Methodenartikel

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

DOI:

10.3791/56094

⸱

13 juli 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen zijn bedekt met een mantel koolhydratenketens (glycanen) die gewoonlijk veranderd zijn in kanker en die variaties in siaalzuur (Sia) expressie omvatten. Dit zijn zure suikers die een 9-carbon ruggengraat hebben en die vertebraten glycanen op de celoppervlakken dichten. Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn N- acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en zijn gehydroxyleerde vorm, N- glycolylneuraminezuur (Neu5Gc). Mensen kunnen geen endogene Neu5Gc produceren door de inactivatie van het gen dat codeert voor cytidine 5'monofosfaat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Buitenlandse Neu5Gc wordt verkregen door menselijke cellen door het dieetverbruik van rood vlees en zuivel en verschijnt vervolgens op diverse glycanen op het celoppervlak, die hoofdzakelijk op carcinomen accumuleren. Derhalve hebben mensen circulerende anti-Neu5Gc antilichamen die verschillende rollen spelen in kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde aandoeningen en die potentieel diagnostisch en therapeutisch worden.rgets. Hier beschrijven we een high-throughput sialoglycan microarray test om dergelijke anti-Neu5Gc antilichamen in de menselijke sera te beoordelen. Neu5Gc-bevattende glycanen en hun bijpassende paren controles (Neu5Ac-bevattende glycanen), elk met een kern primaire amine, zijn covalent gekoppeld aan epoxy-beklede glazen glijbanen. We illustreren het afdrukken van 56 glijbanen in een 16-bronsformaat met behulp van een specifieke nano-printer die maximaal 896 array's per print kan genereren. Elke dia kan worden gebruikt om 16 verschillende humane sera monsters te screenen voor de evaluatie van anti-Neu5Gc antilichaam specificiteit, intensiteit en diversiteit. Het protocol beschrijft de complexiteit van dit robuuste gereedschap en biedt een basis richtlijn voor degenen die het antwoord op Neu5Gc dieet koolhydraatantigen in diverse klinische monsters in een matrixformaat willen onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen 1 en correleert met progressie en / of metastase 2 , 3 . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc 2 . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als 'zelf', afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsmiddelen ( bijv. Rood vlees) 4 , 5 . Neu5Gc is aanwezig op lage niveaus op de celoppervlakken van menselijke epithelia en endothelia, maar komt vooral bij carcinomen op. Neu5Gc wordt herkend als vreemd door het humane humoral immune system 2 , 6 .De antigeencomplexiteit van Neu5Gc-glycanen kan zich op meerdere niveaus voordoen, inclusief Neu5Gc-modificatie, koppeling, onderliggende glycanen en steigers, en hun dichtheid, die allemaal weerspiegeld worden door de complexiteit van anti-Neu5Gc antilichaamrespons bij mensen 6 . Sommige van deze antilichamen dienen als carcinombiomarkers en potentiële immunotherapeutica 7 . De komst van de chemo-zymatische synthese van verschillende sialoglycanen 8 heeft de weg geboden voor de diepgaande analyse van dergelijke antilichamen, gefaciliteerd door het gebruik van glycan microarray technologie 9 , 10 . Dus, met de gefaciliteerde voorbereiding en manipulatie van grote bibliotheken van natuurlijke en synthetische koolhydraten, zijn glycan microarrays een krachtige high-throughput technologie geworden voor het onderzoeken van de interacties van koolhydraten met een groot aantal biomoleculen 10 , 11 , 12 , 13 . In een matrixformaat worden minimale hoeveelheden materialen gebruikt, en dit multivalente display van biologisch relevante glycanen zorgt voor het onderzoek naar duizenden bindende interacties in een enkel experiment. Belangrijk is dat deze technologie ook kan worden toegepast op biomarker ontdekking en het controleren van immuunresponsen in diverse monsters 7 , 12 .

Succesvolle glycan microarray fabricage vereist het overwegen van drie belangrijke aspecten: het type printer robot, glycan conjugation chemistry en detectie optica. Met betrekking tot het afdrukinstrument zijn twee technieken beschikbaar: contact- en niet-contactprinters. In contactdruk worden 1-48 stalen pennen gedompeld in een multi-well bronplaat die glycanoplossing bevat en worden gespot op gefunctionaliseerde glijbanen door direct contact op te nemen met het glazen glijvlak. De oplossing bedraagt ​​deLevering aan de dia is een functie van de langdurige duur op het dia oppervlak. Meestal worden de monsters eerst voorgespoten op een glasblok (om homogene plekken te bereiken) voordat ze op het dia-oppervlak worden gedrukt. Bij niet-contactprinters ( bijv. De piezo-elektronische printer) worden de glycanen gedrukt vanuit een glazen capillaire met behulp van gecontroleerde elektrische signalen. Het elektrische signaal kan fijn gekalibreerd worden om nauwkeuriger afdrukken te verkrijgen ten opzichte van het afdrukken van contacten. De grootte en morfologie van de vlekken zijn ook relatief meer homogeen. Een extra voordeel is het recyclen van het monster terug naar de bronplaat na het afdrukken. Niettemin is het grote nadeel van piëzo-elektronische printers de drukknopbeperking (4 of 8), wat resulteert in een zeer lange drukduur, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan de stabiliteit, de temperatuur, de vochtigheid en de verdamping van het monster. De non-contact inkjetprinter vereist grotere voorbeeldvolumes 14 .

In tegenstelling tot de beperkte beschikbare opties voor drukwerkmethoden, is de glycan conjugation chemistry een complexere overweging, met veel mogelijkheden om uit te kiezen. Geselecteerde immobilisatiechemie moet rekening houden met zowel de actieve groepen op de glycanen als de reactiviteit van de glijoppervlak. De glycanen die geïmmobiliseerd moeten worden op een specifiek microarray oppervlak, ofwel synthetisch gesynthetiseerd of natuurlijk geïsoleerd, hebben allemaal een identieke reactieve groep nodig. Bovendien moeten de glycanen zuiver en homogeen zijn. Aan de andere kant moet het immobilisatieoppervlak en de chemie reproduceerbaarheid en betrouwbare bevestigingsdichtheid verschaffen. Meerdere immobilisatiemethoden zijn ontwikkeld met ofwel covalente of niet-covalente (fysieke absorptie) bijlage 10 , 11 , 12 , 13 . Voor zeer gedetailleerde informatie over gedrukte glycan microarray technologie voor de oninitiateD-onderzoeker, verwijzen naar deze uitstekende beoordelingen 13 , 15 . Belangrijk is dat de recente Minimale Informatie Verplicht voor een Glycomics Experiment (MIRAGE) initiatief omschrijft richtlijnen voor steekproefbereiding 16 en voor het rapporteren van gegevens uit glycan microarray analyses 17 om de normen in dit groeiende veld te verbeteren.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de fabricage van sialoglycan microarrays met behulp van een specifieke contact nano-printer in een 16-vel formaat. Elk van de glycanen heeft een primaire amine die hun covalente verbinding met epoxy geactiveerde glazen glijbanen bemiddelt. We beschrijven ook de ontwikkeling en analyse van een dia met behulp van diverse menselijke sera-monsters, antilichamen en Sia-bindende plantentectines. Sialoglycan microarray analyses betreffen meerdere belangrijke stappen die matrix fabricage, verwerking, ontwikkeling en analyse omvatten. Array fabricage vereist de planning van de arRay-lay-out, bereiding van de glycanen en bronplaat, het programmeren van de nano-printer en het afdrukken van de dia's. Vervolgens worden de dia's verwerkt, ontwikkeld en geanalyseerd ( Figuur 1 ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human Sera-monsters werden verkregen uit de Israëlische Bloedbank en werden gebruikt in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en Tel Aviv University Institutional Review Board.

1. Array Fabrication Planning en Layout

  1. Bepaal de dia-indeling.
    OPMERKING: Elke dia bevat 16 sub-arrays verdeeld in 16 identieke blokken genummerd B1 tot B16 ( Figuur 1B , Aanvullend Figuur 1A ).
  2. Bepaal de pin lay-out. Gebruik vier pinnen, elk afdrukken van vier sub-arrays (blokken) per dia:
    Pin 1 afdrukken Blokken 1, 2, 9 en 10;
    Pin 2 afdrukken Blokken 3, 4, 11 en 12;
    Pin 3 afdrukken Blokken 5, 6, 13 en 14; en
    Pin 4 afdrukken Blokken 7, 8, 15 en 16 ( Aanvullend Figuur 1A ).
  3. Bepaal het blok en de 384-put plaatopmaak.
    OPMERKING: De volgorde waarin de glycanen in elk blok verschijnen, vereist een zorgvuldige planning. In dit voorbeeld arrAy, druk elke steekproef op vier replicaten, ontwerpt fluorescerende markeringsvlekjes in de rechterbenedenhoek (ter plaatseanalyse te vergemakkelijken) en drukvlekpunten op standaardcurve IgG (STD) afdrukken op zes toenemende concentraties ( aanvullend figuur 1B ).
    1. Voor elke afgedrukte plaats, verdeel eerst het materiaal in vier putten (één voor elke pen) in een 384-putje plaat.
      OPMERKING: De volgorde van de materialen in de 384-putplaat is gebaseerd op de ontwerpblokopmaak ( aanvullend figuur 1B-C ).

2. Bereiding van glycanen en de bronplaat

  1. Bereid glycandrukbuffer op (50 ml 300 mM fosfaatbuffer, pH 8,4). Weeg 58,5 mg mononatriumfosfaat monohydraat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) en 3,9 g dinatriumfosfaat heptahydraat (Na2 HPO 4 .7H 2 O) in 40 ml gedeïoniseerd water (DIW). Titreer naar pH 8,4 onder gebruikmaking van 4 M NaOH. Stel het volume in op 50 ml anD filter door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
  2. Bereid de markerbuffer op (50 ml 187 mM fosfaatbuffer, pH 5). Weeg 289 mg mononatriumfosfaat monohydraat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) en 1,94 g dinatriumfosfaat heptahydraat (Na2 HPO 4 .7H 2 O) in 40 ml DIW. Titreer naar pH 5 met 1 M HC1. Stel het volume in op 50 ml en filter door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
  3. Bereid STD-curvebuffer (50 ml PBS-glycerol: fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,4, aangevuld met 10% glycerol uit een 100% glycerolvoorraad) en filter deze door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
  4. Bereid elke glycan voorraadoplossing bij 10 mM in DIW op. Controleer de sialyleerde glycaneconcentraties door middel van fluorescentiedetectie bij hogedruk-vloeistofchromatografische analyse 18 .
  5. Verdun elke glycan naar 100 μM in een totaal volume van 100 μl glycandrukbufferIn microcentrifugebuizen.
  6. Bereid de primaire amine bevattende fluorescerende kleurstof op. Solubiliseer Alexa 555-hydrazide op 1 mg / ml met markeringsbuffer en verdun vervolgens tot 1 μg / ml in een totaal volume van 1 ml.
    OPMERKING: Elke andere primaire aminehoudende kleurstof kan volgens de dia-scanner worden gebruikt met een geschikte golflengte.
    OPMERKING: Markerpunten vergemakkelijken het roosteruitlijning in elk blok tijdens analyse.
  7. Bereiding menselijke IgG STD-curveverdunningen: Bereid 0,5 ml van een voorraadoplossing van menselijk IgG op 160 ng / μl in STD-curvebuffer. Verdun de voorraad 1: 1 zesmaal serieel om 80, 40, 20, 10, 5 en 2,5 ng / μl te verkrijgen, alles in de STD-curvebuffer bij een totaal volume van 200 μl elk.
    OPMERKING: Andere Ig-isotypes kunnen worden gebruikt indien geschikt voor het experiment ( bijvoorbeeld menselijk IgA, IgM, IgE, of een Ig van een ander organisme).
  8. Plaats de 384-putjesplaat op ijs. Met behulp van een elektronische multi-pipette, aliquot 7 μL van elke glycan-, marker- en STD-curve IgG-vier replicerenS van elk - volgens de plaatuitleg ( aanvullend figuur 1C ). Voor betere nauwkeurigheid, bel 35 μl van elk monster en aliquot 7 μl in elk van de vier putten van het monster. Plaats de overige 7 μL van elke glycan in hun originele buis.
  9. Bedek de plaat met parafilm en draai deze gedurende 2 minuten bij 250g en 12 ° C. Plaats de plaat bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht. Ontdek de plaat niet voordat de vochtigheid in de kamer 60-70% bereikt.

3. De Nano-printer programmeren

  1. Open de software "Microarray Manager". Gebruik het venster 'Methode eigenschappen'.
  2. Stel de werktafellay-out op: kies de '56-diaconfiguratie'.
    OPMERKING: dit is een vooraf gedefinieerde configuratie die het mogelijk maakt om 56 afbeeldingen te printen. Kalibreer voor elk type plaat-, pen- en afdrukformaat ( Aanvullend Figuur 2 , stap 1).
  3. Selecteer "Pin configuratie"| "Pin Tool 1x4 9 mm."
    OPMERKING: dit is een vooraf gedefinieerde configuratie voor het gebruik van vier pennen ( aanvullend figuur 2 , stap 2).
  4. Definieer het 'Pin type'. Bereken en maak het pin type dat geschikt is voor het afdrukken.
    OPMERKING: Deze stap bepaalt hoeveel plaatsen een pin zou afdrukken voordat het opnieuw in de steekproef 384-put wordt gedypen en moet worden geoptimaliseerd voor de verschillende pin typen en schuifoppervlakkenchemie.
    OPMERKING: Bij het gebruik van 946MP3-pennen, beschouw twee belangrijke problemen: 1) elke pin kan tot 140 homogene plekken printen en 2) voorspotting is essentieel om overmatige vloeistof uit de punt van de pen te verwijderen voordat u op de dia's afdrukt. Daarom programmeert u elke pin om 20 voorvlekken af ​​te drukken op een voordrukblok (geoptimaliseerd voor 946MP3-pennen op epoxycoated slides).
    1. Bereken het totale aantal afgedrukte plekken per monster.
      OPMERKING: hier printt elke pin 4 plekken per sub-array (blok); Totaal 4 sub-arrays per dia's = 16 spots / slide. Na 7 glijbanen printt elke pin 16 x 7 = 112 spots. Daarnaast geven 20 voorvlekken voor het afdrukken 132 plaatsen / dip. Daarom wordt het pin type gedefinieerd als "946MP3-132 spots" (4 plekken per monster per blok x 4 blokken x 7 glijbanen + 20 voorvlekken = 132).
    2. Maak het "Pin type" ( Aanvullend Figuur 2 , stap 3). Druk op "Setup" (linker paneel van de software) | "Micro Spotting Pins" | "Nieuwe naam" (946MP3-132 spots). Bepaal het aantal vlekken per dip (132), de plaatsdiameter (100 μm), de opname (0,25 μL), de levering (0,7 nL) en de minimale plekafstand (100 μm). Druk op "OK" | "OK."
    3. Selecteer in het venster 'Methodeeigenschappen' het aangemaakte pin type: '946MP3-132 spots'.
  5. Definieer de wasomstandigheden. Zet de "Was voor het starten" en "Was na afwerking" op "Normaal wassen" ( Aanvullend Figuur 2 , stap 4).
  6. Definieer de "Plate lijst."
    OPMERKING: Dit is het steekproefpatroon van de plaat (de volgorde van dips van de 384-putplaat) volgens de plaatuitleg. Om de plaat in de plaatlijst te uploaden, plaatst u een plaatsteekproefpatroon.
    1. Maak de plaat "Steekproefpatroon." Ga naar "Sjablonen" ( Aanvullend Figuur 3 ) | "Steekproefpatronen." Geef een nieuwe naam ( bv. JoVE array) en selecteer "Insert" | "Vul bovenaan" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Selecteer de volgorde van de pick-ups volgens de vooraf gedefinieerde plaatuitleg ( Aanvullend Figuur 1A ). Druk op "OK" | "OK."
    2. Laad het plaatsteekproefpatroon. Klik op de rechterkant van de cel 'Plate list' ( Aanvullende afbeelding 3 ) | "Voeg plaat toe" en selecteer het juiste plaatsteekproefpatroon (de "JoVE array", beschreven in stap 3.6.1.). Selecteer "Normal Wash". pers"OK" | "OK."
  7. Ga naar de "Sample Plates" en verander de positie offset naar 1 (die bepaalt waar de plaat zich bevindt op het array-deck).
    OPMERKING: De offsetpositie van 0 ligt dichter bij het sonicatorbad.
  8. Definieer het 'Microarray Print Design'. Bereken de afstanden tussen de blokkeuze en de afstanden.
    1. Overweeg de afmetingen van het ontwikkelingsgereedschap dat de glijbaan verdeelt in 16 putjes van 7 x 7 mm, met 2 mm ruimtes tussen subrails (totaal 9 mm tussen blokken; aanvullend figuur 4 ).
    2. Beschouw de dimensies van de sub-array.
      OPMERKING: De afstand tussen plaatsen is 0,275 mm en er zijn 12 kolommen en 18 rijen in dit printontwerp; De totale afmetingen zijn: breedte (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) en hoogte (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Bereken de horizontale afstand: 9 mm - (11 0.275) = 5.97 mm. Bereken de verticale afstand: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. Bereken dVan de linkerzijde van de glijbaan: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Bereken de afstand van de bovenzijde van de glijbaan: 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( Aanvullend Figuur 4 ).
    3. Definieer de "Print Designs" ( Aanvullend Figuur 5 ). Selecteer 'Sjablonen' | "Print Designs" | "Nieuwe."
      1. Selecteer "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 spots." Verander in het tabblad 'Algemeen' de 'Naam van Microarray Print' ( dwz 'JoVE array'). Selecteer 'Spot Speed' | "Replicate Number" (4) | "Touch Point Height" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) | "Afdrukken naar alle beschikbare posities" ( Aanvullend Figuur 5A ).
      2. Kies in het tabblad 'Microarray' de horizontale en verticale afstand (5,9 mm en 4,325 mm van stap 3.8.2) en het aantal horizontale en verticale microarrays (2). Selecteer 'Afdrukken'Microarray Horizontaal "|" Print Duplicate Microarray "( Aanvullend Figuur 5B ).
      3. Kies in het tabblad sub-array het maximum aantal kolommen (12), het maximale aantal rijen (18) en de afstand tussen de kolommen en rijen (275 μm) ( aanvullend figuur 5C ).
      4. Kies in de afmetingen tab de afstand van de linkerzijde van de dia (5.5 mm), de afstand vanaf de bovenkant van de dia (3,5 mm, berekend in stap 3.8.2), de breedte van de diafragma (25 mm) , En de hoogte van de afdrukglijbaan (75 mm) ( aanvullend figuur 5D ). Druk op "OK" | "OK."
  9. Klik op de rechterkant van de cel "Microarray Print Designs" en selecteer het gedefinieerde ontwerp (de "JoVE array" van stap 3.8.3; Aanvullend Figuur 6 ).
  10. Definieer de "Slide Count" (56) en verander de "Position Offset" (0). Dit bepaalt de poSitie van de eerste dia die op het arrayerdeck wordt gedrukt ( aanvullend figuur 6 ).
  11. Definieer het "Microarray Pre-Print Design" ( Aanvullend Figuur 6 ). Selecteer "Glasblok" | "Pre-Print 1 x 4 mm pin tool."
    OPMERKING: Met deze spatieafstand kan 46.464 voorvlekken (voor alle 4 spelden) op het glasblok, dus 46.464 / 4 = 11.616 voorvlekken per pen. Als de ruimte op het pre-printblok was opgebruikt, zal de printer stoppen en het blok moet omgeslagen worden.
    OPMERKING: Om te berekenen na hoeveel monsters het voordrukblok vol is, overwegen het volgende: elk monster wordt genomen met 8 pin-dips in de 384-putplaat om 56 dia's te maken (7 dia's per dip) en elke dip Heeft nog eens 20 pre-spots, waardoor in totaal 160 voorvlekken per monster worden verkregen. Daarom 11.616 / 160 = 72.6 monsters. Zo zou het voordrukglasblok moeten worden omgeslagen na 72 monsters (om de tijd voor het flipperen te evalueren, h te metenOw lang duurt het voor een monster om een ​​volledige run te voltooien op 56 glijbanen en vermenigvuldigen dan met 72).
  12. Selecteer "PrePrint Design gebruiken" | "Ja" | "Scannen Barcodes" (Nee) | "Afdrukken enkelvoudig repliceren" (nee) ( aanvullend figuur 6 ).
  13. Klik op 'Valideren' ( aanvullend figuur 6 ).
  14. Klik op "Opslaan" en sla de methode op als een arr-bestand ( bijv. "JoVE array.arr," Aanvullende afbeelding 6 ).

4. Afdrukken van ontworpen arrays

OPMERKING: Alle stappen moeten uitgevoerd worden in een schone kamer met vochtigheid van 60-70% en met geschikte handschoenen en kleding ter bescherming

  1. Zet de nano-printermachine en luchtbevochtiger aan.
  2. Voor de wasbuffer en bevochtiging, vul met DI water. Leeg de wasbottel (afvoer) en bevochtigingsvanger-carboy ( Aanvullend Figuur 7A ).
  3. Zet de luchtbevochtiger op70% vochtigheid en start bevochtiging.
  4. Maak alle pennen voor het afdrukken schoon. Bereid 50 ml hete (65 ° C) speldreinigingsoplossing (15 g speldreinigingsreagens en 50 ml 65 ° C water, vermengd grondig tot het vaste reagens volledig is opgelost).
    1. Breng de schoonmaakoplossing aan elke speldop door de speldrubbel (fijn) in de spuitoplossingsoplossing te dompelen en het oppervlak van elke speldop te poetsen.
      OPMERKING: Pin-tip reinigingsoplossing is corrosief en giftig. Zorg ervoor dat u altijd handschoenen en veiligheidsbril draagt ​​bij het gebruik van deze oplossing. Het doordringen van speldjes in de speldreinigingsoplossing gedurende meer dan een paar minuten kan leiden tot permanente spierschade.
    2. Vul het ultrasone bad met 1 liter gedistilleerd water en plaats de pennen in een vlotterschoonmaakrek in het bad. Soniceer gedurende 5 minuten en verwijder de pennen. Laat droog en zachtjes met speciale doekjes schoonmaken.
  5. Open de "Microarray Manager" -afdrukEr software; Bij aansluitingsset gaat het printerlicht aan (rood / groen). Druk op 'Stop' | "Clear" | "Init" ( Aanvullend Figuur 7B , stappen 1-3); De printkop arm zal dan de X, Y, Z-uitlijningen opnieuw instellen.
  6. Om de pennen in de printkop te laden, druk op "Load" ( Aanvullend Figuur 7B , stap 4) en plaats de pennen in de printkop volgens de gedefinieerde configuratie van de print / pin tool layout ( Aanvullend Figuur 7C ); Deze lay-out maakt gebruik van 4 pennen, elke afdruk van 4 sub-arrays op elke dia om in totaal 16 sub-arrays per dia te krijgen ( aanvullend figuur 1A ). Nadat u de pennen hebt geplaatst, drukt u nogmaals op "Init".
  7. Monteer de dia's op het array-dek. Open de glijbaan en reinig elke glijbaan door ultra-hoge zuiverheid stikstofgas te blazen. Plaats het gewenste aantal glijbanen op het platform. Houd de glijbanen met twee vingers in de onderste hoeken vast en plaats de glijbaan erinpositie. Houd de twee rechter hoeken vast en druk de linker hoeken zachtjes tot de dia stevig in zijn positie past. Duw voorzichtig naar de linkerhoek om een ​​strakke pasvorm te garanderen ( aanvullend figuur 7D ).
  8. Maak het pre-blockglas schoon met gedestilleerd water, 70% ethanol en 100% ethanol en laat het drogen met lucht (gebruik alleen speciale doekjes). Plaats het voorblokglas op zijn plaats op het dek.
  9. Vul een sonicatorbad ( aanvullend figuur 7B ). Druk op "Vul" gedurende 55 s en druk op "OK". Dreineer de sonicator door 20 seconden op "Drain" te drukken en druk dan op "OK". Herhaal de vulling en afvoer nog een keer en vul dan nog eens 55 seconden in.
  10. Vul het wasbad ( Aanvullend Figuur 7B ): druk op "Prime" gedurende 40 seconden en druk dan op "OK".
  11. Plaats de 384-putjesplaat met gelijke monsters in de plaats op het array-dek en verwijder de parafilmafdekking.
  12. Start afdrukken.
  13. Wanneer het afdrukken is voltooid, moet u het sonicatorbad afvoeren ( aanvullend figuur 7B ) en de luchtbevochtiger uitzetten.
  14. Laat de glijbanen gedurende 16-24 uur zonder bevochtiging op het array-dek drogen.
  15. Nummer de dia's met een alcohol- / oplosmiddelbestendige merkpen en sla ze in een stofdichte doos in het donker.

5. Verwerking en ontwikkeling van de arrays

  1. Breng een glijbaan uit de vacuüm-verzegelde doos en plaats deze 5 minuten in een chemische afzuigkap, de array naar boven om de overmaat vloeistof te verdampen.
  2. Scan de dia bij de hoogste winst (950 PMT) om ervoor te zorgen dat alle vlekken zijn afgedrukt.
  3. Ga door met de chemische blokkering van epoxygroepen op de glijbaan
    1. Bereid 50 ml ethanolamine blokkerende oplossing (0,1 M Tris-HCl, pH 8 en 0,05 M ethanolamine). Meng 140 ml DIW met 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) en 0,45 ml ethanolamine (16,6 M). Overboeken naar een 50-mL kleurbuis ( Aanvullend Figuur 8A ) en warm tot 50 ° C.
    2. Hydreer de dia. Plaats de glijbaan in een vlekbuis gevuld met DIW, bedek het met folie en incubeer gedurende 5 minuten met langzame en zachte schudden bij RT.
    3. Blok de reactieve epoxygroepen op de glijbaan. Dip de glijbaan in de 50 ml kleurslang gevuld met voorverwarmde ethanolamine blokkerende oplossing, deksel met folie, en incubeer gedurende 30 minuten met langzaam en zacht schudden bij RT.
    4. Gooi de ethanolamine-blokkeringsoplossing in de juiste houder van de biobrandstofafval en plaats de glijbaan in een nieuwe, schone vlekbuis die is gevuld met 50 ° C DIW. Bedek met folie en incubeer gedurende 10 minuten met langzame en zachte schudden bij RT.
    5. Gooi het water weg en breng de glijbanen over op een glasvlekhouder ( Aanvullend Figuur 8B ). Plaats de glasvlekhouder in een schommelhouder en centrifugeer de dia gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT.
  4. Stel een divider op en ga verder met het biologische blokkeren.
    1. Plaats de glijbaan op een 16-verdeler ( aanvullend figuur 8C ).
    2. Bereid PBST-wasoplossing op: 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
    3. Bereid biologische blokkerende oplossing (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% kip-ovalbumine (10 mg / ml).
      OPMERKING: De keuze van het blokkerende reagens is cruciaal voor het succes van de detectie van anti-Neu5Gc antilichamen. Ovaalbumine is gemaakt in kippen die, zoals de mens, Neu5Gc niet kunnen synthetiseren, waardoor deze Sia ontbreekt. Voor de detectie van Neu5Gc kunnen zelfs kleine verontreinigingen de gevoeligheid van de test dramatisch verminderen, soms zelfs geen anti-Neu5Gc reactiviteit detecteren. Bijvoorbeeld, het meest gebruikte blokkerende reagens, boviene serumalbumine (BSA), hoewel niet zelf ge glycosyleerd, bevat boviene IgG-verontreinigingen die Neu5Gc-delen dragen en daarom competitie wMet gedrukte glycanen wanneer ze bindend zijn tegen anti-Neu5Gc antilichamen 19 , 20 .
    4. Prewell de putjes. Gebruik een multipipette, alikot 200 μL PBST in de glijbronnen, plaats ze in een overdekte vochtige kamer en schud 5 minuten.
      OPMERKING: De vochtigheidskamer is een glazen lade met een nat handdoekpapier, bedekt met nylonfolie en folie om de monsters tegen licht te beschermen.
    5. Verwijder de PBST door te flikkeren en tachtjes op een schone handdoek te tikken en 200 μL PBS-OVA-blokkeringsbuffer in elke put op te nemen. Plaats in een vochtige kamer en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
  5. Bereid de primaire detectie verdund in PBS-OVA-blokkeringsbuffer op, zoals vermeld in tabel 2 .
    OPMERKING: Voor de kwaliteitscontrole (QC) beoordeling van deze sialoglycan microarray, gebruik verschillende Sia bindende eiwitten: Sambucus nigra lectine (SNA), geïsoleerd uit elderberry bark, wordt verwacht dat Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) zal naar verwachting Siaa23 herkennen; En kip anti-Neu5Gc IgY wordt verwacht, herken alle Neu5Gc-bevattende sialoglycanen. Gebruik bovendien diverse menselijke sera-monsters om profiel anti-Neu5Gc IgG-respons te profileren. De concentratie van lectines / antilichamen / sera moet experimenteel worden gekalibreerd.
  6. Flip droge PBS-OVA blokkeringsbuffer en voeg 200 μL primair antilichaam per putje toe (minimaal volume per putje: 70 μL), incubeer in een vochtige kamer gedurende 2 uur.
  7. Flick droog de primaire detectie en was 4 keer met PBST (tussen de 3de en 4de wassen, incubeer de slede in PBST gedurende 5 min in vochtige kamer). Was eens met PBS.
  8. Bereid het secundaire antilichaam in PBS, zoals vermeld in Tabel 2 .
  9. Flick droog de PBS en voeg 200 μL secundair antilichaam toe. Incubeer gedurende 1 uur bij RT met schudden.
  10. Flick droog het secundaire antilichaam en was vier keer met PBST (tussen de 3Rd en 4 de was, incubeer de dia in PBST gedurende 5 min in de vochtige kamer).
  11. Verwijder het frame voorzichtig en plaats de glijbanen in een 50 ml glijbuis die met PBS wordt gevuld en schud 5 minuten.
  12. Vul twee glijbaden ( aanvullend figuur 8D ) met DIW, plaats de glijbaan in de glijhouder en doei het in het bad. Dompel 10 keer snel en verplaats vervolgens naar het tweede bad en doei 10 keer meer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij schudden.
  13. Verwijder het water en breng de glijbaan naar een glazen vlekhouder ( Aanvullende afbeelding 8B , laat de dia luchtdrogen). Plaats de glasvlekhouder in een schommelhouder en centrifugeer de dia gedurende 5 minuten bij 200 g en RT.
  14. Scan de dia en geef het dan in een stofdichte doos in het donker.

6. Array Scanning en Data Analysis

  1. Open de fluorescerende dia-scanner en laat het gedurende 5 minuten verwarmen. Open deScannen en analyseren van software.
  2. Stel de scanparameters in ( aanvullende afbeelding 9A ): scan op 532 nm en 100% power met een winst van 350 PMT, met een lijn tot gemiddeld en een 0 μm focuspositie. Gebruik een resolutie van 10,0 μm pixelformaat.
    OPMERKING: Scanparameters kunnen worden aangepast aan verschillende dia types, fluorescentie en resolutie.
  3. Scan de ontwikkelde dia. Open de scannerdeur en plaats de dia binnen, array naar beneden gericht. Start scannen (groene "Play" knop in het menu van het navigatiepaneel van het softwarepaneel, aanvullend figuur 9B ).
  4. Sla de gescande dia's op als een tiff-bestand.
  5. Bereid glijbaan voor analyse. Selecteer 'Load array list' en upload het juiste GAL-bestand dat de arrays in elk blok op de dia plaatst ( aanvullend figuur 9C ).
    OPMERKING: Het GAL-bestand bevat informatie over zowel de identiteit en de locatie (X, Y) van elke plaats op de dia. Dit bestand kan worden aangemaaktDoor de printersoftware een tab-afgestemd tekstbestand exporteren op basis van monstersidentiteiten in de 384-bronplaat en het gedefinieerde printontwerp.
  6. Stel de uitlijning en analyse parameters in. Druk op de knop "Optie" in het menu van het navigatiepaneel van de software ( Aanvullende afbeelding 10 ).
  7. Definieer de uitlijnparameters. Zoek circulaire functies, resize functies tijdens de uitlijning met 50 - 350%, beperk de functie beweging tot een maximale vertaling van 40 μm, unflag functies die falen achtergronddrempel (CPI drempel 0), schat de wrapping en rotatie bij het vinden van blokken en automatiseer beeldregistratie (10 pixels) ( aanvullend figuur 10 ).
  8. Definieer de analyseparameters: W1 / 532 ratio, normale standaardafwijking, ontbrekende eigenschappen analyseren en achtergrond aftrekken. Klik op "selecteer" en dan "Local media background median" en stel 2 pixels uit om te sluiten en een 3-pixel breedte achtergrond. Druk op OK." SeT het verzadigingsniveau van de scanner naar de standaard ( aanvullend figuur 10 ).
    OPMERKING: De achtergrondaftrekkingsmethode is afhankelijk van het experimentele ontwerp en kan volgens specifieke behoeften worden aangepast.
  9. Breng de eigenschappen van de kaarten af. Zet het programma in de blokmodus (druk op "B"), selecteer alle blokken (Ctrl + A), plaats de matrixkaarten en stel alle blokken (Alt + Shift + F7) in ( Aanvullende afbeelding 11 ).
  10. Verfijn de functie-uitlijning in elk blok. Zoom (druk op "Z" om in de zoommodus te komen) in het linkerbovenste blok, druk nogmaals op "B" (blokstand) en druk op het raster van dit blok. Verplaats alleen het rooster van dit blok totdat het perfect uitkomt met de blokkeuzes en druk op F5 om de functies in dit geselecteerde blok uit te lijnen. Herhaal de roosterbeweging en F5-uitlijning tot de plekken perfect rond zijn. Doe hetzelfde voor elk van de 16 blokken totdat alle roosters op zijn plaats zijn.
  11. Ontleed en sla de gegevens op. Selecteer alle blokken (Crtl +A) en analyseer dan de data (Alt + A). Sla de analyseresultaten op (Ctrl + U) als een .gpr-bestand.
  12. Open het opgeslagen .gpr-bestand in een spreadsheetprogramma en analyseer de intensiteit van elke plek op basis van fluorescentie na lokale achtergrondaftrekking (F532-B532).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Array Printing, Development en Analysis:

Het afdrukken van een sialoglycan microarray met meerdere glycanmonsters en menselijke IgG STD-curven in 16 verschillende blokken vereist een grondige kalibratie om ervoor te zorgen dat alle monsters zo uniform mogelijk in alle 16 blokken per dia en op alle dia's in dezelfde afdrukcyclus worden gedrukt. Daarom zijn meerdere kalibreringsexperimenten nodig voordat de specifieke drukparam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een succesvolle glycan microarray fabricage vereist een zorgvuldige planning en bevat diverse belangrijke stappen in het protocol. Deze omvatten: (1) het plannen van de blok- en plaatlayouts die alle volgende parameters bepalen ( bijv. Afstanden, afstand, hoeveelheid monsters en afdrukken); (2) het schoonmaken van de pennen en het waarborgen van de pin integriteit, die van cruciaal belang is voor het controleren van spot homogeniteit; (3) het handhaven van hoge vochtigheid tijdens het printen, kritisch om vermi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Research Career Development Award van het Israël Cancer Research Fund, een subsidie ​​van het Israëlische National Nanotechnology Initiative en het Helmsley Charitable Trust voor een focal technologiegebied op Nanomedicines for Personalized Theranostics (VP-K) en National Instituten van Gezondheidstoelaag R01GM076360 (naar XC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Primary-amine bevattende sialoglycanenGlycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)Neem contact op met info@glycohubusa.com voor compound verzoekenGedrukte glycanen
Mononatriumfosfaat monohydraatSigmaS9638Print buffer component
Dinatriumfosfaat heptahydraatSigmaS9390Print buffer component
Fosfaat gebufferde zoutoplossingHy-LabsBP-507/500DPrint buffer/ incubatie/was buffer
Tris-baseSigmaT1503Slide blokkeringsreagens
GlycerolSigmaG-7893Print buffer component
EthanolamineThermo-Fisher Scientific0700/08Slide blokkeringsreagens
Ovalbumine (Grade V)SigmaA5503Slide blokkeringseiwit
Tween-20SigmaP7949Slide wasmiddel
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarker op array
ChromPure Human IgG, volledig molecuulJackson Immunoresearch009-000-003Print component
Biotinyleerde- SNAVector LaboratoriesB-1305Plant leukeen – binding Sia-alpha2–6-gekoppeld
Biotinyleerde-MALIIVector LaboratoriesB-1265Plant leukeen – binding Sia-alpha2–3-gekoppeld
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903Primaire detectie
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Biotine binding
Cy3-anti Human IgGJackson Immunoresearch109-165-088Secundaire detectie tegen human IgG
Cy3-anti Chicken IgYJackson Immunoresearch703-165-155Secundaire detectie tegen chicken IgY
Humane serum monstersIsraëlische BloedbankPrimaire detectie
Gecomprimeerde stikstof (Grade 5)Algemeen stof-/drooginstrument
Epoxy-gecoate slidesCorning40044Slides
Epoxy-gecoate slidesPolyAn2D 104-00-221Slides. Bij dit type slides is het oppervlak meer hydrofoob (in vergelijking met Corning slides), daarom moet de glycanen Print Buffer worden aangevuld met 0,005% Tween-20 om 100 µm grootte spots te verkrijgen.
384-well microtiterplaatGenetix2070Printplaat
VWR lab markerVWR52877-310Slide labelen
VlekbadArrayItMSTSlide ontwikkeling tool
VlekbadVWR25608-904Slide ontwikkeling tool
Slides glazen houdersVWR631-9321Slide ontwikkeling tool
GenePix ScannerMolecular devices4000BSlide scanner
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60Array printer
PinsArrayIt946MP3Print pins
ProPlate ModuleGrace Bio-LabsP37004Slide ontwikkeling module
Gedistilleerde waterBio-Lab2321020500Vereist voor arrayer en bevochtiger
Elektronische Multi Pipette, 8 Kanaal, volumebereik 2-125 μLThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pipette voor monsters in de 384-well plaat te verdelen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
  2. Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
  3. Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
  4. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  5. Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
  6. Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
  7. Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
  8. Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
  9. Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
  10. Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
  11. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
  12. Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
  13. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  14. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
  15. Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
  16. Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
  17. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
  18. Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
  19. Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
  20. Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
  21. Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
  22. Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
  23. Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
  24. Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
  25. Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
  26. Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
  27. Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glycaanprintingantilichaamprofileringanalyse van menselijke serafluorescentiedetectieepoxy gecoate objectglazennanoprintertechnologiePBST wassensecundair antilichaam

Gerelateerde artikelen