Method Article

Monster extractie en gelijktijdige chromatografische kwantificatie van Doxorubicine en mitomycine C na Drug Delivery van de combinatie in nanopartikels met Tumor-dragende muizen

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een efficiënte en handige analytische proces van extractie van het monster en gelijktijdige bepaling van meerdere drugs, Doxorubicine (DOX), mitomycine C (MMC) en een cardio-toxisch DOX metaboliet, doxorubicinol (DOXol), in de biologische monsters uit een preklinische borst tumor model behandeld met nanoparticle formuleringen van synergetische drug combinatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Combinatie chemotherapie wordt vaak gebruikt in de kliniek voor de behandeling van kanker; echter kunnen bijbehorende nadelige effecten op de normale weefsel beperken het therapeutisch nut hebben. Nanoparticle gebaseerde drug combinatie is aangetoond dat het verminderen van de problemen van gratis drug combinatietherapie. Onze vorige studies hebben aangetoond dat de combinatie van twee geneesmiddelen, Doxorubicine (DOX) en mitomycine C (MMC), een synergie-effect tegen beide RattenUitrustingen geproduceerd en menselijke borstkanker cellen in vitro. DOX en MMC mede geladen polymeer-lipide hybride nanodeeltjes (DMPLN) overgeslagen verschillende efflux vervoerder pompen die multidrug resistentie en aangetoonde verbeterde werkzaamheid in borst tumor modellen verlenen. Vergeleken met conventionele oplossing vormen, werd deze superieure werkzaamheid van DMPLN toegeschreven aan de gesynchroniseerde farmacokinetiek van DOX en MMC en verhoogde intracellulaire drug biologische beschikbaarheid binnen de tumorcellen ingeschakeld door de nanocarrier PLN.

Om te evalueren van de farmacokinetiek en bio-distributie van samen toegediend DOX en MMC in zowel gratis oplossing en nanoparticle vormen, een eenvoudige en efficiënte multi geneesmiddelenanalyse-methode met behulp van reverse-fase hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) was ontwikkeld. In tegenstelling tot de eerder gemelde methoden die DOX of MMC afzonderlijk geanalyseerd in het plasma, is deze nieuwe HPLC-methode kunnen gelijktijdig kwantificeren DOX, MMC en een grote cardio-toxisch DOX metaboliet, doxorubicinol (DOXol), in verschillende biologische matrices ( bijvoorbeeld volbloed, borst tumor en hart). Een dubbele TL- en UV absorberend sonde 4-methylumbelliferone (4-MU) werd gebruikt als een interne standaard (I.S.) voor one-step detectie van meerdere geneesmiddelenanalyse met verschillende detectie golflengtes. Deze methode werd succesvol toegepast om te bepalen van de concentraties van DOX en MMC geleverd door zowel de nanoparticle als de oplossing benaderingen in volbloed en verschillende weefsels in een orthotopic borst tumor lymfkliertest model. De analytische methode gepresenteerd is een nuttig hulpmiddel voor pre-klinische analyse van de nanoparticle gebaseerde levering van drug combinaties.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemotherapie is een primaire behandeling modaliteit voor vele vormen van kanker, maar het is vaak geassocieerd met ernstige bijwerkingen en beperkte doeltreffendheid als gevolg van resistentie tegen geneesmiddelen en andere factoren1,2,3. Ter verbetering van het resultaat van de chemotherapie zijn drug combinatie regimes toegepast in de kliniek op basis van overwegingen, zoals niet-overlappende toxicities, verschillende mechanismen voor drug actie, en niet-cross drug weerstand4,5 , 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

alle dierproeven werden goedgekeurd door het dier Care Comité van University Health Network op de Ontario Cancer Institute en uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care Guidelines.

1. biologische bereiding van de monsters

  1. verzamelen van de volbloed, belangrijke organen, en borst tumor op vooraf bepaalde tijdstippen na intraveneuze (i.v.) toediening van drug-bevattende formuleringen (b.v. DMPLN, Liposomale DOX)
    1. een borst tumor-dragende muis i.v. injecteren met een bereid drug-bevattende formulering.
    2. Anesthetize van de muis op de aangewezen tijd-punten (bijvoo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twee antikanker geneesmiddelen, DOX en MMC, evenals de DOX metaboliet, DOXol, werden gelijktijdig ontdekt een biologische ongehinderd onder dezelfde toegepaste gradiënt HPLC staat gebruik van 4-MU als de I.S. voor zowel de fluorescentie en UV detectoren. DOX, MMC, DOXol en 4-MU waren goed van elkaar gescheiden met retentietijden van 5.7 min voor MMC, 10.4 min voor DOXol, 10.9 min. voor 4-MU en 11.1 min voor DOX (Figuur 2). Elk medicijn in volbloed en verschil.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergeleken met andere chromatografische methoden waarmee de detectie van een enkele drug soort tegelijk, vermag het huidige protocol van HPLC kwantificeren gelijktijdig drie drug compounds (DOX, MMC en DOXol) in de matrix dezelfde biologische zonder naar de nood voor wijzigen de mobiele fase. Deze voorbereiding en analyse methode is succesvol toegepast om te bepalen van de farmacokinetiek en bio-verdeling van twee nanoparticle gebaseerde drug afgiftesystemen (dat wil zeggen, Liposomale DOX en DMPLN)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de subsidie van de apparatuur van de natuurwetenschappen en de Engineering Research (NSERC) Raad van Canada voor HPLC, de exploitatiesubsidie van de Canadian Institute of Health onderzoek (CIHR) en de Canadian Breast Cancer Research (CBCR) Bondgenootschap aan X.Y. Wu, en de beurs van de Universiteit van Toronto R.X. Zhang en T. Zhang.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doxorubicin Polymed Theraeutics111023Anticancer drug
Mitomycin CPolymed Theraeutics060814Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt Sigma-AldrichM1508Internal standard
Myristic AcidSigma-Aldrich544-63-8  Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) StearateSpectrumM1402Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) StearateSigma-AldrichP3440Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H)Hielscher, Ultrasound TechnologyNANanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNANanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx)JanssenPurchased from the pharmacy Princess Margaret HospitalClinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded MethanolCaledon Chemicals6701-7-40HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile Caledon Chemicals1401-7-40HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic AcidSigma-Aldrich302031HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter PaperWhatmanWHA7404004HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic SyringesBecton, Dickinson and Company2606-309659Treatment injection
5cc Plastic SyringesBecton, Dickinson and Company2608-309646Tissue collections
30G 1/2 NeedlesBecton, Dickinson and Company305106Treatment injection
25G 5/8 NeedlesBecton, Dickinson and Company305122Tissue collections
Sterile 0.9% SalineUniveristy of Toronto House Brand1011Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube SARSTEDT62.515.006Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Cell medium
1 x Phosphate Buffer SalineGibco10010023Tissue homogenization
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLTissue homogenization
Formic acidCaledon Chemicals1/5/3840Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubesBecton, Dickinson and Company367878Blood collection
Analytical Weigh Balance Sartorius CPA225DNA
pH meters Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge TubeFisherbrand2043-05408129Prolyprolene
Model 1000 homogenizerFisher Scientific08-451-672Tissue homogenization
Centrifuge 5702REppendorf5702RExtraction preparation
Heated Evaporator SystemGlas-ColNASample reconstitution
HPLC Screw Thread VialsDIKMA5320HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone SeptaDIKMA5325HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert  Agilent Technologies5182-0549Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117Drug analysis
Gradient pump Waters CorporationW600Drug analysis
Auto-samplerWaters CorporationW2707Drug analysis
Photodiode array detector Waters CorporationW2998Drug analysis
Multi λ fluoresence detector Waters CorporationW2475Drug analysis
EMPOWER 2Waters CorporationNAData analysis software
ScientistMicromathNAPharmacokinetic analysis
Female Balb/c MiceJackson Laboratory001026In vivo
EMT6/WT Breast Cancer CellsProvided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles