Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56093

⸱

21 september 2017

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Samenvatting

Dopamine (DA) is een f neurotransmitter beheersing van motorische activiteit, beloning processen en cognitieve functie. Bijzondere waardevermindering van de Dopaminerge (DAergic) transmissie is sterk geassocieerd met diverse centrale zenuwstelsel-geassocieerde ziekten zoals de ziekte van Parkinson, aandacht-deficit-hyperactivity disorder en drug verslaving1,2 ,3,4. Uitgezet ziekte mechanismen waarbij DA onbalans is kritisch afhankelijk van diermodellen om na te bootsen van aspecten van de ziekten, en dus protocollen die specifieke delen van de DA-homeostase te beoordelen zijn belangrijk om te bieden van nieuwe inzichten en mogelijke therapeutische doelstellingen voor deze ziekten.

Hier presenteren we twee nuttige experimentele protocollen die combinatie bieden een functionele uitlezing van het systeem van de DAergic in muizen. Biochemische en functionele parameters op DA homeostase zijn verkregen door middel van de beoordeling van de niveaus van de DA en dopamine transporter (DAT) functionaliteit5. Bij het onderzoeken van de DA-systeem, is de mogelijkheid voor het betrouwbaar meten endogene voor DA van volwassen hersenen essentieel. Daarom presenteren we het uitvoeren van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) op hersenweefsel van muizen om niveaus van DA. Wij voeren het experiment op weefsel van de dorsale striatum (dStr) en nucleus accumbens (NAc), maar de methode is ook geschikt voor andere DA-geïnnerveerd hersengebieden.

DAT is essentieel voor reuptake voor DA in de presynaptische terminal, waardoor beheersing van de temporele en ruimtelijke activiteit van vrijgegeven DA. Het kennen van de niveaus en de functionaliteit van DAT in het striatum is van groot belang bij de beoordeling van DA homeostase. Hier, bieden wij een protocol waarmee gelijktijdig om informatie te deduceren op oppervlakte niveaus en functie met behulp van een synaptosomal6 DA opname assay.

Huidige methoden gecombineerd met standaard immunoblotting protocollen bieden de onderzoeker met relevante tools karakteriseren van het DAergic-systeem.

Inleiding

Dopamine (DA) is een cruciaal voor motor gedrag, de beloning en de cognitieve functie1,,7,,8,9f neurotransmitter. Onevenwichtigheden in de homeostase van de DA zijn betrokken bij verschillende neuropsychiatrische ziekten zoals de wanorde van de Hyperactiviteit van de aandacht-tekort, drugsverslaving, depressie en de ziekte van Parkinson1. DA is vrijgelaten uit het presynaptische neuron in de synaptische spleet, waar het aan bindt en activeert de receptoren op de pre- en postsynaptisch membraan, waardoor verdere overbrengen van het signaal. Het niveau van DA in de synaps na release is ruimtelijk en stoffelijk gecontroleerd door DAT3,10. De vervoerder sequesters DA van de extracellulaire ruimte, en dus voedt fysiologische DA niveaus-3,11. Genetische verwijdering van DAT bij muizen veroorzaakt een hyperdopaminergic fenotype gekenmerkt door verhoogde synaptic DA niveaus, uitputting van intracellulaire DA zwembaden en ingrijpende veranderingen in postsynaptisch DAergic signalering van10,12.

Hier twee afzonderlijke protocollen worden gepresenteerd, een methode maatregel DA weefsel inhoud en een andere om te beoordelen van de functionaliteit van DAT. gecombineerd met de bepaling van de oppervlakte biotinylation beschreven door Gabriel et al.13 deze twee methoden bevatten informatie over DA inhoud en functionele niveaus van DAT voor een grondige beoordeling van DA homeostase. Met deze methoden kunt DA homeostase van verschillende transgene muizen of modellen van de ziekte worden gekenmerkt en beschreven. Deze hulpprogramma's zijn uitgevoerd en geoptimaliseerd en zijn standaard gebruik in onze laboratoria. Huidige testen hebben gediend om te onderzoeken van de gevolgen voor de DA-homeostase van het veranderen van de C-terminal van DAT14 of uiting van Cre recombinase onder de tyrosine hydroxylase (TH) promotor 5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

de richtsnoeren van het inspectoraat van de Deense dier experimenten (toestemming nummer: 2017-15-0201-01160) werd gevolgd en experimenten uitgevoerd in een volledig AAALAC geaccrediteerde faciliteit onder toezicht van een lokale dierenwelzijn Comité.

1. synaptosomal Dopamine opname (methode 1)

Opmerking: dit protocol is voor parallelle beoordeling van twee hersenen, maar kan met succes worden gebruikt voor het uitvoeren van synaptosomal DA opname experimenten met vier hersenen in parallelle.

  1. Preparaten
    1. Label 48 1,5 mL micro-centrifuge buizen per tabel 1 (24 voor elke hersenen). Verschillende kleuren gebruiken voor de buizen die behoren tot elke hersenen om te voorkomen dat verwarring tussen monsters
    2. Label 51 Scintillatie buizen #1-51.
    3. Plaats met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Dit zal worden gebruikt om te houden van de hersenen gekoeld.
    4. Zet de centrifuge naar laat vooraf afkoelen tot 4 ° C.
    5. Vooraf wegen twee micro-centrifuge buizen om de exacte weefsel gewicht tijdens de synaptosomal voorbereiding (punt 2.6).
    6. Voorbereiden homogenisering buffer door het mengen van 4 mM HEPES en 0.32 M sacharose. Breng de pH op 7.4 en houden op ice.
      Opmerking: Homogenisering buffer kan worden gehouden in aliquots bij-20 ° C en de dag van het experiment ontdooid.
    7. Voorbereiden opname buffer door het combineren van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L). Breng pH op 7.4 met NaOH (leidt tot een concentratie natrium van ongeveer 130 mM) en houd op ice.
      Opmerking: Voor 2 hersenen, bereiden 1500 mL opname buffer. Voorbereiding van opname buffer als een 10 x stockoplossing zonder ascorbinezuur en glucose bewaard bij 4 ° C. Make 1 x werkoplossing vers op de dag, aan te vullen met ascorbinezuur en glucose. Breng de pH met NaOH aan 7.4.
    8. Voorbereiden opname buffer + ligand door het combineren van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaC l2 1.2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine, 10 nM Inhibitor van het catechol-O-methyl-transferase (COMT). Passen aan pH 7.4 met NaOH en houden op ice.
      Opmerking: Gebruik van 50 mL opname buffer en ligand toevoegen. Pargyline is toegevoegd om te voorkomen dat de afbraak van DA door oxidatie door monoamine oxidase (MAO). COMT-inhibitor (RO-41-0960) is toegevoegd ter voorkoming van achteruitgang van de DA (catecholamines in het algemeen) via COMT. Desipramine wordt toegevoegd aan de remming van de opname via de noradrenaline en serotonine vervoerders, en aldus de opname resultaten specifiek voor DAT.
    9. Voorbereiden opname buffer ligand + cocaïne door de combinatie van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine , 10 nM COMT-inhibitor, 500 μM cocaïne. Breng pH op 7.4 met NaOH en houden op ice.
      Opmerking: Gebruik 7 mL opname buffer + ligand en toevoegen van cocaïne. Cocaïne wordt toegevoegd aan het verkrijgen van een meting van de achtergrond van aspecifieke DA opname wilt aftrekken van de gegevens, alleen de opname van DAT specifieke verlaten (omdat SERT en NET zijn geremd door desipramine zoals hierboven beschreven). U kunt ook een zeer potente en specifieke DAT remmer GBR-12935, in plaats daarvan kunnen worden gebruikt.
      Belangrijk: Houd alles op ijs voortaan .
  2. Synaptosomal voorbereiding
    1. offeren van één muis tegelijk door cervicale dislocatie en onthoofding.
    2. Knippen de huid met behulp van schaar te onthullen van de schedel en afgesneden van alle overtollige weefsel posterior schedel links van onthoofding. Snijd de schedel met een kleine rechte schaar langs de sutura sagittalis als anteriorly mogelijk eindigen.
    3. Plaats van de twee scissor-tips in elk van beide ogen van de muis en doorsnijden schedel te verwijderen van de rest van de schedel en de hersenen intact. Snel verwijderen van de hersenen en plaats deze in de ijskoude PBS. Dit zorgt ervoor dat het koud, terwijl de tweede hersenen is ontleed.
    4. Met behulp van een matrix van de hersenen, het ontleden van een 3 mm coronale segment van het striatum (anterior-posterior: minimaal 1,5 mm tot-1.5 mm) gevolgd door fijnere dissectie met een perforatie. Zie afbeelding 1 voor punch gebied.
    5. Houden van het weefsel op ijs op alle tijden vooruit.
    6. Het weefsel overbrengen in een 1,5 mL micro-centrifuge buis voor weging.
      Opmerking: Dit gewicht wordt gebruikt in stap 1.2.14.
    7. Herhaal stap 1.2.1-1.2.6 voor de tweede hersenen.
    8. Zodra gewicht heeft verkregen voor beide hersenen, het weefsel overbrengen in een homogenisering glas met ijskoude homogenisering buffer 1 mL.
    9. Meng het weefsel met een motor aangedreven stamper 800 rpm 10 zelfs lijnen.
      Opmerking: Een beroerte is gelijk aan een op en neer de actie, de eerste lijn moet ongeveer 5 s, de volgende 3-4 s. homogenisering in isotone medium belangrijk is om te voorkomen dat het uiteenspatten van de synaptosomes 6. Met behulp van de juiste kracht en isotone medium kunt de presynaptische terminals reseal omsluitende cytoplasma, synaptische vesikels, mitochondriën en cytoskelet 15.
    10. Het homogenaat overbrengen in een 1,5 mL micro-centrifuge buis en de resterende homogenaat van het glas van de homogenisering verzamelen door te spoelen met 0,5 mL extra homogenisering buffer.
    11. Houden het monster op het ijs terwijl het weefsel van de andere hersenen is gehomogeniseerd. De twee hersenen lopen parallel in stappen 1.2.12-1.2.13.
    12. Pellet de kernen en cel puin door middel van centrifugeren (1.000 x g, 10 min, 4° C).
    13. Het supernatant (S1) (met celmembranen en cytoplasma) overbrengen naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen samen en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
    14. Verwijder het supernatant (met cytoplasma) en resuspendeer de pellet (P2) (met ruw synaptosomes) in 40 μL homogenisering buffer / mg weefsel (gebaseerd op het gewicht verkregen in stap 1.2.6). De ruwe synaptosomal breuk met een p1000 pipet zachtjes resuspendeer als te veel kracht de synaptosomes breken zal.
      Opmerking: Het is belangrijk om te eindigen met ten minste 280 μL. Als dat niet het geval is, verdunnen met meer dan 40 μL per mg nodig zal zijn. Stappen 1.2.1-1.2.13 zo snel mogelijk moeten worden uitgevoerd, en alles moet worden gehouden op het ijs. Zodra de ruwe synaptosomes hebben zijn geresuspendeerde in homogenisering buffer ze zijn redelijk stabiel zo lang als ze worden gehouden op ijs 6 , 15 , 16.

2. Opname Experiment

  1. toevoegen 440 μL opname buffer ligand + cocaïne naar de aangewezen 12 1,5 mL microcentrifuge buizen en 440 μL opname buffer + ligand aan de resterende 1,5 mL microcentrifuge buizen (Zie tabel 1 voor de lay-out) 36.
    Opmerking: Verwijderen uit het ijs 15 min voor aanvang van het experiment te Breng hen op kamertemperatuur, maar houd op ijs totdat dan voor de instandhouding van remmers.
  2. Voorbereiden verzadiging curve (dopamine (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamine) (91.1 Ci/mmol) op verschillende eindconcentraties (0.031, 0.0625 0,125, 0,25, 0.5 en 1.0 μM)).
    1. Label zes 2 mL microcentrifuge buizen als 10, 5, 2.5, 1,25, 0.62 en 0.31.
    2. Toevoegen 750 μL opname buffer + ligand aan de 5 microcentrifuge buizen met laagste getal.
    3. Toevoegen 1,455.4 μL opname buffer + ligand, 14.6 μL dopamine (1 mM), 30 μl 3-H dopamine (11 μM) aan de buis geëtiketteerd 10.
    4. Transfer 750 μL van de buis geëtiketteerd 10 aan de buis 5 geëtiketteerd. Meng goed en 750 μL van deze buis overbrengen naar de 2.5 buis. Herhaal deze verdunning met de overige buizen.
  3. De filters microfiber glas met 4 mL opname buffer vooraf te spoelen na het plaatsen van hen op een emmer 12 goed filter.
  4. Voeg toe 10 μL van de ophanging van de synaptosomal membraan naar de eerste 24 1,5 mL micro-centrifuge buizen (Zie tabel 1 voor de lay-out) met 440 μL buffer. Vortex zorgvuldig en spin down kort om ervoor te zorgen dat de synaptosomes worden ondergedompeld in de buffer. Bij 37 o C gedurende 10 minuten laten
    Opmerking: Het is belangrijk om precies te zijn op de tijden tijdens de opname experiment voor een billijke vergelijking tussen de hersenen. Gebruik een stopwatch voor precisie.
  5. Toevoegen 50 μl dopamine van concentratie 10 en 5 μM (punt 2.2) aan de eerste twee kolommen en verlof op 37 o C gedurende 5 minuten met schudden. Na precies 5 min, zet de reactie stop door toevoeging van 1 mL ijskoud opname buffer. Doe hetzelfde met concentratie 2.5 en 1,25 μM (punt 2.2) en vervolgens met concentratie 0.62 en 0,31 μM.
  6. De monsters aan de vooraf gespoeld microfiber filters toevoegen en wassen met 5 x 4 mL ijskoud opname buffer. Wanneer de eerste 12 monsters zijn toegevoegd aan de filters, verplaatst u de filters Scintillatie buizen. Herhaal dit met de volgende 12 monsters.
  7. Herhaal stap 2.4-2.6 voor de volgende hersenen.
  8. Max-tellen bereiden 3 buizen door het plaatsen van een microfiber filter in de bodem van scintillatie buizen 49-51 en toevoegen van 25 µL van de concentratie van de maximale dopamine bovenop (10 μM).
  9. Laat alle 51 Scintillatie buizen in een zuurkast voor 1 h.
  10. Voeg 3 mL Scintillatie vloeistof elke Scintillatie buis hermetisch en schud krachtig op een shaker voor 1 h.
  11. Tellen [3 H]-DA in een bèta-teller voor 1 min.
    1. Open het programma en kies: Label: H-3, plaat/Filter: 4 mL flacon, 4 door 6, Assay type: normaal en tellen van de tijd: 1 min.
      Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd de volgende dag als handiger. Monsters bedekt met aluminiumfolie over nacht verlaten.
  12. Eiwit bepaling
    1. gebruik van een standaard BCA eiwit Assay kit om eiwit concentraties van de synaptosomes voor aanpassingen van tellingen per min (cpm) fmol/min/μg en deugdelijke vergelijking van opname tussen monsters.

3. Data-analyse

  1. Gebruik de gegevens uit de opname experiment om een verzadiging van de kromme voor elke groep en bereken het percentage van de reactie (V max) en de constante Michaelis Menten (K M).
    Opmerking: De waarde van K M weerspiegelt de concentratie van de ondergrond nodig is om de helft van V max. Dienovereenkomstig, V max direct weerspiegelt de functie van DAT (maximale opname capaciteit), die afhangt van het aantal DAT op het oppervlak en op hoe de activiteit kan worden gedifferentieerd door posttranslationele modificaties en/of interacterende eiwitten en wijzigingen in ion verlopen. De waarde van K M is een indirecte maat van substraat affiniteit voor de vervoerder die, belangrijker ook kan worden gedifferentieerd door posttranslationele modificaties en/of interacterende eiwitten. Om te beoordelen volledig functionele veranderingen daarom direct bepalen oppervlakte expressie niveaus door bijvoorbeeld een oppervlakte biotinylation assay. Een beschrijving van dopamine reuptake en een uitwerking op de betekenis van de waarden voor de K M en V-max zijn beoordeeld door Schmitz et al. 17.

4. High-performance Liquid Chromatography (methode 2)

  1. hersendissectie
    1. Label en weeg microcentrifuge buizen; één per regio per muis.
    2. Offer één muis tegelijk door cervicale dislocatie en onthoofding. Verwijder snel de hersenen zoals beschreven in punt 1.2. Onmiddellijk verdere dissectie uitvoeren.
    3. Met behulp van een matrix van de hersenen, het ontleden van een 3 mm coronale segment van het striatum gevolgd door fijnere bilaterale dissectie van NAc en dStr met een perforatie. Zie Figuur 3 voor punch gebied.
    4. Overbrengen van het weefsel naar 1,5 mL microcentrifuge buizen en snel plaats op droog ijs. Weeg het weefsel en breng dit terug op de droogijs onmiddellijk.
      Opmerking: Het gewicht van het weefsel is belangrijk voor de berekening van de concentratie later.
      5. Herhaal stap
    5. 4.1.1-4.1.4 met de volgende muis.
      Opmerking: Plaats het weefsel bij 80 o C totdat zij worden verwerkt of onmiddellijk overgaan tot weefsel verwerking.

5. Weefsel voorbereiding

  1. inschakelen centrifuge toe te staan om te vooraf te koelen tot 4 ° C
  2. bereiden de homogenisering oplossing (0,1 N perchloorzuur (HClO 4)) en houden op ice.
  3. Using homogenisering oplossing, bereiden een vers 0.1 pmol/l dopamine-norm van een stamoplossing 1 mM (een 10.000 x verdunning).
    Opmerking: De stockoplossing wordt bereid door ontbinding van dopamine in de homogenisering buffer een voorraad concentratie van 1 mM, die kunnen worden bewaard bij 20 ° C voor ongeveer een maand. Als andere gebieden van de hersenen zijn van belang, de concentratie van de standaard zal moeten worden gewijzigd, aangezien andere hersengebieden met inbegrip van de prefrontral cortex, hippocampus, de substantia nigra en de ventrale tegmental gebied bezitten tot 100 keer minder in vergelijking met het striatum DA.
  4. 500 μL homogenisering oplossing toevoegen aan elk monster (d.w.z. NAc en dStr weefsel; punt 4.1) en meng monsters met behulp van een ultra-homogenizer op volle snelheid voor ongeveer 30 s. houden het monster in ijs water tijdens homogenisering. Tussen elk monster, schoon de ultra homogenizer met water (volle snelheid voor 30 s).
  5. Centrifugeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C, 14.000 x g.
  6. Overdracht ongeveer 200 μl monster tot een glas 0.22 μm filter (1 cm diameter) met behulp van een kunststof spuit van 1 mL.
    Opmerking: Het gebruik van glas filters is niet van belang, zolang de filters gekozen 0,22 μm te verwijderen van de stoffen van ultrahoog moleculair gewicht.
  7. Monsters analyseren door elektrochemisch opsporing (EG)-HPLC methodologie 18 zoals beschreven in sectie 6.

6. Krachtige vloeibare chromatografie analyse

  1. voorbereiden de volgende oplossing voor mobiele fase: Natriumacetaat 55 mM, octanesulfonic zuur 1 mM, Na 2 EDTA 0.1 mM, acetonitril 8% azijnzuur 0,1 M, pH = 3.2.
    Opmerking: Aanpassen pH met 0,1 M azijnzuur. Het is belangrijk om precies met de pH te zijn. De oplossing moet degassed door de on-line degasser (geïntegreerd onderdeel van het HPLC-systeem). Maken van 2 L van de mobiele fase en verander het over één keer per maand (het veranderen wanneer het lawaai merkbaar krijgt). Als gevolg van fluctuaties duurt ongeveer 24 uur aan te passen na het wijzigen van de mobiele fase.
  2. Set-up voor detector:
    1. Set volt output naar 700 mV en temperatuur van 32 ° C op de detector oven; dit is zeer belangrijk. Het maken van een programma van de reeks met de online handleiding. Zie de handleiding voor verdere details). Toevoegen van het programma per tabel 2.
      Opmerking: In deze studie, het programma is ingesteld op automatisch de huidige op set retentietijden, aan te houden de HPLC bij de optimale stroom en houden de pieken van het chromatogram zo uitgebreid mogelijk, maar nog steeds binnen de weergave te wijzigen. Dit is geoptimaliseerd voor striatale lysates van de hersenen van muizen.
  3. Wanneer het programma is toegevoegd aan de detector, maken van een ijkcurve 3 punt, door het injecteren van de standaard drie keer (5, 10 en 15 μl).
    Opmerking: Standaard (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/l = 1 pmol DA)) moeten worden geïnjecteerd elke tiende monster, en monsters aan de dichtstbijzijnde standaard gekalibreerd. Fine tune het systeem de dag voorafgaande aan te passen de standaard 3-punts, en als het chromatogram uit binnen het verwachte bereik komt wordt gecontroleerd. Als aanzienlijke lawaai wordt waargenomen, wijzigt u de mobiele fase. Als een piek is hoger dan 990 mV dan opnieuw het injecteren van het monster in een lager volume of een nieuw bereik-programma en een nieuwe standaard curve maken. De detectiegrens wordt gemeten als 3 keer de ruiswaarde in mV tot de laagste piekwaarde geïnjecteerd voor elke standaard (nb DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT en 5-HT).
    1. Set-up systeem door te openen van de LC-oplossing en analyse 1; deze begint in de on line-modus activeren. Typ gebruikersnaam en wachtwoord en klik op ok. Wachten op LC oplossing verbinden met instrumenten. Ga naar de batchtabel en vul in gegevens (bijvoorbeeld, monster type: onbekend voor monsters en std voor de standaard, soort analyse: het QT, inj volume: 10, ISTD amt: niveau 1 con). Bestand opslaan (Ga naar bestand - > batchbestand opslaan als - > opslaan).
    2. Maken het systeem injecteren in het eerste voorbeeld door te drukken op ' beginnen Batch '. Dit zal resulteren in de injectie van 10 μL monster door de autosampler met een oplosmiddel levering module.
      Opmerking: Gebruik een debiet van de pomp van 0,15 mL/min en een C18-kolom met omkering fase. Hier werd een amperometrische detector voor elektrochemische detectie gebruikt. De glazige koolstof-elektrode moet worden ingesteld op 0,8 V met een Ag/AgCl-elektrode. Om de gehaltebepaling van dopamine, gebruik van chromatografie 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, deeltje grootte 3 µm) om de gaschromatografische scheiding.
    3. Extract de gemeten en berekende piek gebieden.
      1. Ga naar de data-acquisitie te volgen van het chromatogram, wanneer de monsters hebt. Ga naar Lc na het uitvoeren van analyse - > koos voor de naam van het bestand (het chromatogram zal openen) - > Klik op view. Voeg op de handmatige integratie bar, alle de toppen worden geïntegreerd - > Ga naar gegevensrapport en het lezen uitprinten.
        Opmerking: Hier de software van de LC-oplossing werd gebruikt voor de analyse en de systeem-gegevensbesturing.
  4. Uit de gebieden van de piek, de concentratie van dopamine in een monster als volgt berekenen met behulp van de bekende concentratie van de standaard:
    1. gebruiken de piekoppervlakte van de standaard (is gelijk aan 1 pmol) voor het verkrijgen van factor A.
      figure-protocol-1
    2. gebruik van factor A om de concentratie van de monsters.
      Concentratie van monster (in pmol per 10 μL) = piekoppervlakte van Factor A × van het monster
    3. gebruik van deze formule om de concentratie van het monster in ng.
      Monster concentratie pmol / 10 µL x 500 µL x MW van dopamine = voorbeeld concentratie in ng
      monster van de concentratie (in ng) = concentratie van het monster (in pmol per 10 μL) x 500 μL x MW van dopamine
    4. gebruik van de concentratie van het monster in ng om t Hij proeven concentratie in pg/g weefsel (voorbeeld concentratie in pg / weefsel g = pg/g weefsel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Huidige DA opname protocol (Figuur 1) omvat alle noodzakelijke stappen voor het beoordelen van de functionaliteit van DAT in synaptosomes van muizen. Onze representatieve gegevens van de DA opname methode (Figuur 2) toont een verzadiging kromme met niet-gecorrigeerde gegevens (figuur 2B) en gezuiverde gegevens (figuur 2A). De verzadiging curve toont opname van wild type ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript beschrijft nuttige experimentele protocollen te bakenen DA homeostase in een muismodel van keuze. We bieden gedetailleerde protocollen voor meten niveaus van DA in hersenweefsel van muizen met behulp van HPLC en synaptosomal DA opname te beoordelen van functionele DA vervoer door middel van DAT. De procedures, de protocollen en de grenzen voor de HPLC-experiment en synaptosomal DA opname bepaling zal hieronder worden uitgewerkt.

Het protocol synaptosomal opname kan nuttig inzich...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de UCPH 2016 programma van Excellence (U.G., A.R., K.J.), de Stichting van Lundbeck (M.R.) de Lundbeck Stichting Centrum voor biomembranen in nanogeneeskunde (U.G.), het Nationaal Instituut van gezondheid subsidies P01 DA 12408 (U.G.), de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek - medische wetenschappen (U.G.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
COMT-remmerSigma Aldrich, DuitslandRO-41-0960Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, VSNET67-3001MCVoor synaptosomale DA-opnameprotocol
Glas microvezel filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
HiSafe ScintillatievloeistofPerkin Elmer1200-437Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
MicroBeta2Perkin ElmerVoor synaptosomale DA-opnameprotocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
HEPESSigma Life ScienceH3375Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
SucroseSigma Life ScienceS7903Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
NaClSigma Life ScienceS3014Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
KClSigma Life ScienceP9541Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
MgSO4Sigma Life Science63065Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
PargylineSigma AldrichP-8013Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
DesipramineSigma AldrichD3900Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
DopamineSigma Life ScienceH8502Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
CocaineSigma Life ScienceC5776Voor synaptosomale DA-opnameprotocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CVoor synaptosomale DA-opnameprotocol
Cafano mechanische teflon verstuiverBuch & HolmDiscontinuedVoor synaptosomale DA-opnameprotocol (homogenisatie)
Antec Decade (Amperometrisch detector)Antec, Leiden, NederlandDiscontinued: nieuw model DECADE Elite / Lite™ Elektrochemische Detector type 175 en 176Voor HPLC-protocol
Avantec 0,22 µm glazen filterFrisenette ApS, Denemarken13CP020ASVoor HPLC-protocol
Kolom: Prodigy 3 µ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, DuitslandArtikelnummer: 00A-3300-E0Voor HPLC-protocol
LC-oplossing softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationVoor HPLC-protocol
Perchlorzuur 0,1MFluka Analytical35418-500mlVoor HPLC-protocol (weefselvoorbereiding)
EDTASigmaE5134-50gVoor HPLC-protocol
NatriumdiwaterstoffosfaatBie&Berntsen1.06346 1000gVoor HPLC-protocol
Natrium 1-octaansulfonaat monohydraatAldrich74885 -10gVoor HPLC-protocol
Acetonitril, isocratisch HPLC-kwaliteitScharlauAC03402500Voor HPLC-protocol
Filtre 0,22umFrisenette ApS, DenemarkenAvantec 13CP020ASVoor HPLC-protocol (weefselvoorbereiding)
ortho-Fosforzuur 85%Merck1.00563. 1000mlVoor HPLC-protocol
ElektrodeAntec, Leiden, NederlandAN1161300Voor HPLC-protocol (zie handleiding online)
Detectorprogramma op DECADE II elektrochemische detectorAntec, Leiden, NederlandLite™ Elektrochemische Detector type 175 en 176Voor HPLC-protocol

Referenties

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580(2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468(2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Dopaminehomeostasedopaminetransporterdopaminegehaltesstriataal weefseldopamine opnameassayanalyse van hersenweefseldopaminetransporterfunctiedopaminetransporterkinetiek
Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.