform ontwerpen hebben gericht op het gebruik van één open ruimte fluidic lagen waarin de wortels verspreiden kunnen, waardoor de haren van de wortel op drift in en uit optische focus tijdens groei of behandeling.
Hier presenteren we een procedure voor de ontwikkeling van een twee-laag microfluidic platform met behulp van foto- en soft-lithografie methoden die op eerdere plant-on-a-chip ontwerpen voortbouwt door het beperken van de zaailing root haren aan hetzelfde imaging vlak als de belangrijkste wortel. Dit kan we bijhouden root haar ontwikkeling in real time met hoge resolutie, en gedurende het proces van experimentele behandeling. Onze kweken methoden toestaan Arabidopsis thaliana zaailingen te worden ontkiemd uit zaad binnen het platform en gekweekte voor tot een week in een gehydrateerd en steriele omgeving, die het gebruik van spuit pomp apparatuur niet vereist. Zodra de time-lapse imaging experiment heeft gesloten, kan het platform die hier gepresenteerd worden geopend zonder verstoring van de positie van de fijnere root functies. Hierdoor is het gebruik van andere hoge resolutie beeldvormende methoden. Hier voorzien wij representatieve resultaten voor de kwantificering en visualisatie van root haar morfologie in dit platform door optische, scanning elektronen microscopie (SEM), en atomic force microscopie technieken (AFM).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. twee-laag Platform Fabrication
- Fabricage van gelaagde meesters
- Spin jas epoxy gebaseerde negatieve fotoresist (~63.45% lichamen, 1.250 cSt) volgens specificaties van de fabrikant (2.000 rpm voor 45 s) op een 4 inch diameter silicium wafer te verkrijgen van de gewenste hoogte van 20 µm voor de eerste ontwerp-laag.
- Soft-bak de wafels weerstaan bekleed voor 4 min bij 95 ° C. Toestaan van wafer afkoelen voor 5 min. bloot de wafer aan UV-licht voor 15 s (~ 150 mJ/cm2 op 365 nm) via een photomask in een UV contact aligner om te definiëren van de geometrie van de onderste laag.
- Post-exposure bakken de wafer gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Zonder te ontwikkelen, terug de wafer naar de spin coater en de spin op een tweede laag van epoxy gebaseerde negatieve fotoresist (~76.75% lichamen, 80.000 cSt) bij 3000 t/min te bereiken een tweede laaghoogte van 150-200 µm.
- Laat de wafer om uit te rusten voor 5 min vóór de overbrenging naar een kookplaat van 95 ° C gedurende 45 minuten. Na het bakken op de kookplaat, verwijderen de wafer en laat de weerstaan afkoelen en harden bij kamertemperatuur voor een andere 5 min op een plat horizontaal vlak. Uitlijnen en bloot de wafer naar de tweede laag photomask voor 30 s in een UV contact aligner (dosis van ongeveer 300 mJ/cm2).
- Uitvoeren van een post-exposure bak door het plaatsen van het zegel op een kookplaat voor 15 min bij 95 ° C en laat de wafer afkoelen op een plat horizontaal vlak voor 5 min voordat u gaat ontwikkelen.
- Beide lagen weerstaan gelijktijdig te ontwikkelen door het zegel te plaatsen in een kunststof schotel en dompelen de wafer in de juiste ontwikkelaar (Zie Materialen tabel). Zachtjes rock de schotel af en toe te wassen verse ontwikkelaar over de wafer.
- Spoel na 17 min, de wafer met isopropanol (IPA). Als een witte film wordt weergegeven, gaat u verder itereert tussen de wafer spoelen met ontwikkelaar en IPA totdat de film verdwijnt. Droog de patroon silicium wafer met stikstof.
- Polydimethylsiloxaan Soft-lithografie
- Blootstellen van de silicium wafer een lucht plasma voor 30 s in een schonere plasma ingesteld op hoog (zie tabel materialen) om schoon te maken. Silanize de wafer met trichloor (1H 1U, 2U, 2H-perfluoro-n-octyl) silane in een chemische kap op een kookplaat onder het vlampunt van de silane (85 ° C) gedurende 2 uur.
- Giet een 10:1-verhouding van Polydimethylsiloxaan (PDMS) naar uithardende agent op de basispagina wafer van silicium. De gemengde PDMS in een vacuuemcel ontgas en dan het genezen van het polymeer in een oven van 70 ° C gedurende 1 uur of totdat de PDMS volledig is uitgehard.
- Met behulp van een scalpel, snijd de PDMS apparaten en schil ze uit de silicon master wafer. Maak een 1,5 mm biopsy punch zaad en behandeling inhammen, ponsen de inlaat van het zaad in een hoek van 45° ter bevordering van de wortelgroei in de belangrijkste kanaal.
- Gebruik duidelijke plakband verwijderen puin van het PDMS apparaat en plaats het apparaat ontwerp kant naar beneden op een glas dekglaasje aan. Autoclaaf de gemonteerde apparaten.
2. planten apparaten
- Arabidopsis thaliana zaad voorbereiding
- Oppervlak steriliseren A. thaliana zaden in een microfuge buis met een oplossing van 30% verkrijgbare bleekwater verdund in-geïoniseerd water en 0,1% Triton X wasmiddel voor 7 min. Wash zaden 4 keer met steriel water.
- Zaad stratificeren door microfuge buis koel 's nachts of tot een week bij 4 ° C.
- Voorbereiding van het apparaat
- Gesteriliseerde apparaten plaats in een vacuüm ontgassing kamer lucht om uit te verwijderen het gas permeabele PDMS en fluidic kanalen om gebruiksgemak vullen.
- Verwijder de apparaten uit de Vacuuemcel en onmiddellijk het onderdompelen van de apparaten in een petrischaal gevuld met vloeibare ¼ sterkte plant gebaseerd media bij pH 5.7.
- Met behulp van een precisiepipet, trek de vloeistof door de inhammen te vullen van het apparaat. Zorg ervoor dat geen luchtbellen blijven binnen kanalen door visuele inspectie.
- Afzonderlijke apparaten overbrengen in nieuwe droge petrischalen. Pour of Pipetteer hete agar rond het apparaat tot op het niveau van de agar is bijna gelijk met de bovenkant van het PDMS-apparaat. Toestaan agar te stollen.
Opmerking: Apparaten zijn nu gereed voor het planten van zaden of kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Plantgoed zaden binnen apparaten
- In een steriele omgeving, door een gesteriliseerde zaad te overbrengen in de inlaat van elk apparaat met behulp van een kleine pipet.
- Dekking de petrischaal met wax film (Zie Materialen tabel) en plaats in een licht/donker fietsen groei kamer of vensterbank bij kamertemperatuur. Oriënteren de petrischaal zodat de apparaten verticale zijn en ernst zal aanmoedigen de wortels om te groeien door het kanaal.
3. behandeling
- Experimentele behandelingen
- Toevoegen op het gewenste tijdstip in de zaailing van ontwikkeling, de experimentele behandeling aan de zaailing door een voorgeschreven hoeveelheid de behandeling toe te voegen aan elk van de 8 kant poorten via pipet.
- Verzegelen van de petrischaal en terugkeren naar groei kamer of vensterbank.
- Doorgaan met imaging monsters op het gewenste tijdstip vastleggen van individuele punten of tijd vervallen imaging beginnen.
4. de optische beeldvorming
- Lagere resolutie (4-20 X) beeldvorming
- Plaats de gehele petrischaal met het apparaat en de zaailing onder een omgekeerde helder veld Microscoop voor lagere resolutie (4-20 X) helder veld of differentiële interferentie contrast (DIC) imaging. Optimaliseren lichtomstandigheden ophelderen van morfologische kenmerken van belang door de belichtingstijden, helderheid van de lamp, het diafragma en de polariteit van het licht aanpassen. Rijden de etappe naar het gewenste gebied van de wortel en de focus bij het toegangspunt of de root hair(s) van belang.
- Het verwerven van een enkel tijdstip of een tijdreeks van beelden. Om te visualiseren de groei van de haren van de root, het imago van groeiende root haren eenmaal per min. Om te visualiseren de groei van de belangrijkste wortel, krijgen één afbeelding elke 30 min. terugkeer de petrischaal en de zaailingen groei kamer of vensterbank in een verticale positie nadat imaging voltooid is.
- Hogere resolutie (20-63 X) beeldvorming
- Zodra de zaailing gegroeid voor een gewenste tijd, gebruik pincet dekglaasje aan en apparaat verwijderd met de agar. Reinigen van de onderkant van het dekglaasje aan met behulp van een ethanol bevochtigd laboratorium weefsel.
- De aanbevolen onderdompeling media toepassen door het doel zoals voorgesteld door de Microscoop lens fabrikant. Leg het dekglaasje aan naar beneden in het werkgebied van de Microscoop en verhogen het podium om contact met de media van de onderdompeling op het doel. Optimaliseer de lichtomstandigheden door belichtingstijden, helderheid van de lamp, het diafragma en de polariteit van het licht aanpassen. Rijden de etappe naar het gewenste gebied en de focus op root hair(s) van belang.
Opmerking: DIC is nodig om te visualiseren cytoplasmatische streaming en fluorescentie markeringen zijn nodig om te visualiseren organel beweging. - Verwerven om te kwantificeren root haargroei na verloop van tijd, één afbeelding per min. Om te visualiseren organel verkeer, het minimaliseren van de fluorescentie belichtingstijd met behoud van een identificeerbare fluorescentie-signaal van de organellen. Beelden van de organellen zo snel als de belichtingstijd kunt verwerven. Voor meer time-lapse imaging, gebruikt u een live-cel imaging fase incubator omgevingstemperatuur en vochtigheid te handhaven.
Opmerking: Een 63 X olie doelstelling wordt aanbevolen voor imaging root haar organellen.
5. niet-optische beeldvorming
- Voorbereiding van het apparaat
- Zodra de zaailing gegroeid voor gewenste tijdstip,
- Storten een dunne (~ 20 nm) laag van chroom naar de hoofdmap en de omliggende PDMS met behulp van een dubbele pistool Electron Beam verdamping kamer.
- De wortel en de PDMS apparaat overbrengen door de kamer van een Scannende Elektronen Microscoop.
Opmerking: Imaging voorwaarden, d.w.z. spanning, huidige en werkende afstand moet worden geoptimaliseerd om de gewenste resolutie voor een bepaalde toepassing.
- De PDMS apparaat wortel kant oplopen op een monsterhouder AFM. Verhogen van contrast in de camera en de wortel van gemakkelijker onderscheiden met de PDMS, plaatst u het PDMS op een plat reflecterend substraat (zoals mica bekleed in goud) voor montage van het apparaat op de monsterhouder AFM.
- Beveilig een vloeibare goed bijlage op de top van het PDMS apparaat en vul deze met water te houden van de wortels gehydrateerd tijdens imaging.
- Laad de monsterhouder in de AFM. Aanpassen van het z-besturingselement voor de dikte van het PDMS-apparaat en de uitkraging rijden naar de regio van belang in de hoofdmap met behulp van een camera voor de oriëntatie.
- Hiermee lijnt u de laser met het topje van de uitkraging. Voor de beste resultaten met contact modus imaging kunt uitkragingen met lente constanten van 0,01 of 0,03 N/m minimale kracht in de hoofdmap uitoefent tijdens het scannen.
- Langzaam lager het scannen mechanisme tot de uitkraging gewoon maakt contact met het monster. Pas de grootte van de scan voor de gewenste regio en kies een snelheid van de scan van 1 lijn/s met 256 spanning punten per lijn. Het verwerven van de scan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De twee-laag PDMS microfluidic apparaten hier beschreven hebben een hoge kanaal van 200 µm voor de belangrijkste wortel van Arabidopsis en een hoge kamer van 20 µm beperken lateraal groeiende root haren (figuur 1A). Dit ontwerp kan worden gebruikt voor plantensoorten met soortgelijke wortel diameters als Arabidopsis thaliana en gemakkelijk kan worden gewijzigd voor soorten verschillende maten. Het ontwerp omvat een inham voor de pla...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De methode die is beschreven in dit artikel voor het maken van een plant-on-a-chip-platform is uniek omdat het twee-laag ontwerpen grenzen de haren van de wortel tot een enkel imaging vliegtuig en het platform kan worden gedeconstrueerd en kan worden gebruikt als een basismateriaal voor hoge resolutie niet-optische beeldvorming . Het gebruik van hoge resolutie niet-optische beeldvorming kan bieden waardevolle informatie over de plant weefsel dat niet uit optische beeldvorming alleen kan worden verkregen. AFM imaging bied...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit manuscript heeft geschreven door UT-Battelle, LLC onder Contract nr. DE-AC05-00OR22725 met het Amerikaanse ministerie van energie. De regering van de Verenigde Staten behoudt en de uitgever, door het aanvaarden van het artikel voor publicatie, erkent dat de regering van de Verenigde Staten behoudt een niet-exclusieve, gestorte, onherroepelijke, wereldwijde licentie om te publiceren of te reproduceren van het gepubliceerde formulier van Dit manuscript, of toestaan dat anderen te doen, voor doeleinden van de regering van de Verenigde Staten. Het Department of Energy zal zorgen voor toegang tot deze resultaten van federale overheid gesponsorde onderzoek overeenkomstig het DOE toegang van het publiek Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Genomic Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologische en milieuonderzoek, als onderdeel van de Plant Microbe Interfaces wetenschappelijke focusgebied (http://pmi.ornl.gov). De fabricage van de platforms van microfluidic werd uitgevoerd in de nanofabricage Research Laboratory in het midden voor Nanophase Materials Sciences, die een DOE-Office van wetenschap gebruiker faciliteit is. JAA wordt ondersteund door een NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um dikte, Prime, 10-20 resistiviteit, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | gebruik in chemische kap | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | geconcentreerd | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
Referenties
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281(2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
