Hier beschrijven we een gemeenschappelijke methode om chronische lever schade in muizen door het eten van een dieet van choline-deficiënte en ethionine-aangevuld (CDE). We tonen gezondheidsmonitoring, lever perfusie, isolatie en behoud. Een tijdsverloop van zes weken kan informeren over de lever schade, pathohistology, fibrose, inflammatoire, en lever progenitor cel reacties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De lymfkliertest Choline-deficiënte, Ethionine-aangevuld (COB) dieet Model van chronische lever schade
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chronische leverziekten, zoals virale hepatitis, alcoholische leverontsteking of non-alcoholische vette leverziekte, worden gekenmerkt door voortdurende ontsteking, progressieve vernietiging en regeneratie van de hepatische parenchym, lever progenitor cel proliferatie, en fibrose. De einde-podium voor elke chronische leverziekte is levercirrose, een belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van hepatocellulaire carcinoom. Studeren processen regelen ziekte initiatie, vestiging en progressie, worden verschillende dierlijke modellen gebruikt in laboratoria. Hier beschrijven we een zes weken durende tijdsverloop van de choline-deficiënte en ethionine-aangevuld (COB) muismodel, waarbij zes - weken oude mannelijke C57BL/6J muizen vervoederen choline-deficiënte chow en 0,15% DL-ethionine-aangevuld drinkwater. Bewaking van de gezondheid van dieren en een typische lichaam gewicht verlies curve worden toegelicht. Het protocol wordt het bruto onderzoek van een COB-behandelde lever en bloed collectie cardiale punctie voor latere serum analyses. Vervolgens zijn de lever perfusie techniek en verzameling van verschillende hepatische lobben voor standaard evaluaties weergegeven, waaronder lever histologie evaluaties door haematoxyline en eosine of Sirius Red technieken, immunefluorescentie detectie van hepatische cel populaties evenals transcriptome profilering van de lever communicatie. Dit muismodel is geschikt voor studeren inflammatoire, fibrogenic en lever progenitor cel dynamiek geïnduceerd door chronische leverziekte en kan worden gebruikt om te testen potentiële therapeutische agenten die deze processen kunnen moduleren.
Inleiding
De lever is het grootste klierweefsel metabole orgaan van het lichaam en heeft vele complexe functies. Spelen een belangrijke rol voor de lever zijn spijsvertering, stofwisseling, ontgifting, opslag van essentiële voedingsstoffen, productie van bloed plasma proteïne componenten en via ingezeten macrofagen of Kupffer cellen gemedieerde immuniteit. De lever heeft een groot vermogen om te regenereren zelfs als tot 70-90% van de totale massa verloren gaat. In geval van acute lever schade, zoals gezien na een gedeeltelijke hepatectomy of paracetamol vergiftiging, vermenigvuldigen de resterende gezonde hepatocyten om te herstellen van de schade in een sterk gecoördineerde proces1. Echter, wanneer de hepatocyten zijn chronisch gewond als gevolg van langdurige virale infectie, alcoholische of non-alcoholische vette leverziekte, de inflammatoire communicatie activeert de activering van fibrose-rijden Notti hepatische cellen en de proliferatie van lever voorlopercellen (omzettingsbibliotheek) met het potentieel om te differentiëren in cholangiocytes of hepatocyten2,3,4,5. De precieze oorsprong, differentiatie lot van omzettingsbibliotheek, hun bijdrage aan de lever regeneratie en hepatocarcinogenesis onderwerpen van intens debat geweest en waarschijnlijk afhankelijk van de ernst van het letsel en kader2. De volgorde van vroege regeneratie-geassocieerde gebeurtenissen wordt ook controversieel besproken, met sommige onderzoekers verklaren dat hepatische Notti cel activatie en matrix remodeling is essentieel voor de generatie van een ten gunste van de LPC niche6, terwijl anderen verslag dat LPC expansie en de zogenaamde Ductular reactie nodig voor de trigger fibrogenese7 zijn. Er zijn talrijke dierlijke modellen om te bestuderen van specifieke aspecten van de schade en de regeneratie, in een poging om te begrijpen van alle onderliggende factoren die het reguleren van de progressie van de ziekte en uiteindelijk nieuwe om behandelingsstrategieën te ontwikkelen voor patiënten8.
De choline-deficiënte en ethionine-aangevuld (COB) dieet model was oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij ratten en later gewijzigd voor chronische lever schade inductie in muizen9,10. Dietary tekort aan choline resulteert in verminderde vergadering en secretie van zeer low-density lipoproteins. In combinatie met de hepatocarcinogen DL-ethionine, dit regime leidt tot buitensporige hepatische vet laden, continue ontsteking, periportal fibrose, LPC reactie en op lange termijn naar hepatocellulaire carcinoom ontwikkeling11,12 . Echter bovenal verschillende muis spanningen vertonen karakteristieke patronen van inflammatoire, fibrogenic en LPC reactie dynamics13. Dit protocol beschrijft chronische lever schade inductie in C57BL/6J muizen, de meest gebruikte inteelt muis stam.
In chronische leverziekte onderzoek omvatten typische analyses histologische evaluaties door haematoxyline en eosine, evenals het Sirius rode vlekken om te visualiseren collageen depositie, immunohistochemische of immunefluorescentie detectie van hepatische cel populaties, en transcriptomic analyses van de lever communicatie die de geïnduceerde cellulaire veranderingen door middel van complexe groeifactor en cytokine netwerken14,15,16,17 regisseert , 18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. dier experimenten
alle dierlijke studies beschreven in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Curtin University dier ethische Commissie (erkenningsnummer: AEC_2014_28) vóór de aanvang van de experimenten en uitgevoerd volgens de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren.
- Dieren
- zes - weken oude mannelijke C57BL/6J muizen te gebruiken voor de experimenten.
- Experimenteel ontwerp
- na aankomst bij het dier faciliteit, kunnen muizen om te acclimatiseren voor vier dagen voor aanvang van elke experimenten.
- Huis muizen op wheaten kaf beddengoed, die heeft uitgeput van zichtbare korrels en stengels en houden van muizen op 12 uur dag/nacht cycli in afzonderlijk geventileerd kooien. Verandering beddengoed op dagen drie en zeven, dan daarna wekelijks.
- Provide muizen met ad libitum toegang tot de choline-deficiënte voeding en drinkwater aangevuld met 0,15% van DL-ethionine. Houd de DL-ethionine-aangevuld water bij 4° C en vervang drinking water elke tweede dag om versheid te verzekeren en aan te moedigen drinken. Top van de choline-deficiënte chow elke tweede dag met een compleet andere chow wekelijks.
- Let op muizen in rust en tijdens de behandeling. De standaard tekenen van de monitor van de gezondheid van de dieren, met inbegrip van de totale uitstraling, houding, sociale interactie, grooming, vacht conditie en lichaamsgewicht.
- Weigh muizen dagelijks tijdens de eerste twee weken van het experiment om ervoor te zorgen dat alle dieren vertonen meer dan 20% lichaam gewichtsverlies zijn euthanized te beperken van onnodig lijden. Dit is meestal het geval is in minder dan 5% van de dieren. Na twee weken, kan de frequentie van de wegen worden gereduceerd tot drie keer per week (bijvoorbeeld maandag, woensdag, vrijdag).
- Lever perfusie en isolatie
- verdoving muizen op punten van de aangegeven tijd (in deze studie één, twee en zes weken op de CDE-dieet) met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door intraperitoneale injectie. Testen van de pedaal terugtrekking reflex om ervoor te zorgen voldoende verdoving.
- NAT van de vacht met 70% ethanol en maak een verticale middellijn incisie in de buikwand tot het diafragma met behulp van Mayo schaar. De ribbenkast kan worden verwijderd voor gemakkelijkere toegang tot het hart.
- Collect bloed door langzame cardiale punctie met behulp van een 25 G x 1/2 " regelmatige muur naald om te voorkomen dat het instorten van het hart. Laat het bloed stollen in de buis van een microcentrifuge bij kamertemperatuur te verkrijgen serummonsters na centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 10 minuten. Later, het meten van serum alanine-aminotransferase niveaus door standaardprocedures 12.
- Verplaatsen van de maag en de dunne darm naar de kant en de portal vein blootstellen. Knip het hart met behulp van Mayo schaar om vloeistoffen te sluiten en perfuse van de lever met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH = 7.4) door cannulating van de ader van de portal met behulp van een 27 G x 1/2 " regelmatige muur naald. Een gelijkmatig geblancheerde lever geeft aan succesvolle perfusie van alle lever lobben.
- Voorzichtig losmaken van de lever en plaatst u deze in een petrischaal met pincet en Mayo schaar. Verwijder overtollige, niet-lever weefsel en de galblaas.
- Lever behoud
- nadat het totaalgewicht van de lever is geconstateerd, een kleine kwab in verschillende kleine stukjes van een paar vierkante millimeter, gesneden hen overbrengen in steriele buizen, en snap-freeze in vloeibare stikstof voor latere RNA en eiwit extractie, volgens standaardprotocollen. Module-freeze deze weefsel stukken zo spoedig mogelijk na het orgel verzamelen om te voorkomen dat elke aantasting van het weefsel.
- Verzamelen een kwab in 10% neutraal gebufferde formaline voor latere verwerking en paraffine insluiten, zoals per standaardprotocollen.
- Plaats een lobe in een mal gevuld met optimale snijden temperatuur cryomatrix hars inbedding en module-freeze in vloeibare stikstof.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de tijdsverloop van de zes weken durende van COB-geïnduceerde chronische lever schade, werden parameters beoordeeld op dagen 7 (inductie fase), 14 en 21 (oprichtingsfase) en 42 (onderhoud fase). In vergelijking met controle muizen, muizen COB-behandeld tot 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht verloren in een fase van de eerste aanpassing en neiging om gewicht herwinnen in de vestiging- en onderhoudsfasen (Figuur 1). Het lichaamsgewich...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Chronische leverziekte is vaak een stille ziekte met meeste asymptomatische patiënten en het is een van de belangrijke bijdragen aan de morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Chronisch alcoholisme en hepatitis C virusinfectie zijn de belangrijkste oorzaken. Chronische lever schade wordt gekenmerkt door een ontsteking van de lever, fibrose en in ernstige gevallen cirrose en carcinoom uiteindelijk lever mislukking. Er is momenteel geen remedie beschikbaar en hoewel belangrijke vooruitgang hebben geboekt om te begrijpen van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er is niets te worden verschaft door de auteurs.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) van Australië (APP1042370, APP1061332, APP1087125). De auteurs bedank het Curtin Health Innovation Research Institute personeel voor technische bijstand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Zes weken oude mannelijke C57BL/6J muizen | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australië | N/A | |
| 10 Kg gestoomde snijgerst stro | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australië | N/A | |
| Water voor irrigatie 1000ml fles (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australië | AHF7114A | |
| Choline-arm dieet, gemodificeerd (korrels) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australië 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australië | E5139-25G | |
| Ketamil injectie | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australië | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injectie | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australië | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Naald | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australië | NN-2713R | |
| Spuiten Terumo 1ml en 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australië | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australië | 25608-930 | |
| Neutraal gebufferd formaline | Amber Scientific, Midvale, WA, Australië | NBF-2.5L | |
| Ethanol absoluut anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australië | 20821.33 | |
| Superfrost Plus glijmiddelen | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australië | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-vrij | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australië | X090930-2 | |
| Dako antilichaam verdunning | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australië | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 verdunning |
| konijn anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australië | Z0622 | 1/300 verdunning |
| Geit anti-konijn (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australië | A-11008 | 1/500 verdunning |
| Geit anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australië | A-11007 | 1/500 verdunning |
| ProLong Gold Antifade Reagens met DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australië | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
Referenties
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
