Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dendrimeer gebaseerde ongelijke Nanopatterns naar lokaal controle oppervlak hechting: een methode om directe Chondrogenic differentiatie

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56347

⸱

20 januari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

In dit artikel

Samenvatting

Een werkwijze te halen Dendrimeer gebaseerde ongelijke nanopatterns waarmee de nanoschaal controle van lokale arginine-glycine-aspartic acid (RGD) oppervlakte dichtheid is beschreven en toegepast op de studie van celdifferentiatie hechting en chondrogenic.

Samenvatting

Cellulaire aanhechting en differentiatie is geconditioneerd door de nanoschaal dispositie van de componenten van de extracellulaire matrix (ECM), met lokale concentraties hebben een grote invloed. Hier presenteren we een methode voor het verkrijgen van grootschalige ongelijke nanopatterns van arginine-glycine-asparaginezuur (RGD)-matiemaatschappij dendrimeren waarmee de nanoschaal controle van lokale RGD oppervlakte dichtheid. Nanopatterns worden gevormd door de oppervlakte adsorptie van dendrimeren van oplossingen op verschillende eerste concentraties en worden gekenmerkt door water contacthoek (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), en scanning probe microscopie technieken zoals Scanning tunneling microscopie (STM) en atomic force microscopie (AFM). De lokale oppervlakte dichtheid van RGD wordt gemeten met behulp van AFM beelden door middel van waarschijnlijkheid contourkaarten van interparticle minimumafstanden en vervolgens gecorreleerd met cel adhesie respons en differentiatie. De methode van de nanopatronen die hier gepresenteerd is een eenvoudige procedure die op een eenvoudige manier om grote oppervlakten kan worden opgeschaald. Het is dus volledig compatibel met de protocollen van de cultuur van de cel en kan worden toegepast op andere liganden die concentratie-afhankelijke effecten op cellen uitoefenen.

Inleiding

Hier beschrijven we een eenvoudig en veelzijdig Dendrimeer gebaseerde nanopatronen procedure voor het verkrijgen van cel cultuur oppervlakken waarmee de controle van lokale hechting op nanoschaal. Nanoschaal details voor ECM organisatie zijn gemeld,3 2,1,en de nanopatronen van cel adhesie oppervlakken heeft diepe inzichten in de cellulaire vereisten met betrekking tot hechting4, 5. Experimenten met behulp van micellaire lithografie gebaseerde nanopatterns bleek een drempelwaarde van ongeveer 70 nm voor RGD peptide nanospacing, cel adhesie aanzienlijk wordt vertraagd boven deze waarde6,7,8 ,9. Deze studies ook gewezen op de grotere invloed van lokale dan globale ligand dichtheid op cel adhesie9,10,11.

Tijdens de morfogenese trigger cel interactie met de omgeving de eerste differentiatie gebeurtenissen, die blijven tot uiteindelijke complex weefsel structuren hebben gevormd. In dit kader zijn nanopatterned oppervlakken gebruikt om aan te pakken van de invloed van de eerste celoppervlak interacties op de voedselproductie. Lithografie gebaseerde RGD nanopatterns met een zijdelingse afstand van 68 nm in β-type Ti-40Nb legeringen bijdragen tot het handhaven van de ongedifferentieerde fenotype van cellen van de stam van de niet-begaan12, terwijl RGD nanospacings van tussen 95 en 150 nm de differentiatie van verbeteren mesenchymale stamcellen (MSCs) richting adipogenic/osteogenic13,14,15 en chondrogenic lot16. Ook is zelfassemblerende macromoleculen bewerkt met signalering componenten gebleken direct cel adhesie en differentiatie doordat nanoschaal architecturale regulering van de signalering signalen17. In dit verband is de afzetting van dendrimeren met cel-interactie wordt in hun buitenste bol18,19,20 op oppervlakken gebruikt voor het bestuderen van de cel adhesie21,22, morfologie23,24, en25,26van de gebeurtenissen van de migratie. Echter maakt het gebrek aan oppervlakte karakterisering in deze studies het moeilijk om vast te stellen van de geen correlatie tussen Dendrimeer oppervlak configuratie en cel-respons.

Dendrimeer nanopatterns met vloeistof-achtige orde en gedefinieerde afstand kan worden verkregen wanneer dendrimeren aan lage geladen oppervlakken van oplossingen met lage Ionische sterkte adsorberen. 27 op basis van deze eigenschap, hier presenteren we een methode voor het verkrijgen van grootschalige ongelijke nanopatterns van RGD-matiemaatschappij dendrimeren op lage geladen oppervlakken die de nanoschaal bedienen van lokale RGD oppervlakte dichtheid toestaan. Water contacthoek (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) en scanning probe microscopie technieken (STM en AFM nanopatterns) Toon dat lokale ligand dichtheden wijzigen de eerste Dendrimeer-concentratie in de oplossing kunnen worden aangepast. De lokale RGD oppervlakte dichtheid is gekwantificeerd van AFM beelden door contourkaarten van de waarschijnlijkheid van interparticle minimumafstanden en vervolgens gecorreleerd met cel experimenten. Vergeleken met andere nanopatronen technieken4, Dendrimeer-gebaseerd nanopatronen is eenvoudig en kan gemakkelijk worden opgeschaald naar grote oppervlaktes, is volledig compatibel met cel cultuur toepassingen. Nanopatterns worden gebruikt als bioactieve substraten te evalueren van het effect van de lokale RGD oppervlakte dichtheid op cel adhesie28 en op de chondrogenic-inductie van volwassen menselijke MSCs29. Onze resultaten tonen aan dat RGD Dendrimeer gebaseerde nanopatterns celgroei ondersteunen en dat cel adhesie wordt versterkt door de hoge lokale RGD oppervlakte dichtheden. In de experimenten van de differentiatie begunstigd tussenliggende hechting van de cellen op de verschillende ondergronden MSC condensatie en vroege chondrogenic differentiatie. Vanwege het gemak met welke Dendrimeer perifere groepen kunnen worden gewijzigd, kan de hier beschreven methode worden uitgebreid tot andere ECM-liganden die concentratie-afhankelijke effecten op cellen uitoefenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. substraat voorbereiding

  1. Gloeien 1.4 x 1.1 cm Au(111) op Mica substraten.
    1. Plaats het Au(111) substraat op een glas-keramiek kookplaat en het gloeien met een butaan vlam voor 3 min. toestaan het substraat afkoelen onder een atmosfeer van argon. Herhaal deze stap voor elke Au(111) substraat.
      Opmerking: Er is Au(111) substraten dient onmiddellijk na gloeien.
  2. Voorbereiding van Poly (L-Lactic Acid) (PLLA)-gecoate glazen substraten.
    1. Knippen en wassen van de dia's van glas.
      1. Microscopie dia's in 18 slides van 1.25 x 1,25 cm met een diamant-tip cutter te snijden. Maak een kleine inspringing op de onderkant van elke dia, zodat de bovenste en onderste zijkanten kunnen later worden onderscheiden.
      2. De dia's grondig wassen met gedeïoniseerd water gevolgd door 96% ethanol. Laten drogen.
    2. Bereid de oplossing van de PLLA 2%.
      1. Meng 200 mg PLLA 10 mL 1,4-dioxaan in een druk buis. Voegen van een roer-bar en de buis strak te sluiten.
      2. Plaats de buis van de druk in een bad van glycerine op een hete plaat bij 60 ° C onder zachte roeren gedurende 24 uur en vervolgens Breng de oplossing over in een flesje van 15 mL glas.
    3. Coating van het glas dia's met de PLLA-oplossing.
      1. Plaats het glas dia's en het flesje met de PLLA-oplossing op een schone warmhoudplaat bij 60 ° C. Zorg ervoor om de dia's naar boven gericht en hen toestaan om te blijven voor ten minste 10 min. te bereiken van de vereiste temperatuur.
      2. Voorbereiding van de spin-coater en stel het programma dat is opgegeven in tabel 1.
      3. Plaats een van de dia's gezicht-omhoog op de spin-coater, met behulp van een vacuümsysteem. Met een pipet van Pasteur, 0,25 mL van de oplossing van de PLLA van toepassing op de dia, ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak bedekt is. Voer het programma coating. Herhaal deze stap voor elke dia.

2. Dendrimeer nanopatronen

  1. Voorbereiding van RGD-matiemaatschappij Dendrimeer (RGD-Cys-D1) 28 oplossingen.
    1. Los 5 mg van de Dendrimeer in 6.494 mL gedeïoniseerd water. Dit is oplossing A.
      Opmerking: Gebruik Dendrimeer stockoplossing binnen 6 maanden van voorbereiding.
    2. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing A voor 10 min en bereiden van de oplossingen B en C aanleiding van tabel 2.
    3. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing C gedurende 10 minuten en bereiden van oplossingen, D, E en F aanleiding van tabel 2.
    4. De oplossingen B, C, D, E en F bij 4 ° C bewaren tot gebruik. Oplossing A kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor later gebruik.
  2. Nanopatronen van RGD-Cys-D1 dendrimeren op de ondergronden
    1. Steriliseren in de kap van een weefselkweek, de substraten door te bestralen hen met UV-licht voor 13 min.
      Opmerking: Deze stap is alleen nodig wanneer nanopatterned substraten gaat worden gebruikt als cel cultuur substraten. In dit geval het handhaven van de steriele omstandigheden (weefselkweek kap, steriele materialen, oplossingen en technieken) voor de volgende stappen uit.
    2. Plaats elk substraat gezicht-omhoog in de putten van een plaat, afhandeling daarvan voorzichtig met een pincet.
    3. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossingenvoor B, C, D, E en F 10 min.
    4. De RGD-Cys-D1 Dendrimeer oplossingen passeren een 0.22-µm diameter filter met behulp van een injectiespuit rechtstreeks in de putjes met de substraten (2 mL/putje). Ten minste drie replica's per Dendrimeer concentratie worden aanbevolen. Sluit en verzegel de plaat en laat het op kamertemperatuur (RT) voor 16 h.
    5. Verwijderen en verwijderen van de oplossingen. Wassen van de substraten met steriel gedeïoniseerd water en droog. Winkel substraten bij 4 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. voorbereiding van de controle substraten

Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap, en enkel steriele materialen, oplossingen en technieken werden gebruikt. In ieder geval bepalen zes substraten waren gebruikt (drie replica's van de positieve controle) en drie replica's van de negatieve controle.

  1. Steriliseren in de kap van een weefselkweek, de substraten door te bestralen hen met UV-licht voor 13 min.
  2. Controle substraten voor Fibroblast hechting Experiment.
    1. Het gebruik van vlam-gegloeid Au(111) substraten als de negatieve controle. Gold heeft een bekende eiwit-denaturatie effect dat anti-zelfklevende Celeigenschappen28verleent. Bewerk ultrasone trillingen ten alle oplossingen en filteren voordat substraat incubatie.
    2. Voor de positieve controles, onderdompelen vlam-gegloeid Au(111) substraten in een oplossing van PEG RGD gemodificeerde thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glycol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 en triëthyleenglycol glycol (en) mono-11-mercaptoundecyl ether (PEG-SH) bij een 1:100 molaire verhouding in 96% ethanol voor 16u op RT.
    3. Grondig wassen van substraten in ethanol en droog ze met argon. Winkel substraten bij 4 ° C.
  3. Controle substraten voor Chondrogenesis.
    1. Ongerepte PLLA substraten gebruiken als de negatieve controle. Zonder enige oppervlaktebehandeling toont PLLA slechte interfacing met levende cellen. 31
    2. Voor de positieve controles, 5 mL 0,1 mg/mL fibronectine in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor te bereiden en uit te broeden elk substraat PLLA met 1.6 mL van de oplossing van de fibronectine voor 1 h op RT.
    3. Verwijderen en verwijderen de fibronectine oplossing, en wassen van de substraten met PBS. Winkel substraten bij 4 ° C.

4. oppervlakte karakterisering

  1. AFM Imaging
    1. AFM beeldvorming van PLLA substraten voor een ruwheid analyse uitvoeren Aangezien dendrimeren een diameter van 4-5 nm, ruwheid waarden van 1 hebben nm voor de juiste visualisatie van de nanopatterns moet worden verkregen. Ook voeren AFM beeldvorming van de nanopatterns. In beide gevallen voeren AFM in modus in de lucht te onttrekken.
    2. Selecteer een cantilever silicium met een veer constante k = 40 N/m en een resonante frequentie ν = 300 kHz en monteer het op de AFM-apparatuur.
    3. Monteer het monster op het podium van de atomaire kracht Microscoop. Afhankelijk van de opzet van het apparaat, kunnen tuning en imaging specificaties verschillen. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant.
    4. Aanpak van het monster met het topje van de Microscoop tot contact.
    5. Selecteer naar image PLLA ruwheid p.a., ten minste vier representatieve gebieden van 20 x 20 µm per substraat uit drie onafhankelijke ondergronden. Dendrimeer nanopatterns van het beeld, kiest u ten minste drie representatieve beelden van 5 × 5 µm per substraat uit drie onafhankelijke ondergronden per voorwaarde (eerste Dendrimeer concentratie in oplossing). Aanpassen om te voorkomen beschadiging van de Dendrimeer laag terwijl beeldvorming, de instelpunt de kracht om op te houden een minimum.
      Opmerking: De keuze van het imaginggebied hangt ook het werkbereik van de piëzo-elektrische scanner. Raadpleeg de handleiding van het instrument in dit verband.
    6. Proces de AFM hoogte beelden door het aanbrengen van elk scan lijn naar polynoom herverdeling van functies met behulp van de propriëtaire software van de fabrikant van het apparaat van de AFM en analyseren die van PLLA voor het berekenen van de oppervlakte ruwheid. Root-mean-square (RMS) analyse kan een geschikte optie bieden.
  2. Lokale RGD oppervlakte dichtheid meting.
    1. De afbeelding drempels voor de verwerkte AFM hoogte beelden te selecteren van de dendrimeren op het oppervlak te verkrijgen.
    2. Bepalen van de standpunten van de deeltjes met behulp van een beeld processing software en ze gebruiken om het verkrijgen van de minimumafstanden interparticle (dmin).
    3. Plot dmin waarden in z aan de overeenkomende posities van het deeltje te verkrijgen van de waarschijnlijkheid contourkaarten voor dmin. Pas de kleurenschaal van de plot te visualiseren van de regio's van de hoogste lokale RGD oppervlakte dichtheid (dmin < 70 nm).
    4. Het kwantificeren van het gebied van de regio's met de hoogste lokale RGD oppervlakte dichtheid met behulp van een beeld processing software. Het gebied van Dendrimeer aggregaten opnemen in de berekening.
  3. STM beeldvorming.
    Opmerking: STM beeldvorming kan worden uitgevoerd alleen voor nanopatterns op de geleidende Au(111) substraten. Metingen zijn gedaan in de lucht.
    1. Plaats het substraat van de nanopatterned, in de monsterhouder van de STM-apparatuur. Controleer de elektrische verbinding tussen monster en houder met een tester.
    2. Etch een tip van de geselecteerde sonde materiaal (dwz. PT 0,8: Ir 0.2) met een diameter die zorgt voor een goede montage op het hoofd van de STM-apparatuur. Etsen kan worden uitgevoerd door handmatige snijden of elektrochemische etsen. 32
      Opmerking: Elektrochemisch etsen maakt meer symmetrische tips.
    3. Tip voor het in het hoofd van de STM-apparatuur monteren en aansluiten van het monster.
    4. "Huidige" in het feedback-kanaal instellen (in dit soort meting, huidige zullen constant door feedback tuning). Pas de bias spanning en huidige instelpunt en scan grootte een goed opgelost om beeld te krijgen zodra de tip is bezig.
      Opmerking: De keuze van het imaginggebied hangt ook het werkbereik van de piëzo-elektrische scanner. Raadpleeg de handleiding van het instrument in dit verband.
    5. Proces de STM topografische beelden door het aanbrengen van elke scanlijn te herverdelen van polynomiale functies met behulp van de propriëtaire software van de fabrikant van het apparaat van de STM.
  4. CA metingen.
    1. Maat CA op de nanopatterned substraten door de sessiele neerzetten op drie verschillende posities op drie onafhankelijke substraten per voorwaarde (eerste Dendrimeer concentratie in oplossing) met een optisch systeem van CA.
    2. Vul de microsyringe met gedeïoniseerd water en stel de parameters in de CA-software voor de productie van 1 µL druppels.
    3. Het monster in het werkgebied plaatst, zodat het oppervlak van het monster duidelijk zichtbaar op de computer voor imaging is.
    4. Verplaats de spuit met de micromanipulator totdat het wordt dicht onder de oppervlakte en afzien van de daling op het oppervlak. Record het beeld onmiddellijk na stabilisatie van de druppel.
      Opmerking: In CA metingen, het is zeer belangrijk om te controleren van vochtigheid om reproduceerbare resultaten te bereiken.
    5. Analyseer de CAs gemeten met de merkgebonden software van de fabrikant van het apparaat CA. De montage methode kan worden aangepast aan de behoeften van de gebruikers. De elliptische montage methode kan een optie zijn.

5. de celkweek

Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd in een weefselkweek kap, en enkel steriele materialen, oplossingen en technieken werden gebruikt.

  1. Fibroblast hechting Experiment.
    1. Cultuur NIH 3T3 muis embryonale fibroblasten van vroege passages (< 10) bij 37 ° C en 4,6% CO2 sfeer in basale medium met hoge glucose aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 1% natrium pyruvaat (groeimedium). T75 kolven voor een totale zaaien van 500.000 cellen per maatkolf 10 ml van groeimedium worden aanbevolen.
    2. Verwijder oude medium met een 10 mL pipet om de 2 dagen en vervang met 10 mL vers bereide groeimedium.
    3. De cellen van de cultuur in het groeimedium totdat ze rond de 80% samenvloeiing, dan Verwijder het medium bereikt en voeg 5 mL trypsine per kolf. Om ervoor te zorgen de juiste cel detachement vanaf de onderkant van de kolf, handhaven de trypsine oplossing in contact met de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    4. Voeg 5 mL groeimedium per kolf en het verzamelen van de cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL groeimedium. Bepaal de concentratie van cellen met behulp van een hemocytometer.
    5. Overdracht van de substraten goed platen niet behandeld voor weefselkweek (niet-aanhanger).
    6. De cellen op de ondergronden bij een dichtheid van 4.000 cellen/cm2 in groeimedium zaad en hen gedurende 4,5 uur bij 37 ° C en 10% CO2 sfeer uit te broeden.
  2. Chondrogenic-inductie van MSCs.
    1. Cultuur van menselijke MSCs van vroege passages (< 5) bij 37 ° C en 4,6% CO2 -sfeer in MSC groeimedium. T75 kolven voor een totale zaaien van 500.000 cellen per maatkolf 10 ml van groeimedium worden aanbevolen.
    2. Medium elke 3 dagen wijzigen (zoals beschreven in 5.1.2).
    3. Trypsinize cellen voordat de samenvloeiing van de 80% is bereikt, en centrifugeren en resuspendeer hen in MSC groeimedium (zoals beschreven in 5.1.3). Bepaal de concentratie van cellen met behulp van een hemocytometer.
    4. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer hen in 10 mL chondrogenesis-inducerende voedingsbodem.
    5. De substraten uit de platen naar nieuwe goed platen niet behandeld voor weefselkweek (niet-aanhanger) overbrengen. De cellen op de ondergronden bij een dichtheid van 3.000 cellen/cm2zaad.
    6. Het chondrogenic medium elke 3 dagen wijzigen (zoals beschreven in 5.1.2).

6. cel fixatie en immunokleuring

Opmerking: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd in niet-steriele omstandigheden.

  1. Verwijder het medium en wassen van de cellen zachtjes met PBS. Corrigeren door toevoeging van een 10% formaline-oplossing voor 20 min aan RT.
  2. Verwijder de formaline en wassen van de cellen met PBS.
  3. Blokkeren de gratis aldehyde-groepen door het toevoegen van een 50 mM-oplossing van ammoniumchloride (NH4Cl) in PBS. Laat de cellen gedurende 20 minuten op RT. verwijderen NH4Cl oplossing en wassen van de cellen met PBS.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Monsters in PBS bewaren bij 4 ° C.
  4. Verwijderen van PBS en permeabilize van de cellen door toevoeging van een 0,1% oplossing van saponine in de blokkerende oplossing (1% albumine in PBS) gedurende 10 minuten aan RT. Wash de cellen met PBS en monsters overbrengen in een nieuwe goed plaat.
  5. Incubeer de cellen met een oplossing van primaire antilichamen in de blokkerende oplossing (tabel 3) gedurende 1 uur op RT. Vervolgens de primair antilichaam-oplossing verwijderen en wassen van de cellen met PBS.
  6. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen in de blokkerende oplossing (tabel 3) gedurende 1 uur op RT.
    Opmerking: Voorkomen licht blootstelling.
  7. Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en wassen van de cellen met PBS en droog.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters in PBS opslaan bij 4 ° C in het donker.
  8. Monster montage voor Microscoop observatie: met behulp van een cutter diamant-tip, coverslips gesneden 1,25 cm x 1,25 cm. toepassing 50 µL van microscopie montage van drager op de monsters en bestrijk ze zachtjes met de gesneden coverslips.
  9. Overdracht van de monsters naar een geschikte ontvanger, bedekken met aluminiumfolie en winkel in het donker bij 4 ° C tot observatie.

7. cel Imaging en Data-analyse

Opmerking: Voor ondoorzichtige Au(111) en dikke microslide gebaseerde substraten, een rechtop Microscoop moet worden gebruikt.

  1. Fibroblast hechting Experiment.
    1. Gebruik een epifluorescence Microscoop voorzien van een digitale camera en lage (d.w.z. 10 X) en hoog (dat wil zeggen 40 X) vergroting doelstellingen. Voer metingen in de lucht.
    2. Leg het monster op de celkernen fase en beeld met de 10 X doelstelling met behulp van een ultraviolet excitatie, longpass emissie filter te visualiseren de Hoechst/DAPI vlek.
    3. Afbeelding cel cytoskelet en focale verklevingen (FAs) met 40 X doel selecteren de Microscoop filter die overeenkomt met de overeenkomstige antilichaam fluorescerende specificaties.
    4. Voor FA kwantificering, gebruikt u een beeld processing software voor bekeerling spiegelbeeld voor 8-bits bestanden. Het verwijderen van de beelden van de achtergrond en converteren naar een binair getal door de instelling van een drempel. Berekenen van ten minste 30 beelden per monster en FAs 1 µm2 voor berekening rekening worden gehouden.
  2. Chondrogenic-inductie van MSCs.
    1. Afbeelding van cel condensaten in de eerste stadia van chondrogenic inductie (< 5 dagen) met een rechte epifluorescence Microscoop voorzien van een digitale camera en een lage (d.w.z. 10 X) vergroting doelstelling. Ultraviolet excitatie en longpass emissie filter gebruiken om te visualiseren de Hoechst/DAPI vlek.
    2. Voor het meten van het condensaat gebied, gebruik van een beeldverwerking software, afbeeldingen omzetten in 8-bits bestanden, verwijderen van de achtergrond en selecteer een drempel die wijst op de statistische contour. Bereken de oppervlakte van de deeltjes.
    3. Afbeelding immunostained monsters voor FAs, cytoskelet actine, vezels en kraakbeen-specifieke collageen type II alpha 1 (COL2A1) met een rechtop confocal microscoop bij hoge vergroting (dat wil zeggen 40-60 X). Secties met een representatieve interval (dat wil zeggen 0,5 – 1 µm) verzamelen.
    4. Gebruiken voor het verwerken van de stack, een beeld processing software. Afbeeldingen omzetten in 8-bits bestanden, verwijderen van de achtergrond en binaire maken door het instellen van een drempel. Behandelen van een minimum van drie cel condensaten per voorwaarde van drie onafhankelijke monsters.
    5. Kwantificeren van de proteïne van de FA gebieden van de basale zone van cel condensaten gekleurd en express hen als het overeenkomstige percentage van gebied gedeeld door het aantal celkernen in de afbeelding.
    6. Voor het meten van COL2A1 kleuring, gebruik van de confocal z-projecties en kwantificeren van de som van de geprojecteerde oppervlak (COL2A1 maximumareaal per monster). Normaliseren van de waarde van de gebied verkregen tegen het gebied van de bijbehorende condensaat.

8. kwantitatieve Reverse transcriptie-polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) analyse

Opmerking: Om te voorkomen dat RNase besmetting, gebruik van wegwerpbare, steriele plastic consumptieaardappelen en wegwerphandschoenen te dragen tijdens het verwerken van reagentia en RNA. Altijd gebruik van de juiste microbiologische aseptische technieken en een passende decontaminatie oplossing werkoppervlakten en niet-beschikbare items zoals centrifuges en pipetten RNase verontreiniging verwijderen.

  1. Totaal RNA isoleren en het verpulveren in een RNA ontregelt. Behandelen van RNA monsters met DNase en hen omzetten in cDNA met behulp van een cDNA synthese kit.
  2. Voeren qRT-PCR gebruikt inleidingen voor de transcriptiefactor SOX9. Bèta-2-microglobulin (B2M) en ribosomal eiwit L13a (RPL13a) kan worden gebruikt als schoonmaak genen.
  3. Berekenen van de niveaus van de expressie en normaliseren hen tegen de negatieve controle (PLLA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Presenteren we een nanopatronen methode waarmee oppervlakte hechting worden aangepakt op nanoschaal (Figuur 1). De chemische structuur van RGD-Cys-D1 is afgebeeld in figuur 1A. Dendrimeren waren patroon op elektrisch geleidende oppervlakken van de Au(111) voor hoge resolutie STM karakterisering. Lage Dendrimeer concentraties in oplossing (maximaal 10-5% w/w) gerenderd geïsoleerde dendrimeren van 4-5 nm in diam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens de ontwikkeling van het beschreven protocol, moet een aantal kritische stappen worden overwogen. De eerste heeft betrekking op de karakterisering van het nanopattern met scanning probe microscopie technieken. Om te visualiseren de nanopatterns, moet het oppervlak waar de patronen is geproduceerd ruwheid waarde lager is dan de gemiddelde diameter van de dendrimeren, dat ongeveer is 4 tot 5 nm gemeten door STM (figuur 1B). Ook, het moet worden rekening gehouden met dat hoge resolutie STM beeldvormi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Oriol Font-Bach en Albert G. Castaño voor hun hulp in dmin kwantificering. Zij erkennen ook de geavanceerde digitale microscopie Unit van het Institute for Research in biogeneeskunde (IRB Barcelona) om te laten de auteurs de video opnemen in hun bedrijfsruimten ter beschikking. Dit werk werd gesteund door de Networking biomedische Research Center (CIBER), Spanje. CIBER is dat een initiatief in het gefinancierd door de VI nationale o & o & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider programma, CIBER acties, en het Instituto de Salud Carlos III, met de steun van het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling. Dit werk werd ondersteund door de Commissie van universiteiten en onderzoek van het departement voor innovatie, universiteiten en ondernemingen van de Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Het werd ook gefinancierd door de projecten OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) en CTQ2013-41339-P, uitgereikt door het Spaanse ministerie van economie en concurrentievermogen, daarnaast aan INTERREG V-A Spanje-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkent dat financiële steun van het Spaanse ministerie van economische zaken en concurrentievermogen subsidie (nr. IFI15/00151).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm Spi Supplies466PS-AB
Glass micro slides, plainCorning2947-75x25
Deionized waterMillipore18MΩ cm
Ethanol 96%PanReac131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymerCorbion95/05 molair verhouding
1,4 - dioxaneSigma-Aldrich296309-1L
Silicone oil, high temperatureAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Tissuculaire laminaire flow hoodTelstarBio II AdvanceClass II biologische veiligheidskast
Filter unitMillex-GPSLGP033RB0.22 µm
Spuit 10 mLDiscardit309110
Atomic Force microscopeVeeco InstrumentsDimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probesBudget SensorsTap300AI-GResonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscopeMolecular ImagingPicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 draadAdventPT671012Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 softwareNanotec electronica
Optical contact angle (CA) systeemDataphysics
SCA20 softwareDataphysics
X-ray foto-elektronspectrometerPhysical ElectronicsPerkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin uit bovien plasmaSigma-AldrichF1141-1MG1.0 mL oplossing
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Gibco21600-10Poeder
Mouse embryo fibroblastenATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) vloeibaar hoge glucoseGibco11960044vloeibaar hoge glucose, geen glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutamineInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicilline-streptomycineInvitrogen15140
NatriumpyruvaatInvitrogen11360039100 mL
T75 kweekkolvenNunclon156499
TrypsineLife Technologies252000720,25% EDTA
CentrifugeHermle LabortechnikZ 206 A
Niet-tissue culture behandelde plaat, 12 welFalcon351143Niet-adherent
Adipose-derived hMSCsATCCATCC PCS-500-011Celflesje 1 mL
MSC basaal mediumATCCATCC PCS-500-030
MSC groeikitATCCATCC PCS-500-040Laag serum
Chondrocyt differentiatietoolATCCATCC PCS-500-051
Formaline oplossingSigma-AldrichHT5011-15MLNeutraal gebufferd, 10%
AmmoniumchlorideSigma-AldrichA9434-500Gvoor moleculaire biologie, geschikt voor celkweek, ≥99.5%
SaponineSigma-Aldrich47036-50G-Fvoor moleculaire biologie, gebruikt als niet-ionische oppervlakteactieve stof, adjuvant
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Rabbit monoklonaal [Y113] anti-paxilline antilichaamAbcamab32084Verdund 1:200
Muis monoklonaal [1F5] anti-collageen alpha-1 XX keten Acris AntibodiesAM00212PU-NVerdund: 1:400
Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA106672 mg/mL. Verdund 1:1000
Alexa Fluor 568-geconjugeerd geit anti-konijn IgG (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA110362 mg/mL. Verdund 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Verdund 1:1000
Dekglas 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Epifluorescentie MicroscoopNikonEclipse E1000 rechtopstaande microscoopmet een CCD-camera
Confocale MicroscoopLeica MicrosystemsLeica SPE Rechtopstaande Confocale Microscoop
ImageJ 1.50g freewarehttp://imgej.nih.gov/ij
MATLAB softwareThe MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software OriginLab Coorporation
```

Referenties

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046(2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96(2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Dendrimeer nanopatronenRGD oppervlaktedichtheidceladhesieatoomkrachtmicroscopiescanning tunneling microscopiewatercontacthoekr ntgenfoto elektronspectroscopiemesenchymale stamcellencollageen II alfa I
Dendrimeer gebaseerde ongelijke Nanopatterns naar lokaal controle oppervlak hechting: een methode om directe Chondrogenic differentiatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.