Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Summary

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Abstract

N-nitrosaminen zijn een gevestigde groep van milieu kankerverwekkende stoffen, waarvoor cytochroom P450 oxidatie activiteit vertonen. De aanvaarde mechanisme van metabole activering omvat vorming van α-hydroxynitrosamines die spontaan aan DNA alkylerend agentia ontleden. Accumulatie van DNA-beschadiging en de resulterende mutaties kan uiteindelijk leiden tot kanker. Nieuw bewijs geeft aan dat α-hydroxynitrosamines kan worden verder geoxideerd tot nitrosamides processively door cytochroom P450s. Omdat nitrosamides over het algemeen stabieler dan α-hydroxynitrosamines zijn en kan ook DNA alkylate, kan nitrosamides een rol spelen in carcinogenese. In dit verslag beschrijven we een algemeen protocol voor de evaluatie van de nitrosamide productie van in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen. Dit protocol maakt gebruik van een algemene aanpak van de synthese van de relevante nitrosamides en een in vitro cytochroom P450 metabolisme bepaling met behulp van vloeibare chromatografie-nanospray ionisatie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie voor de detectie. Deze methode ontdekt N′- nitrosonorcotinine als een minder belangrijke metaboliet van N′- nitrosonornicotine in de voorbeeld-studie. De methode heeft hoge gevoeligheid en selectief moeten nauwkeurige detectie van de massa. Toepassing van deze methode op een breed scala aan nitrosamine-cytochroom P450 systemen zal medebepalend zijn voor de algemene strekking van deze transformatie. Omdat cytochroom P450s polymorf zijn en in activiteit variëren, zou een beter begrip van de vorming van de nitrosamide helpen bij het individuele kanker risico-evaluatie.

Introduction

N-nitrosaminen vormen een grote klasse van kankerverwekkende stoffen gevonden in het dieet, tabaksproducten en het algemene klimaat; ze kunnen ook endogeen worden gevormd in het menselijk lichaam¹. Meer dan 300 N -nitroso verbindingen zijn getest en > 90% werden geëvalueerd als kankerverwekkend in diermodellen^2,3. Om te exposeren hun carcinogeniteit, moeten deze verbindingen eerst worden geactiveerd door cytochroom P450s^1,2,3. Onderzoek toont aan dat cytochroom P450s gemak....

Protocol

1. materialen en algemene procedures

1. Synthesize NNN ¹⁵ zoals hiervoor is beschreven. Verkrijgen van norcotinine, P450 2A6 Baculosomes NADPH regeneratie systeem, 0.5 x reactie buffer en alle andere chemicaliën of oplosmiddelen uit commerciële bronnen in het reagens rang.
2. Record NMR spectra op een 500 MHz spectrometer. Verslag chemische verschuivingen als delen per miljoen (ppm). Gebruik van residuele oplosmiddelen pieken als interne verwijzingen voor ¹ H-NMR (7.26 ppm CDCl ₃) en ¹³ C-NMR (77,2 ppm CDCl ₃).
   Opmerking: Peak splitsen de volgende afkortingen gebruikt: s singlet....

Results

Gebaseerd op het werk van witte et al. ¹⁹, norcotinine was nitrosoderivaten aan NNC netjes en in hoog rendement (80-92%) tot een standaard voor het experiment in vitro . Structurele bewijs voor een succesvolle reactie was verkregen van spectroscopische analyses, met inbegrip van ¹H-NMR, ¹³C-NMR, GEZELLIGE en HSQC (ondersteunende informatie) samen met HRMS die bevestigd de bovenliggende massa [M + H]⁺ binnen 5 ppm v.......

Discussion

Ophelderen van het metabolisme van nitrosaminen is een essentieel onderdeel voor het begrip van hun carcinogeniteit. Aangezien de betrokken cytochroom P450s en andere metabole enzymen polymorf zijn, verder is toepassing van deze kennis kon potentieel identificeren hoog risico personen^1,4. Nieuwe data geeft aan dat verdere oxidatie van α-hydroxynitrosamines, de vermoedelijke belangrijkste metabolieten van nitrosaminen betrokken in het DNA binden, nitrosamides is m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Norcotinine	AKoS GmbH (Steinen, Germany)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	242845
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	431311
Barium Hydroxide	Sigma-Aldrich	433373
D-Chloroform	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	34856
Sodium Nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit	Life Technologies	PV6140
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	221376
0.5 mL tubes	Fisher	AB0533
100 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z510424
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS4980125
125 mL Separatory Funnel	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman-Coulter
LC vials	ChromTech	CTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Magnetic Stir bar	Sigma-Aldrich	Z127035
NMR tube	Sigma-Aldrich	Z274682
P1000, P200, and P10 pipettes	Eppendorf
Rotary evaporator	Sigma-Aldrich	Z691410
RSLCnano UPLC system	Thermo Scientific
Shaking Water Bath	Fisher	FSSWB15
Stir plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit Column	New Objective	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1