Method Article

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

DOI:

10.3791/56004

⸱

September 28th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteïnen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Noncoding RNAs spelen een belangrijke rol in verschillende nucleaire processen, waaronder regulering van de expressie van genen, structuur van de chromatine en DNA-herstel. In de meeste gevallen is het optreden van noncoding RNAs gemedieerd door eiwitten waarvan de functies zijn op hun beurt weer gereguleerd door deze interacties met noncoding RNAs. In overeenstemming met dit, een groeiend aantal eiwitten die betrokken zijn in nucleaire functies hebben gemeld RNA binden en in enkele gevallen de RNA-bindende regio's van deze proteïnen zijn toegewezen, vaak door middel van moeizame, kandidaat-gebaseerde methoden.

Wij rapporteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een hoge-doorvoer, Proteoom bestrijkende onbevooroordeelde identificatie van RNA-bindende proteïnen en hun RNA-bindende regio's. De methodologie steunt op de opneming van een fotoreactief uridine analoge in de cellulaire RNA, gevolgd door UV-gemedieerde eiwit-RNA crosslinking en spectrometrische analyse te onthullen van RNA-kruisverwijzende peptiden binnen het proteoom. Hoewel we de procedure voor de muis embryonale stamcellen beschrijven, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van gekweekte cellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van de methode van de RBR-ID is het identificeren van de roman RNA-bindende proteïnen (RBPs) en hun RNA-bindende regio's (RBRs) kaart met peptide tabelniveau resolutie ter vergemakkelijking van het ontwerp van RNA-bindende mutanten en het onderzoek van de biologische en biochemische functies van eiwitten-RNA interacties.

RNA is uniek onder biomoleculen zoals het kan fungeren als een boodschapper uitvoering van genetische informatie én ook in complexe driedimensionale structuren met biochemische functies meer verwant aan die van eiwitten1,2 vouwen. Een groeiende hoeveelheid....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cultuur en uitbreiding van mESCs

Opmerking: muis embryonale stamcellen zijn eenvoudig te cultuur en kan snel worden uitgebreid tot de grote aantallen voorgeschreven biochemische experimenten dankzij hun snelle fietsen tijd. Gezonde mESCs verdubbelen elk 12 h.

  1. Uitvouwen mESCs naar het gewenste nummer op gelatinized platen in mESC medium (zie hieronder) in een incubator weefselkweek bewaard bij 37 ° C, 5% CO 2, en > 95% vochtigheid.
    Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont de workflow van de RBR-ID. Als gevolg van de relatief lage crosslinking efficiëntie van deze techniek is het zeer belangrijk dat zowel het niveau van de uitputting en de consistentie van het waargenomen effect (P -waarde) over biologische wordt gerepliceerd. Figuur 2 toont een vulkaan plot van RBR-ID resultaat. Peptiden dat RNA erkenning motief (SRM) domein overlapt geven zeer consistente uitputting graad........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een gedetailleerde experimenteel protocol standaardinteracties RBR-ID in mESCs en met adequate wijzigingen, in een willekeurige cel die 4SU in RNA kunt opnemen. Andere celtypes voorschrijven optimalisatie van de aanpak om ervoor te zorgen een voldoende signaal / ruisverhouding. Bovendien, terwijl het protocol hierin richt zich op de behandeling van nucleaire RBPs beschreven, moet de technologie van de RBR-ID worden gemakkelijk aangepast aan verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytosol of spec.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.B. werd ondersteund door het programma van de geleerden Searle, de W.W. Smith Foundation (C1404) en de March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G erkent ondersteuning van NIH grants R01GM110174 en NIH R01AI118891, en DOD verlenen BC123187P1. R.W.-T. werd gesteund door de NIH opleiding grant T32GM008216.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KnockOut DMEMFisher Scientific10829018
Fetal bovine serum, qualified, US originFisher Scientific26140079
L-Glutamine solution 200 mMSigmaG7513
Penicillin-Streptomycin solutionSigmaP0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)SigmaM7145
2-MercaptoethanolSigmaM3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)EMD MilliporeESG1106
CHIR99021Tocris4423
PD0325901SigmaPZ0162
Gelatin solution,2% in waterSigmaG1393
4-thiouridineSigmaT450950 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500Fisher Scientific11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma78830
IGEPAL CO-630Sigma542334Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
IodoacetamideSigmaI6125
Trypsin, sequencing gradePromegaV5111
Empore solid phase extraction disk3M66883
OLIGO R3 Reversed - Phase ResinFisher Scientific1133903
BenzonaseSigmaE8263High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100Fisher Scientificdiscontinuedupdated with FB505110
HPLC grade acetonitrileFisher ChemicalA955-4
HPLC grade waterFisher ScientificW6 4
TFAFisher ScientificA11650
Ammonium BicarbonateSigmaA6141
Acetic AcidSigma49199
Formic AcidSigmaF0507
ReproSil-Pur 18-AQDr. Maisch GmbH HPLCr13.aq.0003Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm)Molex1068150017
MaxQuant softwareMax Planck Institute for BiochemistryCan perform chromatographic alignment of multiple MS runs

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
  2. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
  3. Rinn, J. L., Chang,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Binding ProteinsUV CrosslinkingMass SpectrometryPhotoreactive UridineNuclear LysateStage Tip PurificationPeptide ElutionNuclease TreatmentPAR CLIP ValidationMouse Embryonic Stem Cells

Related Articles