Methodenartikel

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

DOI:

10.3791/56021

⸱

14 september 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestaan van endotheliale voorlopercellen (Spoon) in perifeer bloed en haar betrokkenheid in vasculogenese werd eerst gemeld door Ashara en collega's1. Later, gedocumenteerd anderen het bestaan van gelijkaardige types van Spoon afkomstig uit beenmerg2,3. Meer recentelijk, Yoder en Ingram bleek dat Spoon afgeleid van navelstrengbloed had een hogere proliferatieve potentieel in vergelijking met degenen geïsoleerd van volwassene perifere bloed4,5,6. Afgezien van betrokkenheid bij postnatale vasculogenese, Spoon ook is gebleken belofte als een bron van de cel voor het maken van weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel constructies7,8. Er zijn diverse protocollen van de isolatie, waarvan sommige betrekking hebben op de cel sorteren van mononucleaire cellen (MDL) afkomstig van de bronnen die eerder vermeld met behulp van endotheliale en hematopoietische markers of kweken van deze multinationals met gespecialiseerde endothelial groei medium, of een combinatie van deze technieken-9. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en cultuur van Spoon met behulp van gespecialiseerde endothelial medium aangevuld met factoren die de groei, zonder het gebruik van immunosorting, gevolgd door de karakterisatie van de geïsoleerde cellen gebruikend het westelijke bevlekken en immunokleuring.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele onderzoekers hebben onderzocht de kenmerken en mogelijkheden van menselijke Spoon5,10,11,12,13. Spoon kunnen worden omschreven als het circulerende cellen die de mogelijkheid om te voldoen aan endothelial weefsel in sites van hypoxie, ischemie, letsel of tumor vorming en bijdragen tot de vorming van nieuwe vasculaire structuren4,14. Hun waargenomen betrokkenheid in neovascularization, in de vorm van postnatale vasculogenese, heeft geleid tot een goed begrip van de pathofysiologie van deze cellen en hun gebruik in therapeutische toepassingen4,15, 16. het aantal Spoon in een individu is aangetoond te worden gecorreleerd met cardiovasculaire pathologie9,15,16,17,18,19 ,20. Andere studies hebben ook onderscheid gemaakt tussen Spoon een ventiel fibroblast-achtige fenotype en voorgesteld dat deze cellen kunnen worden gebruikt voor weefselengineering hart kleppen7,21.

De bepaalde cel oppervlakte moleculen die nodig zijn voor het isoleren van Spoon zijn niet duidelijk geïdentificeerd als gevolg van de verschillen tussen de onderzoeken4. De hechting van MDL naar een bepaalde matrix, met de blootstelling aan een verscheidenheid van kweekomstandigheden, is uitgevoerd door verschillende groepen1,17,22,23, suggereren dat vermeende Spoon kan verschillende fenotypische eigenschappen weergeven Deze eigenschappen omvatten een gebrek aan phagocytotic vermogen, buis vorming in Matrigel, en de opname van low-density lipoproteins Dil-geacetyleerd. De hoge clonogenic en proliferatieve potentieel zijn twee eigenschappen met welke Spoon hierarchized5 kunnen. Spoon kunnen ook in vitro tubuli wanneer cocultured met menselijke foetale Long fibroblasten4vormen. Deze cellen zijn bekend uitspreken endothelial cel oppervlakte markeringen en sommige van de hematopoietische markeringen13,24,25te delen. De positief geformuleerde markeringen die zijn geaccepteerd voor fenotypering Spoon zijn CD31, CD34, vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit, en vasculaire endothelial cadherine (VE-cadherine)4 , 18. cellen die mede express CD90, CD45, CD14, CD115 of alpha-gladde spier actine (α-SMA) worden niet beschouwd als Spoon omwille van hun beperkte proliferatieve potentiële, vermogen om de phagocytose van bacteriën, en het onvermogen om te vormen van DOVO menselijke schepen in vivo4,7. Dit artikel schetst een gewijzigd protocol voor de isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed zonder de behoefte aan een willekeurige cel sorteren van protocollen. Voor dit artikel, hebben we een aantal CD31, CD34 en VEGFR2 als de positieve markers, met α-SMA als negatieve indicator gebruikt.

In dit artikel, stellen wij voor een methode van isoleren en kweken van endotheliale voorlopercellen van navelstrengbloed zonder cel sorteren via gespecialiseerd endothelial groeimedium aangevuld met groeifactoren (BAVA). Deze BAVA bevat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor (FGF), die de overleving, proliferatie, en migratie van endotheliale cellen26te vergroten. Het omvat ook ascorbinezuur, die verantwoordelijk is voor het behoud van de geplaveide morfologie van cellen; insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1), waarin angiogenic en trekkende functie; en heparine, waardoor verbeterde stabiliteit op lange termijn van de factoren die de groei in de middelgrote26. Andere factoren die de groei toegevoegd aan het kweekmedium endothelial cel bevat suppletie met epidermale groeifactor (EGF), die helpt bij het stimulerende celproliferatie en differentiatie en hydrocortison, die de cellen met EFG26 sensibiliseert . We laten zien dat het gebruik van deze specifieke groeisnelheid medium hogere aantallen Spoon t.o.v. endothelial Basaal medium (EBM) of Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM levert).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dit onderzoek werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van Arkansas institutionele Review Board (erkenningsnummer 16-04-722). Navelstreng bloed eenheden werden verzameld in citraatoplossing fosfaat dextrose (CPD) op de Arkansas navelstrengbloed Bank en eenheden die niet voldeed aan de eis voor opslag werden geschonken voor onderzoek. Koord bloed eenheden werden methoden.NETeller naar het lab binnen de 24u van collectie bij omgevingstemperaturen.

1. isolatie van endotheliale voorlopercellen uit navelstrengbloed

  1. bereiding van reagentia.
    1. Bereiden BAVA door endothelial Basaal medium (EBM) toe te voegen aan 10% foetale runderserum (FBS) aangevuld met 20 ng/mL van insuline-achtige groei factor (IGF), 1 µg/mL ascorbinezuur, 5 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor (rhEGF), 22.5 µg Mo/mL heparine en 0,5 ng/mL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), samen met 10 ng/mL van recombinante menselijke Fibroblast groeifactor B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortison en 2% penicilline-streptomycine-glutamine. Steriliseren van het kweekmedium met behulp van een 0,2 µm polyethersulfon (PES) vacuüm membraanfilter.
    2. Voorbereiden rat staart ik collageen oplossing bij een concentratie van 50 µg/mL met behulp van 0,02 N azijnzuur. Steriliseren van deze oplossing met behulp van een filter van de spuit 0,2 µm.
    3. Pre vacht 6-Wells-platen met 2 mL bereid rat staart ik collageen oplossing voor elk putje. Plaats ze in een incubator gehandhaafd op 5% CO 2 en 37 ° C gedurende ten minste 1 uur vóór het zaaien.
    4. Verdun ongeveer 25 mL van navelstrengbloed met Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met een concentratie van 1:1.
    5. Neerslag van voorbereiden radio-immuno assay (RIPA) Buffer met behulp van 150 mM natriumchloride, 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholate, 1 mM β-glycerophosphate, 0,1% SDS en 50 mM Tris (pH 8,0).
  2. Isolatie van endotheliale voorlopercellen.
    1. Warme all bereid reagentia in een waterbad op 37 ° C vóór isolatie gehouden.
    2. 20 mL dichtheid kleurovergang middellange reagens toevoegen aan een centrifugebuis 50 mL.
    3. Zorgvuldig laag 20 mL verdunde navelstrengbloed in de centrifugebuis met kleurovergang medium dichtheid zonder deze laag door te streven de pipet naar de zijwanden van de buis breken.
    4. Scheiden de componenten van bloed op basis van hun dichtheid ( Figuur 1) door centrifugatie bij 800 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, met de remmen van de centrifugerotor af. De verschillende lagen niet storen.
    5. Verwijder de plasma laag waarbij eveneens het zorgvuldig uit de buis zonder verstoring van andere cel lagen totdat het uiteinde van de pipet vermag bereiken de MNC horizont (Zie Figuur 1). Negeren van het plasma is verwijderd.
      Opmerking: Tijdens het gebruik Pipetteer tips voor het verwijderen van het plasma, laat een kleine laag van plasma boven de MNC laag ( Figuur 1) om verstoringen.
    6. De buffy coat waarin de multinationals met behulp van een injectiespuit op een 18-gauge naald gemonteerd verzamelen en overbrengen naar een verse centrifugebuis.
    7. Een gelijk volume van EBM op toevoegen aan de verzamelde Centrifuge MDL. deze buizen 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Discard het supernatant.
      Opmerking: De cel pellet verschijnt rode vanwege de aanwezigheid van rode bloedcellen/erytrocyten.
    8. Voeg 5 mL van de ammoniumchlorideoplossing lyse van de rode bloedcellen. Incubeer deze buis op ijs gedurende 5-10 minuten, met af en toe schudden.
      Opmerking: Let op moet worden genomen tijdens deze stap niet meer bedragen dan de tijdsduur, zoals het schadelijk voor de MDL zijn kan.
    9. Centrifugeren van de buizen bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Als de erytrocyten aanhouden, herhaal stap 1.2.8 en 1.2.9 totdat geen rode kleur wordt waargenomen in de pellet.
    10. Resuspendeer de pellet in bereid BAVA en gebruiken de hemocytometer om te tellen van de MDL.
    11. Aspirate de rat staart ik collageen beklede 6-well plaat (uit stap 1.1.3) en was de putjes drie keer met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    12. Zaad de MNC pellet geresuspendeerde in BAVA aan de collageen-plaat met een concentratie van 1 x 10 7 MDL in elk putje. Plaats deze in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    13. Na 24 h, gecombineerd het medium en was de putjes goed eenmaal met BAVA. Voeg 3 mL van BAVA medium aan elk putje en plaats deze terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    14. Vullen de plaat met verse BAVA medium elke dag gedurende 7 dagen. Na 7 dagen, wijzigen de BAVA medium om de andere dag.
    15. Afbeeldingen van de 6-well plaat met behulp van een helder-veld Microscoop, neem elke dag om bij te houden van de progressie van endothelial cel kolonies. Mark van de plaat waar de kolonies ontstaan voor het bijhouden van hun groei.
      Opmerking: Het duurt meestal tussen de 5 en 9 dagen voor de koloniën die in cultuur.
  3. Uitbreiding van endotheliale voorlopercellen.
    1. Jas de T-25 cultuur kolf met rat staart ik collageen (50 µg/mL) en plaats deze in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 60 min. Aspirate en wassen van de T-25 cel cultuur kolf driemaal met 1 x PBS vóór het zaaien van de cellen.
    2. Trypsinize de kolonies endothelial cel wanneer ze ongeveer 3 mm in grootte met 150 µL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% in elk putje bereiken. Plaats de 6-well plaat terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator gedurende 2-3 minuten
    3. Tik zachtjes op de 6-well plaat om te verjagen van de gekoppelde cellen. Onmiddellijk Voeg toe 2 mL BAVA en herstellen de cellen in een centrifugebuis 15 mL.
    4. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en berekenen van de eerste seeding dichtheid.
    5. Spin de 15 mL centrifuge buizen bij 400 x g gedurende 5 min. resuspendeer de pellet cel in BAVA en de T-25 fles met ~ 500.000 cellen beënt. Markeer deze kolf als Passage 1 en plaats de kolf T-25 terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
      Opmerking: Cellen kunnen worden bekleed in de EBM en DMEM te vergelijken van de groei met BAVA.
    6. Voor verdere passages, wanneer de kolf 90% samenvloeiing bereikt, stappen 1.3.1 - 1.3.5 en reseed de cellen op 10 4 cellen/cm 2 in T-75 of T-175 cel cultuur kolven. Gaat u verder met de karakterisering van de geïsoleerde cellen (stap 2 en 3).

2. Karakterisering van geïsoleerde cellen met behulp van westelijke bevlekken

  1. toevoegen 50-100 µL van lysis buffer bij elke passage wanneer de uitbreiding als volgt te karakteriseren de geïsoleerde cellen. Verzamelen van eiwitten uit ongeveer 500.000 of meer cellen.
  2. Pipetteer krachtig op en neer te scheuren van de cellen en de vrijgave van de eiwitten. Verzamelen en overdragen van de buffer aan een buis microcentrifuge.
  3. De microcentrifuge buis 500 x g spin en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Label en opslaan van de buizen bij-80 ° C voor langetermijnopslag.
  4. Kwantificeren van de hoeveelheid eiwitten in elke buis met behulp van beide Bradford ' s of BCA assay 27 , 28 , 29.
  5. Verrichten westelijke bevlekken met behulp van standaardprocedures 27 , 28 , 29. Analyseren 5 µg van totale eiwitten voor de expressie van CD31, CD34, VEGFR2 en α-SMA. Α-tubuline gebruiken voor de gegevens normaliseren.

3. Indirecte immunofluorescentie

  1. Bewerk ultrasone trillingen ten 18-mm glas coverslips in 50% ethanol en droog ze af. Laat de schone coverslips in een 12-well plaat overnachting in de bioveiligheid kap met een UV licht op om ze te steriliseren.
  2. Jas de coverslips met 50 & #181; g/mL rat staart ik collageen en overdracht van de plaat naar een 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 60 min.
  3. Gecombineerd de collageen en voeg 1 mL 1 x PBS aan de 12-well plaat te wassen van de coverslips. De PBS 1 x gecombineerd en tweemaal herhalen.
  4. Zaad 250.000 gekweekte Spoon in elk goed en plaats ze terug in de 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor ten minste 3 dagen vóór de uitvoering van immunokleuring.
  5. Wassen de plaat 3 keer met 1 x PBS. Voeg 1 mL ijskoud methanol aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om op te lossen van de cellen.
  6. Verrichten immunokleuring met behulp van een standaard protocol 27 , 28 , 29. Gebruik de antilichamen in hun juiste verdunningen (b.v., CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1:100) en VEGFR2 (1:50)).
  7. Nemen de beelden van de coverslips van de immunostained met behulp van een Microscoop epifluorescence.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie en uitbreiding van endotheliale voorlopercellen:
Een schema (Figuur 1) wordt geleverd aan de beeltenis van het algemeen protocol. De verschillende bloed component lagen werden waargenomen na verloop centrifugeren van de dichtheid van menselijke navelstrengbloed met kleurovergang medium dichtheid. Bij zaaien MDL op de platen van collageen-behandeld, werd de uitgroei van de koloniën eerst waargenomen tussen dagen 5 en 7(

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals eerder vermeld, aanhanger Spoon bezitten een geplaveide morfologie. Onze geïsoleerde MDL gevorderd van een spindel-vormig cel kolonie (Figuur 2A-2D) in een vroeg stadium naar een geplaveide kolonie (Figuur 2E-2F) over een periode van tien dagen in cultuur. Spoon hebben het label verschillend door verschillende onderzoeksgroepen, namelijk als laat endothelial progenitor cellen10, endotheel kolonievor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder Grant nr. CMMI-1452943 en door de Universiteit van Arkansas Honors College. Wij willen ook te erkennen van de Arkansas navelstrengbloed Bank voor het verstrekken van ons met koord bloed eenheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A) Voor isolatie en cultivatie
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Dit product bevat alle groeifactoren die nodig zijn om het Endotheel Groei Medium te maken
Fetal Bovine SerumThermofisher Scientific26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02
Hank's Balanced Salt SolutionThermofisher Scientific14170-112
Ammonium ChlorideStem Cell Technologies7850
1x Phosphate Buffer SalineThermofisher Scientific14190250
Rat Tail I CollagenCorning354236
Glacial Acetic AcidAmresco0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25300054
HEPES bufferThermofisher Scientific15630080
Dulbecco's Modified Eagle's MediumThermofisher Scientific10566-016
B) Antilichamen en cellysaten
CD31Abcamab283641:250 verdunning voor Western blotting
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-70451:100 verdunning voor Western blotting
α-SMAabcamab56941:100 verdunning voor Western blotting
α-tubulinabcamab72911:2.500 verdunning voor Western blotting
VEGFR2abcamsc5041:100 verdunning voor Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysateSanta Cruz Biotechnologysc24709
Valve interstitial cell lysatePrimaire cellijn gekweekt van eigen lab en gelyseerd met RIPA buffer
C) Western blotting en immunokleuring
10x Tris/Glycine/SDS bufferBiorad161-0772Gebruikt als running buffer
10x Tris/Glycine bufferBiorad161-0771Gebruikt als transfer buffer
Immobilon-FL transfer membraanMerck MilliporeIPFL0010Dit is een PVDF transfer membraan met 45 µm poriëngrootte en wordt in het protocol vermeld als western blot membraan
4x Laemmli sample bufferBiorad161-0747
2-mercaptoethanolBiorad161-0710
10% Criterion TGX voorgevormde gelBiorad5671033
Prolong Gold antifadeThermofisher ScientificP36930Gebruikt voor het monteren van immunokleuring coverslips voor langdurige opslag
MethanolVWR AnalyticalBDH1135-4LP

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
  3. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
  4. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  5. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
  8. Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
  9. Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
  10. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  11. Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
  12. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  13. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
  14. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692(2012).
  15. Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
  16. Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
  17. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  18. Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
  19. Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
  20. Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
  21. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
  22. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  23. Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
  24. Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
  25. Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
  26. Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
  27. Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330(2016).
  28. Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
  29. Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
  30. Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celisolatiedichtheidsgradi ntcentrifugatieendotheelgroeimediumWestern blot analysekarakterisering via immunokleuringcollageencoatingcelkweekincubatiekolonievorming

Gerelateerde artikelen