Pronuclear (PN) injectie van de geclusterde interspaced regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) en CRISPR-geassocieerde proteïne-9 nuclease (CRISPR/Cas9)-systeem is een zeer efficiënte methode voor de productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische hamsters. Hierin beschrijven we het gedetailleerde PN injectie protocol voor de productie van gene knockout hamsters met het systeem CRISPR/Cas9.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pronuclear (PN) injectietechniek werd opgericht in muizen te introduceren van buitenlandse genetische materiaal in de pronuclei van één-cel fase embryo's. Het geïntroduceerde genetisch materiaal kan integreren in het embryonaal genoom en genereren van transgene dieren met buitenlandse genetische informatie na overdracht van de geïnjecteerde embryo's ter bevordering van de moeders. Na het succes in muizen, PN injectie met succes is toegepast in vele andere diersoorten. Onlangs, PN injectie heeft met succes gewerkt om reagentia bij het wijzigen van gen activiteiten, zoals het systeem van de CRISPR/Cas9, boerderij diersoorten te bereiken site-specific genetische modificaties in verschillende laboratorium. Naast het beheersen van de speciale set van microinjection vaardigheden voor de productie van genetisch gemodificeerde dieren door PN injectie, moeten onderzoekers begrijpen de Fysiologie van de voortplanting en het gedrag van de doelsoort, omdat elke soort uniek presenteert uitdagingen. Bijvoorbeeld, gouden Syrische hamster embryo's hebben unieke behandeling eisen in vitro zodat PN injectie technieken niet mogelijk in deze soort tot recente doorbraken van onze fractie waren. Met onze soorten gemodificeerde PN injectie protocol, is het gelukt in het produceren van verschillende gene knock-out, (KO) en knockin (KI) hamsters, die met succes zijn gebruikt om ziekten van de mens van het model. Hier beschrijven we de PN injectie procedure voor het uitbrengen van de CRISPR/Cas9-complex aan de zygoten van de hamster, het embryo behandeling voorwaarden, embryo transfer procedures en veeteelt nodig voor de productie van genetisch gemodificeerde hamsters.
Inleiding
De gouden goudhamster (Mesocricetus auratus) is één van de meest gebruikte knaagdieren voor biomedisch onderzoek. Volgens het Amerikaanse ministerie van landbouw, werden ongeveer 100.000 hamsters gebruikt in de Verenigde Staten in 2015, 13% van totale laboratorium dierlijke gebruik onder de soorten die vallen door de Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; toegankelijk 10 maart, 2017).
De hamster biedt diverse voordelen ten opzichte van andere knaagdieren in de studie van een aantal ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, de alvleesklier ductaal adenocarcinomas histopathologisch onderzoek van N-nitrosobis(2-oxopropyl) amine (BOP) geïnduceerde in hamster is vergelijkbaar met menselijke alvleesklier tumoren, terwijl BOP behandeling voornamelijk induceert tumoren van de schildklier bij ratten en longen en lever tumoren in muizen1. Omdat hamsters het slechts kleine knaagdier gevonden zijn ter ondersteuning van de replicatie van adenovirussen, zijn ze ook het model van de keuze voor het testen van adenovirus gebaseerde oncolytische vectoren en anti-adenovirus drugs2,3,4. Een ander voorbeeld waarin de hamster-model een voordeel ten opzichte van muizen en ratten biedt is in de studie van hyperlipidemie. Mens en hamsters vertonen grote overeenkomsten in lipide stofwisselingsroutes en beide soorten dragen het gen cholesteryl ester transfer proteïne (CETP), die een centrale rol in lipide stofwisseling speelt, terwijl CETP is afwezig in muizen en ratten5codering. Daarnaast ontwikkelen hamsters hemorragische ziekte meer representatief zijn voor de menselijke manifestatie na blootstelling aan Ebola virus6. Hamsters zijn ook de modellen van keuze voor de studie van atherosclerose7, mondelinge carcinomen8en inflammatoire myopathieën9. Onlangs, ook is gebleken dat de hamsters zeer gevoelig voor infectie met een macrovirus Andes zijn en hantavirus syndroom-achtige longziekte ontwikkelen, die het alleen knaagdieren model van Andes virus infectie10.
Om aan te pakken onvervulde behoefte aan nieuwe genetische dierlijke modellen om te bestuderen van de menselijke ziekten waar geen betrouwbare kleine knaagdieren model beschikbaar is, wij onlangs geslaagd bij de toepassing van de CRISPR/Cas9-systeem op de hamster en hebben verscheidene lijnen van genetisch gemanipuleerde hamsters11. Hamster zygoten zijn zeer gevoelig voor milieu milieus, zodanig dat de PN injectie protocollen ontwikkeld in andere soorten ongeschikt zijn. Daarom ontwikkelden we een PN injectie protocol voor de hamster dat geschikt is voor de speciale vereisten voor het afhandelen van de hamster embryo's in vitro. Hier beschrijven we de gedetailleerde PN injectie procedure met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem en de bijbehorende stappen, van de voorbereiding van enkele gids RNA (sgRNA) voor de overdracht van de geïnjecteerde embryo's in ontvangende vrouwtjes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De in dit protocol beschreven procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Utah State University (IACUC protocol: 2484). Hamsters gebruikt in dit protocol zijn volwassen (6-10 weken oud) LVG stam gouden Syrische hamsters. Alle hamsters zijn ondergebracht in het vivarium bij het Bioinnovation center, Utah State University. Kamertemperatuur is ingesteld bij 23 ° C, luchtvochtigheid is ingesteld op 40-50% en lichte cyclus ligt 14L: 10 d (licht: donker). Indien mogelijk, moeten embryo manipulatie en surugical procedures worden uitgevoerd met steriele technieken.
1. sgRNA en Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) voorbereiding
- Synthetiseren sgRNAs na de in vitro transcriptie procedures die worden beschreven in de handleiding van synthese kit (materialen tabel, Supplement 1).
- Te monteren ribonucleoproteins, Meng 2 µg Cas9 met 1 microgram van sgRNA en Incubeer de mix bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. Zorg voor PN injectie, een werkende oplossing op de concentratie van 100 ng/µL Cas9 en 50 ng/µL sgRNA met 10 mM TE buffer (RNase gratis, Materialen tabel).
2. vasectomie voorbereiding
Opmerking: Vasectomie wordt uitgevoerd op mannelijke hamsters op 6-8 weken oud. De operatie zou worden uitgevoerd 10-14 dagen vóór de eerste paring. Steriliteit wordt bevestigd door mislukte zwangerschappen van paring met vruchtbare vrouwtjes. Vasectomized mannen kunnen normaal gesproken worden gebruikt voor een jaar voordat ze minder seksueel actief worden.
- Anesthetize mannen door intraperitoneaal (i.p.) injectie van ketamine/xylazine met een dosis van 40 mg/kg (ketamine) en 10 mg/kg (xylazine). Bevestig verdoving door gebrek aan een pedaal reflex (Teen snuifje).
- Leg de ingetogen hamster in dorsale lighouding op een droge tissue papier. Spoel de buik met drie ronden van antiseptische behandelingen door afwisselend chirurgische scrub oplossingen tussen 70% alcohol en Povidon-jodium.
- Maak een verticale insnijding met chirurgische schaar vanaf 1,5 cm cranial aan de voorhuid zich uitstrekt van 1 cm aan elke kant van mid lijn (Figuur 1a). Incise van de huid, subcutaan weefsel en linea alba voor toegang tot de peritoneale ruimte (Figuur 1b).
- Zachte druk uitoefenen op de caudal aspect van het scrotum te dwingen de testes en vetweefsel uit. Pak de zaadleiders zachtjes met een tang en zorgvuldig het bloedvat van de vas te scheiden met een tweede set van verlostang (Figuur 1 c).
- Houd de zaadleiders met pincet te vormen van een lus. Verwarm het uiteinde van een andere verlostang in vlam totdat het is rood, en gebruik vervolgens het verwijderen van de lus van de zaadleiders. Invoegen van vetweefsel en teelballen terug naar de buik. Verwijder de zaadleiders aan de tegengestelde kant met dezelfde procedures.
- Sutuur (geologie) de spiermassa eerst door de huid wordt gevolgd. Plaats het dier op een warme pad in een kooi voor 30 min tot het dier zich herstelt. Observeer het dier totdat het normale activiteit hervat.
3. donor/ontvanger Hamster voorbereiding schema
- Monitor en record Oestrische cycli.
Opmerking: Vrouwelijke hamsters hebben een stabiele 4-daags oestrische cyclus die onmiddellijk na de bevalling wordt bijgehouden. Vrouwtjes op de eerste dag van Oestrische kunnen worden geïdentificeerd door het ondoorzichtige, gelige en plakkerig vaginale afscheiding (Figuur 2a). Vrouwtjes op dag 4 van Oestrische kunnen worden geïdentificeerd door het transparant, kleverig slijm (Figuur 2b). - Voor superovulatie van donor hamster, superovulate de geslachtsrijpe vrouwtjes (> 6 weken) op de eerste dag van de oestrische cyclus door IP-injectie van zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG; opgeloste in PBS als 50 IU/mL) (tabel 1) tussen 9 - 12u.
Opmerking: PMSG is voor inducerende superovulatie maar niet voor oestrische cyclus synchronisatie. - 80 - 84 uur na de injectie van PMSG (dag 4, 6-8 PM), plaats de vrouwtjes in kooien met mannetjes voor een paring. Zoals hamster verparingen niet leiden copulatie tot pluggen, zorgen voor succesvolle verparingen door de verparingen kijken.
- Voorbereiden pseudopregnant vrouwtjes door de paring geslachtsrijpe vrouwtjes op dag 4 van Oestrische met vasectomized mannetjes. Het tijdschema voor de voorbereiding van donor en ontvanger vrouwtjes staan in tabel 2.
Opmerking: True zwangere vrouwtjes kunnen ook worden gebruikt als geadresseerden, dat wil zeggen, vrouwen met een jas-kleur te onderscheiden van de gouden kleur gematteerd met dezelfde kleur vruchtbare mannetjes. Pups, embryotransfer afgeleid kunnen worden geïdentificeerd op basis van de kleuren van de vacht. Een potentiële voordeel bij het gebruik van echte zwangere vrouwtjes is dat endogeen geproduceerde embryo's zou zorgen voor succesvolle zwangerschappen en PN geïnjecteerd embryo's helpen aan het implantaat; een mogelijk nadeel bij het gebruik van echte zwangere vrouwtjes als ontvangers is dat PN geïnjecteerd embryo's moeten concurreren met endogeen embryo's voor inplanting geproduceerde.
4. de zygote isolatie
- Bereiden kweekmedium (HECM-9; recept is beschreven in Supplement 2), zoals eerder is beschreven in McKiernan en Bavister12.
- Een dag voorafgaand aan PN injectie, bereiden zygote behandeling gerechten (25 µL/drop) en een PN injectie neerzetten (100 µL) in het deksel van de schotel van een 35 mm met HECM-9. Dan dekken de middellange druppels met minerale olie. Evenwicht medium in een incubator's nachts onder de volgende voorwaarden: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 en 100% luchtvochtigheid.
- Op de dag gepland voor PN injectie, embryo Afboekingsmethode gerechten (1 schotel/donor hamster) met HECM-9 bereiden en bewaren van alle gerechten in de incubator tot gebruik.
- Euthanaseren superovulated hamsters met CO2.
- Oviduct isolatie
- Plaats een euthanized vrouwelijke hamster in dorsale lighouding op een chirurgische draperen of papieren zakdoekje en voorbereiden van de buik met een spray van 70% ethanol.
- Stevig huid en buikspier laag houden op de middellijn en maak een incisie. Incise van het buikvlies blootstellen van de buikorganen.
- Een van de baarmoeder horens vatten met een fijne pincet en intrekken van het weefsel van de buik. De baarmoeder te scheiden van het mesometrium en vet weefsel. Maken een cut tussen het oviduct en eierstok en een tweede snede grenzend aan de kruising van de oviduct en baarmoeder (een klein deel van de baarmoeder). Plaats de twee oviducts in dezelfde flush schotel.
- Leegmaken en verzamelen zygoten
- Onder de Microscoop dissectie, begrijpen van de kant van de baarmoeder hoorn met een #5 Dumont pincet en invoegen van een zelfgemaakte naald (Figuur 3) in het lumen van het oviduct vanaf het infundibular einde en het oviduct met 300-400 µL van HECM-9 medium flush.
- Verzamelen van de zygoten onmiddellijk en was ze tweemaal met HECM-9 medium in de behandeling schotel. In dit stadium van ontwikkeling, moet alle van de zygoten worden denuded uit cumulus cellen.
- Plaats de zygoten in een incubator (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 en 100% vochtigheid) onmiddellijk na het verzamelen om te minimaliseren van de blootstelling aan licht.
5. PN injectie
- Ontdooi de Cas9/sgRNA-RNP op ijs en handhaven van het complex op het ijs tijdens het hele proces van PN injectie.
- Laden van de naalden van de injectie met Cas9/sgRNA RNP oplossing onmiddellijk vóór de injectie-experimenten. Plaats van het achterste uiteinde van de injectie naalden in de buis met de Cas9/sgRNA RNP-oplossing en laat de oplossing van de Cas9/sgRNA RNP te vullen de naald door capillaire werking.
- Bereiden de injectie schotel en naalden. Vul de houder pipet met minerale olie voor binnen ~ 3 mm van de bocht van de naald van de houder. Schakel de houder in de microinjector met het topje van de naald horizontaal ten opzichte van de onderkant van de schotel en vul het puntje van de naald met medium door afzuigen. Stel de injectie naald onder een hoek van 10-15° tegengesteld aan de houder.
- PN injectie
- Een zygote identificeren en een fijne afzuigen met de naald van de houder. In het ideale geval zijn de mannelijke en vrouwelijke pronuclei binnen de dezelfde brandpuntbereik en uitgelijnde evenwijdig aan de houder.
- Doordringen de zona en mannelijke pronuclei (3 oclock ' toestand) met de naald van de injectie.
- De injectie naald snel te trekken zodra de pronucleus zwelt om te voorkomen dat de kern vast te houden aan de naald en om te voorkomen beschadiging van de pronucleus.
6. zygoten overbrengen naar Pseudopregnant Hamsters
- Anesthetize een pseudopregnant hamster (de zelfde manier zoals beschreven in de sectie vasectomie hierboven) en leg het op een chirurgische draperen of droge tissue papier in ventrale ligcomfort.
- Oog smeermiddelen toepassen door de ogen van het dier te voorkomen oog droogheid en betrekking hebben op het hoofd met een doek of papier te beschermen de ogen tegen licht. Het laterale aspect van het lichaam voor te bereiden door het scheren een over 4 x 4 cm huidgebied aan elke zijden van het lichaam, gevolgd door 3 keer van Povidon-jodium scrubs en 3 keer 70% ethanol struikvegetaties toe te passen. Maken een verticale incisie van 2 cm 2 cm caudal de laatste rib (zoals weergegeven in de figuren 4a, 4b) aan iedere kant van de achterkant van het dier.
- Pak het vet pad met een tang en trek voorzichtig totdat de oviduct en baarmoeder zichtbaar zijn. Klem het vet pad met een hemostats en het vet pad dorsally weerspiegelen over de wervelkolom (Figuur 4 c). Plaats het voortplantingskanaal zodanig dat de baarmoeder buis kan worden gepenetreerd met een naald 30 meter voor de embryotransfer (Figuur 4 d).
- Wassen van de geïnjecteerde zygoten met HECM-9 in een nieuwe schotel. Gebruik een nieuwe glazen pipet (diameter: ~ 150-200 µm) 10-15 zygoten laden. Schik de zygoten als een ketting van parels gevolgd door enkele luchtbellen. Plaats de pipet in de open gepenetreerd buis uit stap 6.3 en zachtjes blazen in de Pipet de zygoten overbrengen naar het oviduct. Blijven blazen tot de eerste luchtbel wordt vrijgegeven in het darmstelsel oviduct (figuur 4e).
- Laat het vet pad en het weefsel terug te keren naar de buik. Overbrengen (10-15) ongeveer evenveel van ingespoten embryo's een andere oviduct darmkanaal door dezelfde processen.
- Suture de spieren en de huid in 2 lagen. Buprenorfine-HCL (0,5 mg/kg) subcutaan beheren als postoperatieve analgesie. De hamster terugkomen in een kooi en plaats van de kooi op een warme pad voor herstel. Terug de kooi naar de dierlijke kamer wanneer het dier is volledig hersteld van de verdoving. Postoperatieve pijnstillers krijgen weer zes uur later.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De efficiëntie van het beschreven protocol in de productie van genetisch gemodificeerde hamsters hangt af van de uitkomsten van de volgende twee belangrijke stappen: het geboortecijfer van live voor geadresseerden vrouwtjes en het aantal levende pups met de beoogde genetische modificaties. Het geboortecijfer van live is een directe resultaten van de kwaliteit van de embryo's en de vaardigheid van het uitvoeren van de PN injectie en embryo transfer procedures individu. Om ervoor te zorgen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om beter de mogelijkheden van gouden Syrische hamsters als modellen van ziekten bij de mens, ontwikkelden we een PN injectie protocol voor het leveren van een CRISPR/Cas9 complex te richten op het genoom van de hamster. Het protocol van de injectie PN optimaliseert verschillende belangrijke variabelen met inbegrip van het embryo kweekmedium, temperatuur en golflengten van licht13. Er zijn ook verschillende hamster-specifieke dierlijke omgang die volgen moeten voor het succesvol uitvoeren van genta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
ZW heeft financiële belangen in Auratus Bio, LLC., een biotechnologiebedrijf gespecialiseerd in het maken van genetisch gemanipuleerde dieren voor biomedisch onderzoek en agrarische toepassingen.
Dankbetuigingen
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de nationale instituten van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health onder het nummer 1R41OD021979 award (tot ZW) en door een onderzoek subsidie van de Next-Generation BioGreen 21 Programma, Republiek Korea, verlenen neen. PJ01107704 (tot ZW) en verlenen geen. PJ01107703 (naar IK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health of BioGreen 21. Wij danken Dr Nikolas Robl voor het bewerken van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | Voor sgRNA-synthese |
| Albumine uit menselijk serum | Sigma | A1653 | Voor kweekmedium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | Voor embryotransfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | Voor embryocultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | Voor het maken van injectienaalden |
| Microscoop | Nikon | ECLIPSE Ti-S | Voor micro-injectie |
| Microscoop | invitrogen | SMZ745T | Voor embryotransfer |
| Minerale olie | Sigma | M1840 | In het donker bewaren |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | Voor superovulatie |
Referenties
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755(2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
