Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een cel cultuur Model van weerstand slagaders
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het myoendothelial junction (MEJ), een unieke signalering microdomain in kleine diameter weerstand slagaders, vertoont lokalisatie van specifieke proteïnen en signalering processen die vasculaire Toon en bloeddruk kunnen. Als het is een projectie van hetzij de cel endothelial of gladde spieren, en als gevolg van zijn kleine formaat (gemiddeld een oppervlakte van ~ 1 µm2), de MEJ is moeilijk om te studeren in afzondering. Echter hebben we een cel cultuur model genaamd de vasculaire co celcultuur (VCCC) waarmee in vitro MEJ vorming, endothelial cel polarisatie en dissectie van signalering eiwitten en processen in de vasculaire muur van verzet slagaders. De VCCC heeft een veelheid van toepassingen en kan aangepast worden aan verschillende soorten cellen. Het model bestaat uit twee celtypen gegroeid aan weerszijden van een filter met 0.4 µm poriën waarin de in vitro MEJs kunnen vormen. Hier beschrijven we hoe maak je de VCCC via beplating van cellen en isolatie van endotheel, MEJ, en glad spierweefsel fracties, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor isolatie van de eiwit- of activiteit testen. Het filter met intact cel lagen kan worden opgelost, ingesloten en verdeelde immunefluorescentie p.a.. Nog belangrijker is, zijn veel van de ontdekkingen van dit model bevestigd met behulp van intact weerstand slagaders, de fysiologische relevantie onderstrepen.
Inleiding
In kleine diameter weerstand slagaders scheidt een dunne interne elastische lamina (IEL) endothelial (EG) en de zachte spiercellen (SMC). De cellen kunnen project door openingen in deze elastische matrix en leveren van directe cytoplasmatische verbindingen via gap junction kanalen1,2. Deze unieke structuur is de myoendothelial kruising (MEJ) genoemd. De MEJ is een klein (ongeveer 0,5 µm x 0,5 µm, afhankelijk van het vasculaire bed), cellulaire projectie bestaat voornamelijk uit endotheliale cellen, maar kan voortkomen uit gladde spieren ook3,4. Een aan....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. plating cellen voor de VCCC
- cultuur grote 225 cm 2 flacons van EG en SMC onder steriele omstandigheden bij 37 ° C, tot 70-90% heuvels. Zorgen dat meer EG dan SMC worden gebruikt; Als met behulp van primaire menselijke EG en SMC, meestal 3 grote maatkolven van EG aan 1 grote maatkolf van SMC.
- Gebruik van primaire cellen op lagere passages en gebruik geen verleden passage 10. Kies de voedingsbodems op basis van de cellen die moeten worden mede gekweekt. Voor primaire menselijke coronaire EG, EBM-2 EG basale media met EGM2 MV groeifactoren te gebruiken. Voor primaire menselijke coronaire SMC, SmBM SMC basale media met Sm....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De filter-inzetstukken gebruikt voor de VCCC hebben kleine, 0.4 µm gaten. Figuur 1A, een weergave van de nl-gezicht van de VCCC filter inzet, toont de poriën waarin de MEJ in vitrokan vormen. Het schema toont de zachte spiercellen verguld aan de onderkant van het filter een dag voordat de endotheliale cellen zijn verguld aan de overkant (figuur 1B). Zodra de cellen zijn verguld, kunnen de EG, MEJ en SMC breuken .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De VCCC heeft een aantal voordelen in termen van Recapitulerend MEJs in vitro, maar er zijn punten van discussie bij de vaststelling als de VCCC kan worden gebruikt voor specifieke toepassing. Bijvoorbeeld, als verschillende soorten cellen zijn voor gebruik met dit model, zal het moeten worden geoptimaliseerd. We hebben gebruik gemaakt van primaire menselijke cellen, maar het is mogelijk te isoleren van de cellen van boviene aortas24, of wildtype of knock-out muizen, en gebruik ze in de V.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de National Heart, verleent Lung and Blood Institute R01088554, de T32HL007284 en de American Heart Association predoctoraal fellowship 14PRE20420024. Wij bedanken met name de St. Jude cellulaire Imaging gedeeld onderzoek kern, met inbegrip van Randall Wakefield en Linda Horner voor de beelden van elektronenmicroscopie, Adam Straub voor hulp bij representatieve immunofluorescentie beelden en Pooneh Bagher voor haar waardevolle feedback over het manuscript-protocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | Dit is één 6 well plate van inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (zonder filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Voeg toe aan basaal media voor gebruik |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Voeg toe aan basaal media voor gebruik |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Verdun tot 2X met steriele dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| Grote petrischalen voor SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatine | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectine | Corning | 356008 | 5µg/ml van fibronectine en bewaar bij -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Verdun tot 1x met steriele water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Verdun tot 1x met steriele water |
| Wegwerp gebogen scalpel (30mm snijrand) met handvat | Amazon | MDS15210 | |
| Pincet | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL kegelbuis | Corning | 352070 | |
| 10 mm petrischalen | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagens | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Maak 4% oplossing met dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide desinfectiemiddel | Fisher | 131000 | |
| RIPA proteïne lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS voor het oogsten van EC/SMC en immunocytochemie | Gibco | 10010023 | Hoeft niet sterieel te zijn |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Inbedding/Sectie/Kleuring | |||
| Paraffine | Fisher | P31-500 | |
| Geautomatiseerde weefselprocessor | Excelsior | ES | |
| Inbedding station + koude plaat | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome mes | VWR | 25608-961 of 25608-964 | |
| Microscoopglazen | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Dekglasjes | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold montagemedium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Andere oplossingen | **Voer alle stappen uit in steriele omstandigheden als de oplossing op levende cellen wordt gebruikt | ||
| Steriele dPBS | Sterieliseer water door autoclaven. Gebruik het steriele water om DPBS te maken (450mL steriele water: 50mL 10X DPBS), meng en filter sterieliseer (0.2µm filter). Eindconcentratie: 1X | ||
| Steriele HBSS | Sterieliseer water door autoclaven. Gebruik het steriele water om HBSS te maken (450mL steriele water: 50mL 10X HBSS), meng en filter sterieliseer (0.2µm filter). Eindconcentratie: 1X | ||
| Fibronectine stockoplossing | Gebruik 50mL steriele water om fibronectine op te maken in 1mL aliquots, en bewaar ingevroren tot gebruik Eindconcentratie: 100µg/mL | ||
| Fibronectine om SMC zijde van VCCC te coaten | Ontdooi één aliquot en voeg 1mL fibronectine (100µg/mL) toe aan 19mLs van 1X HBSS om een eindconcentratie van 5µg/mL te bereiken. Eindconcentratie: 5µg/mL | ||
| 2x Trypsin EDTA oplossing | Verdun de 10X 0.5% Trypsin-EDTA tot 2X met 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin). Eindconcentratie: 2X | ||
| Blocking/antibody oplossing | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovijn serum albumine, 500mL normaal serum) | ||
| Bovine gelatine om EC VCCC te coaten | Meng 0.5g bovijn gelatine in 100mL gedistilleerd water. Autoclaveer voor het eerste gebruik en bewaar op kamertemperatuur. Houd in steriele omstandigheden. Eindconcentratie: 0.50% | ||
| 1x PBS voor het oogsten van cellen | Hoeft niet sterieel te zijn |
Referenties
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endot....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
