Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Samenvatting

De Overspraak tussen tumorcellen en bot cellen in het bot-communicatie is van cruciaal belang voor het begrip van het mechanisme van metastase biomineralisatie. We een in vitro volledig menselijk preklinische model ontwikkeld van een co cultuur van borstkankercellen en monocyten ondergaan differentiatie naar osteoclasten. We een model van osteoclastogenesis vanaf een steekproef van perifeer bloed verkregen van gezonde donoren geoptimaliseerd. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) waren eerst gescheiden door dichtheid kleurovergang centrifugeren, ontpit op een hoge dichtheid en geïnduceerde te onderscheiden door de toevoeging van twee groeifactoren (GFs): receptor activator van nucleaire factor-recombination ligand (RANKL) en macrofaag kolonie-stimulerende factor (MCSF). De cellen waren nog in cultuur voor 14 dagen vast en geanalyseerd door downstream analyse. In osteolytic botmetastasen is een van de gevolgen van kanker cel aankomst in bot de inductie van osteoclastogenesis. We dus ons model met co culturen van borstkankercellen te bestuderen van de kracht van de differentiatie van de kankercellen met betrekking tot de GFs uitgedaagd. Een eenvoudige manier voor het bestuderen van kanker cel-osteoclast interactie is voor het uitvoeren van indirecte co culturen, gebaseerd op het gebruik van geconditioneerde medium verzameld uit borst kanker celculturen en gemengd met verse medium. Dit mengsel wordt vervolgens gebruikt voor het opwekken van osteoclast differentiatie. Wij ook geoptimaliseerd voor een methode van directe co cultuur in welke kanker cellen en monocyten differentiatie ondergaan delen van het medium en wisselen secreted factoren. Dit is een significante verbetering over de oorspronkelijke methode van de indirecte samenwerking cultuur als onderzoekers kunnen de wederzijdse interactie van de twee celtypes observeren en downstream-analyses voor zowel de kankercellen als de osteoclasten uitvoeren. Deze methode kan we bestuderen het effect van drugs op de communicatie van uitgezaaide bot en zaad cellijnen die niet worden afgeleid van borstkanker. Het model kan ook worden gebruikt om te bestuderen van andere ziekten zoals osteoporose of andere bot-voorwaarden.

Inleiding

Bot is een gemeenschappelijke site van metastase voor verschillende soorten primaire tumoren zoals prostaat-, Long- en borstkanker kanker, met 20-25% van de patiënten ontwikkelen botmetastasen in de loop van ziekte^1,2,3. In het bijzonder, dragen 70% van de borstkankerpatiënten bewijs van bot metastase op dood⁴. Tumor en stromale cellen interactie is essentieel voor de progressie van kanker in zowel primaire kanker en secundaire laesies. In de communicatie van het bot, is osteolytic botmetastasen van borstkanker afhankelijk van de oprichting van een pathologische vicieuze cirkel die zich voordoen tussen kankercellen, cellen van het bot en de bot-communicatie. Kankercellen verstoren bot evenwicht, toenemende bot resorptie^5,6,7.

In normale en pathologische omstandigheden zijn osteoclasten de cellen die verantwoordelijk zijn voor bot resorptie, terwijl botcellen, in het deponeren van de nieuwe matrix, verantwoordelijk voor het nieuwe bot vorming^{8 zijn}. Osteoclast activiteit wordt gereguleerd door botcellen door de uitdrukking van RANKL, dat aan de receptor rang op het oppervlak van de pre osteoclast bindt, inducerende pre osteoclast fusion, een noodzakelijk proces voor differentiatie in volwassen osteoclasten. De inductie van osteoclastogenesis verhoogt bot resorptie. Een groot aantal in vivo studies verbeterd ons begrip van bot metastase vorming^9,10,11aanzienlijk. Borstkankercellen van de primaire tumor en in het bot communicatie erover bot homeostase, bevordering van osteoclastogenesis en bot resorptie⁸. In dit scenario zijn alle de moleculaire interacties die tussen kankercellen en osteoclasten plaatsvinden van cruciaal belang. Zoals reeds vermeld, heeft het mechanisme van metastase biomineralisatie in in vivo muizen modellen zijn opgehelderd. Naast de noodzaak voor de goedkeuring van alle in vivo dierproeven door de ethische commissie zijn er echter verscheidene andere nadelen aan het uitvoeren van in vivo experimenten met inbegrip van hoge kosten en tijdrovende methoden. Verschillende auteurs hebben gecombineerd preklinische in vivo en in vitro modellen van osteoclastogenesis met behulp van een lymfkliertest lijn van pre osteoclasten genaamd RAW246.7^9,10,11. De nadelen van dit model vloeien voort uit het feit dat de cellen zich al aan het worden pre osteoclasten en niet van menselijke oorsprong. Om deze redenen kon translationeel onderzoek sterk profiteren van de beschikbaarheid van in vitro volledig menselijk preklinische modellen om te studeren bot kanker cel interacties.

We een methode van osteoclastogenesis in vitro vanaf perifere bloed monsters^12,13geoptimaliseerd. Osteoclasten ontlenen monocyten, die zijn aanwezig, zij het in een kleine graad, in perifeer bloedmonsters. Mononucleaire cellen worden eerst gescheiden van de erytrocyten en granulocyten in het bloed aanwezig door densiteitgradiënt dichtheid verloop; ze worden dan geselecteerd dankzij hun vermogen zich te houden aan het plastic substraat, in tegenstelling tot lymfocyten. Na het zaaien, de cellen worden gekweekt voor 14 dagen. MCSF en RANKL zijn de GFs door monocyten moeten eerst onderscheiden in macrofagen en vervolgens in de osteoclasten^14,15. MCSF is nodig voor de gehele duur van de test, terwijl RANKL wordt gebruikt voor het opwekken van het proces van differentiatie in de late stadia van osteoclastogenesis. In de vroege fase van differentiatie helpt MCSF monocyten vermenigvuldigen en het overleven van^14,15. Tijdens het tweede deel van osteoclastogenesis, cellen samensmelten en volwassen als osteoclasten, waarin de karakteristieke verdeling van actine F in ringen en het uiten van specifieke markers zoals tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) en calcitonine receptor (CTR) ^{14 , 15}. onze methode bestaat uit het toevoegen van MCSF aan de monocyt cultuur voor de eerste 7 dagen van het experiment en een combinatie van MCSF en RANKL van 7 tot 14 dagen. Aan het einde van het experiment, wordt osteoclastogenesis geanalyseerd door het tellen van de gedifferentieerde cellen, zoals hieronder beschreven.

De culturen van de monocyt aangezet te onderscheiden door de GFs vormen de basis van ons preklinische model. We geoptimaliseerd een co cultuur systeem zonder GFs om de osteoclastogenic kracht van borstkankercellen beter te begrijpen. We een model van indirecte co culturen voor het eerst ontwikkeld door het toevoegen van een medium (80% α-minimaal essentiële Medium (α-MEM) en 20% geconditioneerd medium verzameld van een cultuur van borstkankercellen dat waren ongeveer 90% heuvels naar cellen ondergaan differentiatie¹² . Het geconditioneerde medium (niet verzameld onder serum ontbering voorwaarden) werd verzameld na 24 uur en gemengd met verse medium bij een verhouding van 1:4. Het geconditioneerde medium veroorzaakte significante osteoclast differentiatie ten opzichte van de negatieve controle. Echter verbeterd wij zoals ik de informatie over de wederzijdse interactie tussen kankercellen en bot cellen verloren is gegaan bij het gebruik van indirecte co culturen, onze systeem door het uitvoeren van directe co culturen. We zaadjes kankercellen in 0.4 µM wordt ingevoegd en plaatste ze in putten waar mononucleaire cellen werden verguld. Met behulp van deze methode, cellen delen hetzelfde medium en wisselen secreted eiwitten. We dus een volledig mens preklinische model van osteoclastogenesis die zijn geïnduceerd door kanker cellen¹³gemaakt.

Dit systeem is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeldin farmacologische studies onderzoeken de rol van drugs in bot metastase. Ons model maakt het mogelijk om het onderzoek naar de werkzaamheid en de mechanismen van de actie van bot-gerichte therapieën en/of antitumorale geneesmiddelen in de communicatie van de bot in het bijzijn van kanker cellen¹³. U ontwerpt de experimenten met de juiste besturingselementen, gemakkelijker d.w.z., kankercellen en osteoclasten gekweekte individueel, te begrijpen de impact van de co-cultuur op drug activiteit. Deze aanpak wordt nog interessanter wanneer de drug bestudeerd richt zich op zowel kanker cellen en osteoclasten, bijvoorbeeldeverolimus¹⁶is. Dit model kan ook worden gebruikt ter identificatie van nieuwe trajecten van interactie tussen kankercellen en bot cellen.

Protocol

menselijke osteoclasten van PBMCs van gezonde donoren die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie werden onderscheiden. Het studie-protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie, volgens de ethische normen vastgelegd in de verklaring van Helsinki van 1964.

1. osteoclast differentiatie

Opmerking: perifeer bloed of buffy coats van gezonde menselijke donoren in EDTA verzamelen. Gebruik niet minder dan 20 mL perifeer bloed. Buffy coats zijn beter omdat ze een grotere overvloed van mononucleaire cellen hebben. Alle van de volgende stappen uitvoeren in de kap van een steriele weefselkweek.

1. Verdun EDTA bloed 1:1 met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Resuspendeer goed.
2. Laag op lymfocyt scheiding media (bloed PBS: lymfocyt scheiding media, 2:1) in 50 mL tubes.
   1. Pipetteer 30 mL van bloed verdund in PBS in een tube van 50 mL.
   2. Ondertapijt zachtjes 15 mL lymfocyt scheiding media in de onderkant van de buis van 50 mL.
3. Centrifuge op 757 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (geen remmen).
4. Verzamelen de mononucleaire cellen:
   1. de witte laag van mononucleaire cellen met een 5 mL-pipet verzamelen zonder schudden en breng dit in een nieuwe tube van 50 mL.
   2. De verzamelde PBMCs met 20 mL PBS verdunnen.
5. De PBMCs wassen:
   1. Centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis. Eenmaal herhaald.
6. Lysis van de RBC:
   Opmerking: als de cel pellet rood is, cellen te behandelen met rode bloedcellen lysing van bufferoplossing (Zie Tabel van materialen).
   1. Zet de tube 50 mL op ice.
   2. Voeg toe 5 mL rode bloedcellen lysing van buffer.
   3. Wacht 3-5 min om te voltooien de lysis van de erytrocyt. De tijd varieert afhankelijk van de mate van verontreiniging van de erytrocyt.
   4. Zet de reactie stop door toevoegen van 20 mL PBS.
   5. Centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis.
      Opmerking: Optioneel: als de lysis van de RBC wordt uitgevoerd, de PBMCs wassen zoals hieronder beschreven.
7. Wash PBMCs:
   1. Voeg toe 20 mL PBS en centrifuge bij 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis.
8. Resuspendeer de cellen in volledige α-MEM (aangevuld met 1% glutamine (beginconcentratie 100 X) en 10% foetale runderserum).
9. Rekenen de cellen met een Neubauer-kamer.
   1. Verdunnen van het monster 1:100 in ijsazijn en cellen tellen met 10 µL van de verdunning.
   2. Ten minste tweemaal tellen en berekent het gemiddelde van replicaat-organismen om het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde.
10. Plaat cellen:
    1. plaat cellen bij een concentratie van 750.000 PBMCs per cm ².
    2. Vergulde cellen opslaan in een incubator bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO ₂.
       Opmerking: Ontwerp het experiment wilt opnemen van de negatieve controles, waaraan de cellen die zijn behandeld met normale volledige α-MEM zonder MCSF of RANKL GFs. Vergeet niet om uit te voeren elke voorwaarde in ten minste 3 technische repliceert. Uitvoeren van ten minste 3 biologische replicatieonderzoeken.
11. Het medium aangevuld met GFs wijzigen:
    1. ongeveer 3 uur wachten na het zaaien van de cel en verwijder het medium Pipetteer (200-1000 µL) verwijderen van puin en losse cellen erytrocyten.
       Opmerking: Wees voorzichtig met het wijzigen van het medium om te voorkomen mobiele-detachement.
    2. Toevoegen nieuwe volledige α-MEM aangevuld met 20 ng/mL MCSF (500 µL per putje).
       Opmerking: Wanneer mede kweken met kankercellen, zaad de kanker cellen de dag na het zaaien van de PBMC.
12. De media veranderen elke 2-3 dagen (α-MEM aangevuld met 20 ng/mL van MCSF):
    1. verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.
    2. Toevoegen nieuwe verse medium een 200-1000 µL Pipetteer.
13. 6-7 dagen na de cel zaaien, Voeg 20 ng/mL van RANKL aan volledige α-MEM + MCSF.
14. Wijzigen van het medium (volledige α-MEM + MCSF + RANKL) elke 2-3 dagen:
    1. verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.
    2. Toevoegen nieuwe medium met een 200-1000 µL pipet. Stoppen met inductie van differentiatie 14 dagen na het zaaien van de cel.
    3. Discard medium en wassen tweemaal met PBS.
15. Herstellen van cellen met paraformaldehyde:
    1. cellen te drogen.
    2. 4% paraformaldehyde toevoegen (Zie Tabel of Materials).
    3. Gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur Incubate.
16. Negeren paraformaldehyde en spoel tweemaal met 500 µL van PBS.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig; Gelieve het dragen van handschoenen, masker en brillen.
17. Cellen te drogen toestaan.
18. Uitvoeren TRAP kleuring volgens de fabrikant ' s instructies (Zie Tabel of Materials).
19. Tellen osteoclast-achtige cellen handmatig onder de Microscoop op vergroting 10 X; NB 0,30.
    Opmerking: Osteoclast-achtige cellen zijn gedefinieerd als TRAP + polycarion cellen met minstens 4 kernen.

2. Kanker celculturen

Opmerking: de experimenten kunnen worden uitgevoerd met verschillende soorten borst adenocarcinoom cellijnen zoals SCP2 ¹⁷, een osteotropic-cellijn afkomstig uit de triple negatieve mens borst kanker cellijn (MDA-MB-231) en de hormonale receptor-positieve cellijn MCF7.

1. Cultuur de cellen als een enkelgelaagde in 75 cm ² kolven.
   1. Zaad 1.000.000 kankercellen in een maatkolf van 75 cm ².
   2. Slaan de cellen bij 37 ° C in de volledige α-MEM medium aangevuld met 1% glutamine en 10% foetale runderserum in een sfeer van 5% CO ₂.
2. Losmaken van de cellen in een confluentie van ongeveer 90%:
   1. verwijderen van het medium, wassen met PBS en voeg 2-3 mL trypsine 1 X in PBS.
   2. Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
   3. De vrijstaande cellen ophalen in de kolf van 75 cm ² door een 10 mL Pipet, 8 mL volledige voedingsbodem om te stoppen met de enzymatische reactie toevoegen.
   4. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min.
3. Wassen van de kankercellen:
   1. Voeg toe 10 mL PBS.
   2. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min.
4. Kankercellen met een kamer Neubauer tellen.
   1. Ten minste tweemaal kankercellen tellen en berekent het gemiddelde van replicaat-organismen om het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde.

3. Directe co culturen van kankercellen een nd monocyten ondergaan differentiatie naar osteoclasten

1. zaad van de kankercellen op inserts (porie diameter 0,4 µm):
   1. zaad van de kankercellen bij een concentratie van 4.000 cellen per cm ².
   2. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO ₂.
      Opmerking: Zaad de kanker cellen overmorgen PBMC zaaien voor de co cultuur experiment in 0.4 µm inzetstukken.
2. Wacht 24 uur om de cellen te houden.
3. Plaats de geplaatste invoegen cultuur over de mononucleaire culturen om te beginnen de co cultuur (zie punt 1.10 van het protocol).
4. Veranderen de media elke 2-3 dagen met volledige α-MEM.
   1. Verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.
   2. Voeg toe 500 µL van verse medium.
      Opmerking: Het hoofddoel van de co cultuur is te begrijpen van de kracht van de osteoclastogenic van kankercellen, daarom de GFs worden niet toegevoegd aan α-MEM. In elk experiment van co cultuur, omvatten negative controles (zienoot in stap 1.10 van het protocol) en positieve controles van osteoclasten onderscheiden zich door RANKL en MCSF (geen kankercellen). Kankercellen zaadjes in de inserts niet geplaatst over mononucleaire cellen worden gebruikt als een negatieve controle van de co cultuur.
5. Stop de co cultuur en gebruik van kankercellen downstream p.a.:
   1. 13 dagen na PBMC zaaien en 12 dagen na kanker cel zaaien, plaats de invoegen op een nieuwe plaat.
   2. Stoppen met de cultuur van de cel kanker op basis waarvan downstream analyses worden uitgevoerd moeten (Zie discussie).
6. Op dag 14, stoppen osteoclast differentiatie en monteren van cellen, zoals gemeld in stap 1.15.
7. Uitvoeren TRAP kleuring onmiddellijk of binnen 14 tot 30 dagen.
   Opmerking: Optionele kleuring: om te bevestigen dat de TRAP + polycarion cellen osteoclasten zijn, onderzoekers kunnen uitvoeren extra kleuring voor het detecteren van CTR, een osteoclast-specifieke marker. De detectie van F-actine ringen is een ander osteoclast-specifieke kleuring assay ^{12 , 13 , 14}.

Resultaten

Een methode is geoptimaliseerd zodat u kunt gemakkelijk onderscheiden van osteoclasten uit menselijk bloed van perifere monocyten. De monocyt-cultuur werd gekweekt met kankercellen, (zoals beschreven in de literatuur¹⁸) bevestigt dat kankercellen geschikt zijn voor het behoud van osteoclastogenesis in de botmetastasen. Osteoclasten van kankercellen onderscheiden en GFs zijn afgebeeld in Figuur 1. Een osteoclast-achtige-cel is een cel m...

Discussie

Preklinische in vitro modellen bestuderen van de mechanismen van Overspraak tussen kankercellen en bot cellen zijn nodig om het identificeren van de mechanismen van bot metastase, die kan worden gebruikt voor het maken van nieuwe therapeutische strategieën. We ontwikkelden een model volledig mens in vitro van osteoclastogenesis uit menselijk perifere bloed (Figuur 3). Tijdens de optimalisatie van de methodologie, werden een aantal kritische punten geïdentificeerd en opgelos...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
αMEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamine	Life-technologies	ECB3000D
Fetal bovine serum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Opslagindicaties moeten worden gerespecteerd
hRANKL	Peprotech	310-01	Opslagindicaties moeten worden gerespecteerd
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma Aldrich	387 A
Lymphocyte separation media	Biowest	L0560-100
Red Blood cell lysing buffer	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 cell line	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Deze inserts zijn voor 24-well platen; 6.5 mm, 0.4 μM; poriegrootte