Op lange termijn levende Imaging Device voor verbeterde experimentele manipulatie van zebravis larven

Summary

Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die is een verzuilde apparaat ontworpen bedwingen zebrafish larven te oriënteren. Het ontwerp staat staart transect en op lange termijn collectie van hoge-resolutie fluorescentie microscopie beelden van wondgenezing en regeneratie.

Abstract

De larve van de zebravis is een belangrijk model-organisme voor zowel ontwikkelingsbiologie en wondgenezing. Verder is de larve van de zebravis een waardevolle systeem voor live hoge resolutie microscopische beeldvorming van dynamische biologische fenomenen in ruimte en tijd met cellulaire resolutie. Echter kan de traditionele methode van agarose inkapseling voor levende imaging belemmeren larvale ontwikkeling en weefsel hergroei. Daarom dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die werd ontworpen en gefabriceerd als een functioneel verzuilde apparaat om te oriënteren larven voor hoge resolutie microscopie voorzien in de mogelijkheid caudal fin transect binnen het apparaat, de latere ongebreidelde staart ontwikkeling en de uitgroei. Dit apparaat voorziet verwonden en op lange termijn beeldvorming met behoud van de levensvatbaarheid. Gezien het feit dat de zWEDGI schimmel is 3D afgedrukt, de aanpasbaarheid van de geometrieën maken het eenvoudig aangepast voor uiteenlopende zebrafish beeldbewerkingstoepassingen. De zWEDGI biedt bovendien dat talloze voordelen, zoals toegang tot de larve tijdens experimenten voor verwonding of voor de toepassing van de reagentia, parallel oriëntatie van meerdere larven voor gestroomlijnde beeldvorming en herbruikbaarheid van het apparaat.

Introduction

Het regeneratieve vermogen van zebravis larven Danio rerio laten een ideale modelorganisme voor behandeling van de wond reactie evenals genezing en hergroei^1,2,3,4. Toegang tot een array van transgene zebrafish lijnen en zebrafish de anatomische transparantie verder verbeteren hun nut voor in vivo studies van wond reactie evenementen evenals langere regeneratieve processen⁴. Studie van deze biologische processen met behulp van hoge-resolutie time-lapse fluorescentie microscopie daarom vraagt om een levende zebrafish beeldapparaat die voor een hoge stabiliteit en minimale bewegingen van de larve van de zebravis zorgt met behoud van de levensvatbaarheid. Het is de sleutel dat het apparaat zorgt voor effectieve verwonden terwijl genezing en regeneratie plaatsvinden niet beïnvloed door het apparaat.

De levende imaging stabilisatie standaardmethode voor het insluiten van de larve in agarose tijdens live imaging beperkt groei en regeneratie⁵ wond en sterftecijfers kan verhogen aangezien larven beginnen te tonen teken van cardiale necrose van de stress en weefsel na vier uur⁴. Daarom, verwijdering van agarose uit regio's van belang is het vaak nodig om normale ontwikkeling en regeneratie⁶, bloot de larven tot potentiële schade als de agarose is weggesneden. Bovendien moet de gebruiker met de agarose techniek te embedding, oriënteren van de larven in de korte tijd voordat de agarose^{5,6,7 stolt}. Snel manipuleren van de larve vergt niet alleen de vaardigheid van de gebruiker, het ook risico's van schade aan de larve. Hoewel methoden te stabiliseren de larve voor levende imaging zijn beschreven om te omzeilen deze nadelen, zoals geribbelde agar wells³ of divets⁸, het gebruik van siliconen vacuüm vet maken een imaging kamer met PVC-buizen of andere materialen⁶, roterende buis⁹, veel van deze methoden zijn arbeid intensieve, rommelig, vaak niet herbruikbaar en niet is toegestaan om milieu te manipuleren (drug behandelingen, verwonding enz.) nadat de vis is gemonteerd.

Daarom werd het zWEDGI apparaat (Figuur 1) ontworpen om overwinnen enkele van de nadelen van agar montage voor lange termijn live beeldvorming van zebravis larven terwijl manipulatie van het monster toelaat. De zWEDGI bestaat uit drie halfopen verzuilde kamers (figuur 1A) toe voor het laden, terughoudendheid, verwonding en beeldvorming van 2 tot 4 dagen na bevruchting zebrafish larven. Het apparaat is vervaardigd uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) en op de slip van de cover van een 60 mm glas onder imaging schotel geplaatst. Het hier gepresenteerde ontwerp was bedoeld voor wond genezing studies, maar het gebruik van een modulair ontwerp en fabricage van standaard technologieën maken het zWEDGI ontwerp halster en vatbaar voor een verscheidenheid van experimentele procedures, met name voor procedures die vereist minimale terughoudendheid met experimentele manipulatie en op lange termijn denkbaar.

Protocol

Opmerking: het base zWEDGI ontwerp werd geformuleerd voor zebrafish larven die 2 tot 4 dagen na bevruchting (dpf) en volg de richtlijnen van de Universiteit van Wisconsin-Madison Research dieren Resource Center.

1. design en 3D printen van schimmels

1. Model de PDMS component van het apparaat met de gewenste geometrieën en kenmerken in een 3D modeling software ⁵. Maak een assemblage van een lege mal en het PDMS deel en het genereren van een negatieve mal voor het PDMS deel door het creëren van een holte in de mal overeenkomt met het deel van de PDSM. Opslaan van de schimmel als een .stl bestand voor afdrukken in 3D ( Figuur 2, stap 1.1).
   Opmerking: Het bestand met een stereolithography-indeling (.stl) van het ontwerp van de schimmel die hier gepresenteerd ( Figuur 1) is beschikbaar voor download op https://morgridge.org/designs/.
2. Print mallen met behulp van een 3D-printer van fotopolymeer ( Figuur 2, stap 1.2). Meerdere mallen maken in een afzonderlijk afdrukbaar, indien mogelijk, dus meer dan één apparaat kan worden gegoten met één enkele batch van PDMS.
   Opmerking: Het voorbeeld werd gedrukt in Hi-Res modus met een 0.075 mm straal diameter en 0,05 mm laagdikte, met behulp van fotopolymeer hars ⁵.
   1. Schone mallen met een fijne borstel, gedenatureerde alcohol in een spray fles, en samengeperste lucht voorzichtig schrobben en het verwijderen van niet uitgehard hars. Een materiaal verwijderen uit de microchannel-gebieden.
   2. Na het genezen van de mallen in een UV post genezen toestellen voor 60 min aan weerskanten als niet-uitgeharde ontslag giftig voor zebrafish larven ^{10 is}.
3. Zand van de kant van de holte van de mal met 200 grit schuurpapier op een vlakke ondergrond totdat alle afdichting oppervlakken in contact met het schuurpapier zijn (laden kanaal geometrieën en schimmel omtrek). Licht zand met 400 en 600 grit zand papier, geleidelijk, voor de productie van gladde flush oppervlakken over alle geometrie voering ( Figuur 2, stap 1.3). Meet de diepte van de holte na het schuren met een externe indicator om te verifiëren dat het ligt dicht bij de ontworpen diepte.
   1. Schoon mallen en betrekking hebben op schijven (1 ¾ inch diameter x ¼ inch dik borosilicaatglas of acryl; één glas dekken per schimmel) door te plaatsen in een ultrasone reiniger gevuld met water gedurende 30 minuten of door te spoelen onder stromend water.
   2. Blazen met perslucht droog en schoon zowel de mallen en dekt met isopropyl alcohol en gefilterde perslucht. Gebruik een schone bankje als een plaats te fabriceren de apparaten om te minimaliseren van verontreiniging van lucht puin. Laat de schoongemaakte mallen en glas dekt in de schone bankje of totdat het nodig is een overdekte petrischaal.

2. PDMS fabricage van zWEDGI apparaat

1. maken het PDMS door gieten 184 silicone-elastomeer Polydimethylsiloxaan (PDMS) bij een verhouding van 5:1 (base aan activator) in een plastic beker. Meng goed gedurende 2 minuten met een houten vaartuig stok, roeren de gel over op zichzelf, zoals kneden brood. Voor 5 mallen, 10 g base en activator 2 g te gebruiken.
   1. Ambtshalve gas mengsel in een vacuüm exsiccator voor 25-45 min totdat alle bubbels verdwenen zijn.
   2. Vullen de holte van elk van de 3D gedrukte mallen met ongeveer 0,75 mL PDMS met behulp van een spuit van 10mL, totdat de mal loopt enigszins over met een meniscus ( Figuur 2, stap 2.1).
   3. De gas de gevulde mallen voor 45 min voor het verwijderen van extra bubbels die kunnen hebben gevormd bij het invullen van.
2. Toepassing van een glas cover schijf bovenop de PDMS gevulde mal, te drukken op de schijf down onder een hoek om te voorkomen dat bubbels worden gevangen ( Figuur 2, stap 2.2). Toestaan van overtollige PDMS te worden uitgezet als de schijf glasdeel wordt toegepast.
3. Gebruik kleine ratchet klem de cover schijf strak vasthouden aan de mal.
   Opmerking: Dit maakt een vlakke ondergrond, zodra de PDMS is genezen en produceert via gaten waar de 3D gedrukte meetkundes flush met de glazen cover slip zijn. U kunt ook het vergroten van het aantal apparaten dat tegelijkertijd kan worden genezen, bouwen een multi klem apparaat (bv. Figuur 2, stap 2.3).
4. Genezen het PDMS apparaat in de geklemd mallen bij 100 ^o C in de oven gedurende 90 minuten ( Figuur 2, stap 2.4). De mallen Verwijder uit oven en laat afkoelen tot ze gemakkelijk kunnen worden behandeld. Als de klemmen apparaat metaal is, verwijderen de schimmel en dekking schijf montage uit de klem om te voorkomen dat het metaal blijven genezen het PDMS als gevolg van restwarmte.
   Opmerking: Het apparaat is het makkelijkst te verwijderen van de schimmel, terwijl nog steeds veel te warm en niet volledig genezen. Echter zodra de mal wordt verwijderd uit de oven en de cover-schijf wordt verwijderd, kan het apparaat zitten voor een paar dagen voordat wij overgaan tot demolding. Als het apparaat is demolded kort na het verwijderen van de uithardende oven, plaatst u deze in een overdekte petrischaal te minimaliseren contaminanten terwijl zodat het volledig genezen.

3. Plasma-bonding zWEDGI aan glazen schotel

1. klem de mal met het PDMS apparaat in een bankschroef bank zodat de schimmel ' s geometrieën staan omhoog, parallel aan de werkbank station.
   1. Start het PDMS apparaat verwijderen door het vrijgeven van het PDMS pull-tabblad uit de mal met behulp van flat-tipped pincet. Werk rond de omtrek van de schimmel met de pincet (zoals het verwijderen van een taart uit een pan ( Figuur 2, stap 3.1)).
   2. Gebruik gefilterd gecomprimeerde lucht en pincet te Trek voorzichtig aan het apparaat uit de mal door vast te houden aan het pull-tabblad en lucht onder het apparaat blazen. Werken langzaam, waardoor de lucht om te helpen het PDMS van de mal aparte, speciale zorg met de uiteinden van het pincet te nemen rond de dunne tunnel secties.
2. Plaats van het PDMS apparaat ondersteboven op de binnenkant van het deksel van een glazen bottomed schotel zodat de beteugeling tunnel segmenten zijn het aanraken van de plastic ( Figuur 2, stap 3.2).
3. Plaats het deksel van de schotel met ondersteboven zWEDGI en de bijbehorende glas bottomed schotel naar een plasma reiniger met de innerlijke glas naar boven gericht ( Figuur 2, stap 3.3).
   1. Evacueren van het plasma kamer schoonmaken totdat de druk 500 mTorr tot.
   2. Set radiofrequentie (RF) macht op hoog. Het apparaat bloot en de schotel op RF frequentie voor ongeveer 2 min. langzaam-het Parlement druk uitoefenen en terugkeren van het apparaat en de schotel naar een cleanroom kap.
4. De PDMS apparaat loskoppelen van de deksel van de schotel. Flipover het PDMS zWEDGI naar de correcte oriëntatie op het glas door het zorgvuldig positionering in het midden goed van de glazen bodem schotel ( Figuur 2, stap 3.4)
   1. met behulp van de back-end van het pincet, licht ingedrukt de PDMS apparaat om luchtbellen zitten niet onder. Toepassing van druk rond de minuut geometrieën van de micro-kanalen en het PDMS gladstrijken met de randen ( figuur 5C).
      Opmerking: Complete contact tussen het PDMS en het glas zorgt voor een betere naleving van plasma hechting. Het zWEDGI-apparaat kan worden gebonden op andere glazen bodem schotel indelingen, zoals een glazen bodem 6-well plat plasmae ( figuur 2C).
   2. Een cover op de schotel apparaat plaatst voordat u uit de cleanroom kap verwijdert.
      Opmerking: Zodra de apparaten zijn opgelost met glas, het protocol kan worden onderbroken totdat ze klaar voor gebruik zijn.

4. Kanaal van voorbereiding en laden larven

Opmerking: generaal zebrafish veeteelt werd uitgevoerd per The Zebrafish boek, beschikbaar online op http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Volwassen zebravis en embryo's werden onderhouden zoals eerder beschreven ¹. De wild type AB stam werd gebruikt. Volg de instelling ’ s Animal Care Protocol voor specifieke informatie over vereisten voor imaging-levende larven.

1. Spoelen de kanalen met een minimum van 100 µL 70% ethanol per kanaal, met behulp van een micropipet te spoelen door de beteugeling van de tunnel. Verwijderen van ethanol en spoel 2 of 3 keer met dubbel gedestilleerd water. Laat lucht droog.
2. Vullen de kanalen met magere melk (bij een concentratie van 1% verdund in water) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tot een minimum beperken van de hechting van de larven naar het glas dekglaasje aan van de schotel. Vervolgens onderdompelen zachtjes het apparaat meerdere keren in dubbel gedestilleerd water te spoelen. Laat lucht droog ondersteboven.
   Opmerking: Protocol kan hier worden gepauzeerd. Deze voorbereiding van zWEDGI apparaat kan verscheidene dagen vóór gebruik worden gedaan. Opslag die wordt behandeld bij kamertemperatuur.
3. Voorbereiden 1% smeltende dieptepunt (LMP) agarose door het combineren van 100 µL 2% gesmolten LMP agarose met 100 µL 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaïne - ethyl 3-aminobenzoaat) in E3 buffer ¹¹ vooraf opgewarmd tot 38 ^o C. handhaven de 1% agarose/tricaïne oplossing bij 38 ^o C in een hete blokkeren om te voorkomen dat gelerend.
   Opmerking: Multiphoton microscopie ¹¹, gebruik voor beide varianten van de un-gepigmenteerde zebrafish (zoals casper ¹²) of handhaven van de larven in E3 met 0,2 mM N-phenylthiourea pigment vorming te voorkomen ¹¹ om te minimaliseren van de absorptie van het nabij infrarode golflengten door het pigment.
   Let op: N-phenylthiourea is toxisch. Volg de instelling ' s regels voor lozing.
4. Verdoving larven in E3 buffer met 0,2 mg/mL tricaïne (tricaïne/E3) ¹¹. Wachten tot larven onbeweeglijk en reactieloos op een aanraking prikkel zijn.
5. Natte vooraf de kanalen met een paar microliters van tricaïne/E3.
   1. Pick up een één larve met behulp van een brede opening pipette uiteinde. Stort de larven in het laden kanaal ( figuur 3A). De larve in de zaal laden met behulp van een pipet tip of een soortgelijke tool, oriënteren, zodanig dat de dorsale zijde geconfronteerd met de rechtere rand van de kamer van de laden en de gezichten van de staart naar de beteugeling tunnel ( figuur 3B).
   2. Trekken zorgvuldig vloeistof uit de verwonding kamer, waardoor de larve stromen naar de beteugeling tunnel ( Figuur 3 c). Allermeest naar de vloeistof verwijderen met behoud van vocht rond de larve ( figuur 3D). Dit proces kan worden bijgestaan door het kantelen van de schotel lichtjes richting de verwonding zaal.
6. 1% LMP agarose plaats in tricaïne/E3 (~ 38 ^o C) over de larve ' s hoofd, vullen de laden kamer ( 3E figuur). Toestaan agarose te stollen met de larve in de juiste positie. Add tricaïne/E3 aan de verwonding kamer moest handhaven hydratatie. Herhaal dit proces voor de resterende 2 kanalen laden.
7. Met behulp van een spuit-naald, verwijder voorzichtig alle agarose die door de matigende tunnel sijpelde in de verwonding kamer ( figuur 3F). Toevoegen van extra tricaïne/E3 ofwel iets meer dan de agarose (voor verwonding, korte termijn imaging of wond behandeling isolatie) of om te vullen de cultuur schotel (voor de weergave van de lange termijn). Vervang het deksel van de schotel cultuur om te voorkomen dat de verdamping. Larven kunnen beeld op dit punt (gewonde) of gewond.

5. Kwetsende en Imaging larven

1. met behulp van een steriel scalpel blad, aarde transect de staartvin posterieure aan de chorda ¹¹ in de verwonding zaal ( Figuur 3 G, H). Voeg extra tricaïne/E3 indien nodig en vervangen van het deksel van de schotel cultuur.
   Opmerking: Als alternatief, afhankelijk van het venster van de ontwikkelings tijd van belang, larven kunnen worden gewond en toegestaan om te herstellen in de E3 en onderhouden in een incubator (28.5 ^o C) totdat de gewenste beeldvorming, waarna ze geladen in kanalen als worden kunnen hierboven beschreven.
2. Het zWEDGI-apparaat met narcose larven op een omgekeerde Microscoop installeren in een stadium invoegen die geschikt is voor de schotel van 60 mm glazen bodem. Zoek de staart van de larve in het meest bovenste kanaal, draaien de schotel zo nodig om de staart in de gewenste positie. Beeld als vereist voor de specifieke experiment.
   Opmerking: De zWEDGI geldt in grote lijnen voor hoge-resolutie de lichte microscopie, met inbegrip van widefield fluorescentie en laser scanning microscopie. Er zijn een aantal overwegingen van de parameter wanneer imaging zebrafish larven, maar specifieke imaging parameters zijn instrument, monster en experiment afhankelijk. Hier, de larvale staart was beeld op een maatwerk multiphoton Microscoop ^{5 , 11} met behulp van de volgende parameters: 40 X lang werkende afstand water onderdompeling doelstelling, 890 nm laser excitatie, 445/20 nm emissie filter en resolutie van 512 x 512.

6. Einde van Experiment

1. verwijderen de zWEDGI schotel van Microscoop. Euthanaseren van de larven door het plaatsen van de zWEDGI op een ice waterbad of op 4 ^o C gedurende ten minste 20 minuten en beoordelen afwezigheid van hartslag en omloop.
   Opmerking: Omdat de larven zijn bijgehouden in aparte compartimenten, de larven kunnen worden individueel hersteld door zachtjes te trekken op de agar met pincet of pipet. De agar kan worden verwijderd uit het hoofd regio en de larve gebruikt voor aanvullende procedures, zoals fixatie voor antilichaam kleuring of verwerkt voor RNA of eiwit extractie.
2. Na verwijdering van de larven en de agar, reinig de zWEDGI met ethanol en gedestilleerd water, zoals beschreven in stap 4.1 en ondersteboven lucht droog. Opslag die wordt behandeld in een koele, droge plaats. Opnieuw jas met magere melk (stap 4.2), desgewenst voorafgaand aan het volgende gebruik.
   Opmerking: zWEDGIs kunnen worden hergebruikt meerdere malen totdat het PDMS begint te komen uit de buurt van het glas.

Results

Het zWEDGI PDMS microfluidic apparaat is een functioneel verzuilde apparaat ontworpen voor vier hoofdfuncties (zie hieronder) live beeldvorming van caudal fin verwonden van genezing en hergroei in de zebravis larven is gekoppeld. PDMS werd gekozen voor de fabricage van zWEDGI omdat het is niet alleen gemakkelijk beschikbaar en een industriestandaard voor biocompatibiliteit, maar ook werken goed in mallen. Bovendien, maakt PDMS het apparaat herbruikbare en leegte van harde of scherpe rande...

Discussion

Het doel van het apparaat zWEDGI is 3D time-lapse imaging door te stabiliseren en de vis binnen de kleine afstand van de doelstelling van een hoge-resolutie Microscoop kunt vastleggen. Met inachtneming van deze ontwerp-specificaties, is het ook een verbetering over traditionele agar gebaseerde voorbereiding voor levende imaging. Er zijn drie essentiële stappen (zie hieronder) in de fabricage van de zWEDGI, die, indien niet correct gedaan, in defecte apparaten resulteren kan:

PDMS voorbereiding...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane