Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Samenvatting

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Samenvatting

N-nitrosaminen zijn een gevestigde groep van milieu kankerverwekkende stoffen, waarvoor cytochroom P450 oxidatie activiteit vertonen. De aanvaarde mechanisme van metabole activering omvat vorming van α-hydroxynitrosamines die spontaan aan DNA alkylerend agentia ontleden. Accumulatie van DNA-beschadiging en de resulterende mutaties kan uiteindelijk leiden tot kanker. Nieuw bewijs geeft aan dat α-hydroxynitrosamines kan worden verder geoxideerd tot nitrosamides processively door cytochroom P450s. Omdat nitrosamides over het algemeen stabieler dan α-hydroxynitrosamines zijn en kan ook DNA alkylate, kan nitrosamides een rol spelen in carcinogenese. In dit verslag beschrijven we een algemeen protocol voor de evaluatie van de nitrosamide productie van in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen. Dit protocol maakt gebruik van een algemene aanpak van de synthese van de relevante nitrosamides en een in vitro cytochroom P450 metabolisme bepaling met behulp van vloeibare chromatografie-nanospray ionisatie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie voor de detectie. Deze methode ontdekt N′- nitrosonorcotinine als een minder belangrijke metaboliet van N′- nitrosonornicotine in de voorbeeld-studie. De methode heeft hoge gevoeligheid en selectief moeten nauwkeurige detectie van de massa. Toepassing van deze methode op een breed scala aan nitrosamine-cytochroom P450 systemen zal medebepalend zijn voor de algemene strekking van deze transformatie. Omdat cytochroom P450s polymorf zijn en in activiteit variëren, zou een beter begrip van de vorming van de nitrosamide helpen bij het individuele kanker risico-evaluatie.

Inleiding

N-nitrosaminen vormen een grote klasse van kankerverwekkende stoffen gevonden in het dieet, tabaksproducten en het algemene klimaat; ze kunnen ook endogeen worden gevormd in het menselijk lichaam¹. Meer dan 300 N -nitroso verbindingen zijn getest en > 90% werden geëvalueerd als kankerverwekkend in diermodellen^2,3. Om te exposeren hun carcinogeniteit, moeten deze verbindingen eerst worden geactiveerd door cytochroom P450s^1,2,3. Onderzoek toont aan dat cytochroom P450s gemakkelijk oxideren nitrosaminen naar α-hydroxynitrosamines (Figuur 1), die zeer reactieve verbindingen met half-leven van ~ 5 zijn s voordat spontaan ontbindend te alkyldiazohydroxides. De laatste kan DNA na het verlies van H₂O en N₂alkylate. De resulterende DNA adducten, als herstelde, mutaties, die als kritische onco- of tumor suppressor genen, tot kanker ontwikkeling^{1 leiden}kunnen veroorzaken. Om deze reden veel moeite heeft zijn uitgegeven om het verwerven van een volledig begrip van de metabole routes, DNA adducten, en stroomafwaarts metabolieten van cytochroom P450 oxidatie van kankerverwekkende nitrosaminen. Deze kennis heeft potentiële toepassing in individuele kanker risico beoordeling⁴.

Figuur 1: Algemeen en voorgestelde metabolisme van nitrosaminen.
Nitrosaminen (1) zijn geoxideerd door P450s tot α-hydroxynitrosamines (2) die spontaan tot alkyldiazohydroxides (3 ontleden). Deze verbindingen kunnen binden aan DNA aan formulier die DNA adducten. Het is veronderstelde dat 2 zijn verder geoxideerd door P450s tot nitrosamides 4. Deze kunnen direct binden aan DNA aan formulier nieuwe DNA adducten of worden gehydrolyseerd tot 3 aan formulier die bekende DNA adducten. R₁ en R₂ vertegenwoordigen een alkyl-groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Hoewel de α-hydroxynitrosamine hypothese is stevig ondersteund door uitgebreide gegevens, zijn er enkele tegenstrijdigheden; een groot probleem is de korte halfwaardetijd van α-hydroxynitrosamines^5,6. Het is bekend dat deze stoffen worden geproduceerd op het membraan van het endoplasmatisch reticulum en later nucleaire DNA alkylate. Gezien hun leven voor een paar seconden, is het puzzelen hoe deze tussenproducten overleven de vereiste reizen al het cytosol. Een hypothese is dat een deel van de α-hydroxynitrosamines processively zijn geoxideerd tot nitrosamides^7,8, die zijn vrij stabiel in vergelijking⁹. Dit gebeurt vermoedelijk via retentie van α-hydroxynitrosamines in de cytochroom P450 actieve site. Precedent voor dit soort oxidatie gesignaleerd met nicotine¹⁰, alcoholen¹¹en eenvoudige alkylnitrosamines^12,13. Daarnaast zijn de nitrosamides direct-acting kankerverwekkende stoffen^2,3. Op basis van hun reactiviteit⁹, worden deze verbindingen verondersteld tot DNA adducten identiek zijn aan die welke voortvloeien uit α-hydroxynitrosamines samen met nieuw, onontgonnen DNA adducten (Figuur 1). Dus deze hypothese verklaart niet alleen het vervoer via het cytosol, maar ook de vorming van DNA schade aan producten.

In deze paper wordt een algemeen protocol voor de beoordeling van het in vitro cytochroom P450-gemedieerde conversie van nitrosaminen naar nitrosamides beschreven. De eerder gerapporteerde conversie van N′- nitrosonornicotine (NNN) naar N′- nitrosonorcotinine (NNC) door cytochroom P450 2A6 is tentoongesteld als een voorbeeld¹⁴. Toepassing van dit protocol tot een brede waaier van substraat-enzym systemen zal medebepalend zijn voor het belang van nitrosamides in algemene nitrosamine metabolisme.

Protocol

1. materialen en algemene procedures

1. Synthesize NNN ¹⁵ zoals hiervoor is beschreven. Verkrijgen van norcotinine, P450 2A6 Baculosomes NADPH regeneratie systeem, 0.5 x reactie buffer en alle andere chemicaliën of oplosmiddelen uit commerciële bronnen in het reagens rang.
2. Record NMR spectra op een 500 MHz spectrometer. Verslag chemische verschuivingen als delen per miljoen (ppm). Gebruik van residuele oplosmiddelen pieken als interne verwijzingen voor ¹ H-NMR (7.26 ppm CDCl ₃) en ¹³ C-NMR (77,2 ppm CDCl ₃).
   Opmerking: Peak splitsen de volgende afkortingen gebruikt: s singlet, d = doublet, dd = = doublet van paren, dt = doublet van de drieling, dq = doublet van kwartetten, ddd = doublet van doublet van paren en m = multiplet.
3. Hoge resolutie massa spectrometrie (HRMS) uitvoeren voor de geselecteerde verbindingen op een LTQ Orbitrap Velos en rapportgegevens als m/z.
4. Gebruik polygram vooraf gecoat silicagel TLC platen (40 mm x 80 mm, 0.2 mm dik) met 254 nm fluorescerende indicator voor dunne-laag chromatografie (TLC). Visualiseren van TLC platen door UV lamp bestraling.
5. Flash chromatografie uitvoeren op een 60 Å, 70-150 mesh silica gel met behulp van een glazen kolom van 1,5 cm x 15 cm.

2. Voorbereiding van de positieve controle nitrosamide (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)

1. droge, in een oven's nachts (16 h, ~ 140 ° C), een 25 mL, Rondbodemkolf met een magnetische roer bar. In de ochtend, cool de kolf onder een stroom van N ₂ terwijl het gebruiken van een waterpijp olie te houden van de N ₂ stroom stem onder een zeepbel per seconde.
   Let op: Na afkoeling geen voorzorgsmaatregelen te houden van de erlenmeyer onder N ₂ zijn verplicht.
2. In een zuurkast, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), azijnzuur-anhydride (5 mL) en azijnzuur (1 mL) toevoegen aan de afgekoelde maatkolf. Roer dit mengsel continu onder afkoeling tot 0 ° C met een water-ijsbad.
   Let op: Azijnzuur-anhydride en azijnzuur zijn bijtende.
3. Toevoegen NaNO ₂ (33.3 mg, 0.483 mmol) in één gedeelte en continu roer het mengsel voor 2.5 h. reactie voortgang door TLC (100% EtOAc, R _f = 0,19, zie stap 1.4).
   Opmerking: Gedurende deze tijd, het mengsel zal worden steeds geel met af en toe borrelt.
4. Quench de reactie door het gieten van het mengsel in ijskoude H ₂ O (18 mL). Onmiddellijk pak de waterige oplossing met 18 mL CH ₂ Cl ₂ in een 100 mL separatory trechter. Pak de waterige laag ten minste 2 extra keer met CH ₂ Cl ₂ (9 mL elk).
5. De gepoolde organics meer dan ~ 100 mg MgSO ₄ voor 2 min. Filter droog en het concentreren van de oplossing door roterende verdamping een ruwe, gele olie opleveren. Verwarm het waterbad tot 30 ° C tijdens verdamping te verwijderen van de resterende azijnzuur.
   Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier als de stof wordt opgelost in CH ₂ Cl ₂ en de oplossing die is opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C.
6. Zuiveren de ruwe compound door kolom-chromatografie (zie stap 1.5) met behulp van silica gel als de stationaire fase en 100% EtOAc als het eluens ¹⁶.
   Let op: NNC en verwante nitrosamides moet voorzichtig behandeld worden als ze wordt aangenomen dat menselijke carcinogenen.
7. Los van de pure stof in CDCl ₃ en gebruiken van NMR (zie stap 1.2) om te bevestigen de structuur en de molarity van deze oplossing ¹⁷ bepalen. Bewaar deze oplossing in het donker bij 2-8 ° C totdat nodig.
   Opmerking: Deze oplossing zal worden gebruikt als positieve controle in de in vitro assay (stap 3.5). NMR spectra en chemische shifts zijn beschikbaar in de ondersteunende informatie.
8. Met een zuivere oplossing van de NNC, bevestigen de nauwkeurige parent massa en product ion massa bepalen door directe infusie op een hoge resolutie massaspectrometer (HRMS) onder parameters beschreven in stap 1.3 en 4.3.
   Opmerking: Massa van het Product zal worden gebruikt voor het opsporen van dit samengestelde in de in vitro metabolisme assay (stap 4.3).

3. Een voorbeeld nitrosamine-P450 in vitro incubatie

1. P450 2A6 Baculosomes, Vivid-NADPH-regeneratie systeem en 10 mM NADP ⁺ Stock oplossing verwijderen uit een vriezer-80 ° C en laat ze ontdooien op ijs. Eenmaal ontdooid, Verdun de Baculosomes en NADPH-regeneratie systeem 1:10 en 1:50, respectievelijk, in een enkele 1 mL-buis met 0,5 X reactie Buffer. Op dezelfde manier toevoegen 3 μL van de NADP ⁺ Stock oplossing aan 97 μL van 0,5 X reactie Buffer.
   Opmerking: NADP ⁺ is lichtgevoelig. Bewaar deze oplossing beschermd door de container te wikkelen in aluminiumfolie. Enzym oplossingen zijn gevoelig voor bevriezen-ontdooien cycli; dit te beperken tot niet meer dan 2 cycli. Bereiden aliquots als nodig is voor toekomstige experimenten.
2. Voor elke incubatie, voeg 50 μl van enzym-oplossing (met 5 pmol P450) tot een 1 mL tube met 40 μL van 4 μM NNN oplossing gemaakt met reactie Buffer. Vooraf Incubeer dit nieuwe mengsel gedurende 2 minuten bij 37 ° C met behulp van een waterbad en voeg vervolgens 10 μL van verdunde NADP ⁺-oplossing. Incubeer het volledige systeem voor 1-30 min op 37 ° C.
   Opmerking: Het gebruik van 5-min intervallen voor incubatie keer (bijvoorbeeld 5, 10, 15 min, etc.) zorgt voor een voldoende nitrosamide formatie tijdsverloop.
3. Na de gewenste incubatietijd, doven door eerste toevoegen 10 μl van 3.0 N ZnSO ₄ en vervolgens 10 μL van 3.0 N Ba(OH) _2. Vortex deze oplossing en een witte neerslag zal vormen. Centrifugeer het monster bij 8000 x g voor 4 min aan de neerslag pellet.
   Opmerking: De procedure moet niet onderbreken bij deze stap als de gevormde nitrosamides hebben beperkte stabiliteit in waterige oplossingen. Lange pauzes kunnen leiden tot valse negatieven.
4. Onmiddellijk Pipetteer het supernatant en 2 μL analyseren door vloeistofchromatografie positieve nanoelectrospray-ionisatie high-resolution tandem massaspectrometrie (LC-NSI ⁺-HRMS/MS, stappen 4.1-4.3).
5. Voor positieve controle incubations, verdampen een aliquoot gedeelte met 100 fmol van gesynthetiseerde NNC-oplossing in een buis 1 mL onder een stroom van N-₂. Deze injectieflacon, de volledige enzymsysteem uit stap 3.2 toevoegen en ga verder zoals beschreven voor stappen 3.3-3.4.
6. Voor de negatieve controle incubations, uitvoeren van het experiment beschreven (stap 3.2-3.4) behalve vervangen de 50 μl enzym oplossing met 0,5 X reactie buffer.

4. Voorbeeld van de parameters voor de detectie van de nitrosamide door LC-NSI ⁺-HRMS/MS

1. voor de LC-component, de volgende scriptingregel verloop in stap 4.2 toepassen op een systeem van de UPLC met behulp van een commerciële, hand boordevol ¹⁸ C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm opening capillaire kolom.
2. Met behulp van 5 mM, NH ₄ OAc als oplosmiddel A en acetonitril als oplosmiddel B, laadt het monster op de kolom door op 5% B op 1 l/min van 0 - 5 min en dan vertraagt het debiet aan 0,3 μl/min daarna. Voer vervolgens een verloop van 5 tot 20% B meer dan 4 min, gevolgd door een oprit naar 55% B meer dan 10 min, en vervolgens opnieuw evenwichtsinstelling tot 5% B.
3. Voeren de LC-NSI ⁺-HRMS/MS op een LTQ Orbitrap. Monitor voor NNC door zowel volledige scan en MS ² fragmentatie. Volledige scannen bij een resolutie van 60.000 en haal de nauwkeurige bovenliggende massa (192.07670) op een massale tolerantie van 5 ppm. Gebruik MS ² fragmentatie te isoleren van bovenliggende ionen (2.0 amu) en de fragment door botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) met de energie van een botsing van 25 eV, resolutie van 15.000, en scan tijd van 30 ms. Extract de nauwkeurige massa's voor product ionen van NNC (m/z 192 m/z 134.04739 en 162.07874) bij een massale tolerantie van 5 ppm.

Resultaten

Gebaseerd op het werk van witte et al. ¹⁹, norcotinine was nitrosoderivaten aan NNC netjes en in hoog rendement (80-92%) tot een standaard voor het experiment in vitro . Structurele bewijs voor een succesvolle reactie was verkregen van spectroscopische analyses, met inbegrip van ¹H-NMR, ¹³C-NMR, GEZELLIGE en HSQC (ondersteunende informatie) samen met HRMS die bevestigd de bovenliggende massa [M + H]⁺ binnen 5 ppm v...

Discussie

Ophelderen van het metabolisme van nitrosaminen is een essentieel onderdeel voor het begrip van hun carcinogeniteit. Aangezien de betrokken cytochroom P450s en andere metabole enzymen polymorf zijn, verder is toepassing van deze kennis kon potentieel identificeren hoog risico personen^1,4. Nieuwe data geeft aan dat verdere oxidatie van α-hydroxynitrosamines, de vermoedelijke belangrijkste metabolieten van nitrosaminen betrokken in het DNA binden, nitrosamides is m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Norcotinine	AKoS GmbH (Steinen, Germany)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Azijnzuur	Sigma-Aldrich	695092
Azijnzuuranhydride	Sigma-Aldrich	242845
Ammoniumacetaat	Sigma-Aldrich	431311
Bariumhydroxide	Sigma-Aldrich	433373
D-Chloroform	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitril	Sigma-Aldrich	34998
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M7506
Methyleenchloride	Sigma-Aldrich	34856
Natriumnitriet	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit	Life Technologies	PV6140
Zinksulfaat	Sigma-Aldrich	221376
0,5 mL buizen	Fisher	AB0533
100 mL ronde bodemfles	Sigma-Aldrich	Z510424
125 mL Erlenmeyer kolf	Sigma-Aldrich	CLS4980125
125 mL Scheider	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL ronde bodemfles	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman-Coulter
LC vials	ChromTech	CTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Magneet roerstaaf	Sigma-Aldrich	Z127035
NMR buis	Sigma-Aldrich	Z274682
P1000, P200 en P10 pipetten	Eppendorf
Roterende verdamper	Sigma-Aldrich	Z691410
RSLCnano UPLC systeem	Thermo Scientific
Schuddende waterbad	Fisher	FSSWB15
Roerplaat	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit Kolom	New Objective	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1