Methodenartikel

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

DOI:

10.3791/56373

⸱

29 september 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van een eenvoudige, snelle en efficiënte prion amplificatie techniek, de real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) methode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De RT-QuIC techniek is een gevoelige in vitro cel-vrije prion amplificatie assay voornamelijk gebaseerd op de geplaatste misfolding en aggregatie van recombinante prion-eiwit (PrP) substraat prion zaden als sjabloon gebruiken voor de conversie. RT-QuIC is een nieuwe hoog-productie-techniek die analoog aan de real-time polymerasekettingreactie (PCR is). Detectie van amyloïde fibril groei is gebaseerd op de kleurstof Thioflavin T, dat op specifieke interactie met ᵦ vel rijke eiwitten licht. Dus, kan de amyloïde vorming gedetecteerd worden in real-time. Wij probeerden om een betrouwbare, niet-invasieve screeningtest op te sporen van chronische verspillen disease (CWD) prionen in fecale extract. Hier hebben we de RT-QuIC techniek te onthullen PrPSc zaaien activiteit in uitwerpselen van CWD besmet hertachtigen specifiek aangepast. Aanvankelijk was de seeding activiteit van de fecale extracten die wij bereid in RT-QuIC, mogelijk als gevolg van potentiële assay-remmers in het fecaal materiaal relatief laag. Ter verbetering van de activiteit van de seeding van extracten van de ontlasting en verwijderen van potentiële assay-remmers, we de fecale monsters in een buffer met detergenten en proteaseinhibitors gehomogeniseerd. We ook afkomstig van de monsters naar verschillende methodologieën te concentreren PrPSc op basis van eiwit neerslag met behulp van natrium phosphotungstic zuur, en de middelpuntvliedende kracht. Tot slot, de ontlasting extracten zijn getest door geoptimaliseerde RT-QuIC waaronder substraat vervanging in het protocol bij het verbeteren van de gevoeligheid van detectie. Dus, we ingesteld een protocol voor gevoelige detectie van CWD prion activiteit in uitwerpselen van pre-klinische en klinische hertachtigen door RT-QuIC, die een praktisch instrument voor niet-invasieve diagnose van CWD kunnen zaaien.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prionziekten of overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) zijn neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van Creutzfeldt - Jacob (CJD) bij mensen, boviene spongiforme encefalopathie (BSE) bij runderen, scrapie bij schapen en geiten, en chronische verspillen ziekte (CWD) bij hertachtigen 1,2. TSE's worden gekenmerkt door onderscheidende spongiforme uiterlijk en verlies van neuronen in de hersenen. Volgens de "alleen eiwit" hypothese, zijn prionen voornamelijk samengesteld uit PrPSc ('Sc' voor scrapie) 3, een misfolded isovorm van het host-gecodeerde cellulaire prion-eiwit, PrPC. PrPSc vloeit voort uit de omzetting van PrPC in een conformatie verrijkt in ᵦ-bladen 4,5,6 die kan fungeren als een zaadje om te binden en converteren van andere PrPC moleculen. De nieuw gegenereerde PrPSc -moleculen worden opgenomen in een groeiende polymeer 7,8 die in kleinere oligomeren breekt, wat resulteert in hogere nummers van besmettelijke kernen. PrPSc is gevoelig voor aggregatie en is gedeeltelijk resistent tegen proteasen 9,10.

CWD beïnvloedt wilde en gekweekte elanden (Cervus canadensis), muildierhert (Odocoileus hemionus), Witstaarthert (WTD; Odocoileus virginianus), elanden (Alces alces), en (Rangifer dierkunde dierkunde) rendier 11,12,13. Het wordt beschouwd als de meest besmettelijke prionziekte met horizontale overdracht begunstigd door cervid interacties en milieu persistentie van infectiviteit 14,15. In tegenstelling tot andere prionziekten waar PrPSc accumulatie en infectiviteit zijn beperkt tot de hersenen, in CWD zijn deze ook gevonden in perifere weefsels en lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, urine en ontlasting 16,17, 18.

Immunohistochemistry wordt beschouwd als de gouden standaard voor CWD diagnose om PrPSc distributie en spongiforme laesies 19,20te detecteren. ELISA en in meer zeldzame gevallen, westelijke vlek zijn ook gebruikt voor CWD diagnostiek. Huidige prion ziekten diagnose is dus voornamelijk gebaseerd op het opsporen van prionen in post mortem weefsels. Ante mortem diagnose voor CWD is beschikbaar door middel van amandelen of biopsieën recto-anale mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel (RAMALT); echter, deze procedure is invasieve en vereist het vangen van de dieren. Dus, zou het gebruik van gemakkelijk toegankelijke specimens, zoals urine en ontlasting, een praktische manier voor CWD prion detectie. Echter, deze haven uitscheidingsproducten relatief lage concentraties van prionen onder de detectiegrens van huidige diagnostische methoden. Bijgevolg is een gevoeliger en hoge doorvoer diagnostische tool noodzakelijk. In vitro conversie systemen, zoals eiwit misfolding cyclische amplificatie assay (PMCA) 21, amyloid seeding assay, en real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) assay 22,23, 24 zijn zeer krachtige hulpmiddelen te exploiteren de zelf teeltmateriaal vermogen van PrPSc na te bootsen in vitro het prion-conversieproces en daardoor het versterken van de aanwezigheid van minieme hoeveelheden van PrPSc naar detecteerbare niveaus 25 ,26. De RT-QuIC methode, maar profiteert van het feit dat het product van de conversie verrijkt met β-sheet secundaire structuur specifiek thioflavin T (Th-T) kunt binden. Daarom groeit recombinante PrP (rPrP) bij de geplaatste conversie uit tot amyloïde fibrillen die Th-T binden en dus in real time kunnen worden gedetecteerd door het meten van de fluorescentie van Th-T uitgedrukt als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) na verloop van tijd. Zodra gecontroleerd, kan de RFU worden gebruikt om te evalueren van de relatieve seeding activiteiten en kwantitatieve parameters zoals de lag-fase. De lag-fase vertegenwoordigt de (h) benodigde tijd voor het bereiken van de drempel, tijdens welke rPrP conversie in het vroege stadium van de reactie onder de detectiegrens van Th-T fluorescentie is. Het einde van de fase van de schijnbare lag, gelijktijdige tot de vorming van een voldoende amyloïde nucleus (nucleatie/rek), vindt plaats wanneer de Th-T fluorescentie groter is dan de drempelwaarde en positief. De groei van amyloid fibrillen kunnen worden opgespoord in real time en de eerste PrPSc of seeding activiteit opgenomen in de steekproef wordt versterkt door de segmentatie die meer zaden genereert. Deze zaden induceren op zijn beurt een snelle exponentiële groeifase amyloïde vezel.

Omdat deze test is het kundig voor speurder zo laag als 1 fg van PrPSc 24, de hoge gevoeligheid kwalificeert deze techniek om antemortem- of niet-invasieve diagnose door het detecteren van PrPSc in de verschillende perifere weefsels, uitscheidingsproducten of andere soorten specimen lage niveaus van infectiviteit herbergen. RT-QuIC biedt zeker voordelen ten opzichte van andere testen voor de reproduceerbaarheid, bruikbaarheid, snelheid (minder dan 50 h) en lage kosten in vergelijking met bioassays. Het vermijdt de technische complexiteit zoals ultrasoonapparaat gebruikt in PMCA; het wordt ook uitgevoerd in een tape-verzegeld microplate die het risico van aërosol besmetting van elk putje minimaliseert. De multi goed indeling maakt het mogelijk de analyse van maximaal 96 monsters in hetzelfde experiment. Om het steeds terugkerende probleem van valse positieven en spontane omzetting van rPrP in de conversie in vitro testen tegen te gaan is de uitvoering van een drempel (cut-off) in RT-QuIC erg handig. Inderdaad, op basis van de resultaten van de negatieve controle (gemiddelde RFU van negatieve monsters + 5 SD 27), een basislijn wordt ingesteld waarmee discriminatie tussen de positieve en negatieve monsters kan worden gedaan. Het gebruik van vier replicatieonderzoeken voor elk monster kan dus helpen om een monster positief wanneer ten minste 50% van de duplo's een positief signaal tonen, dat wil zeggen over de licht-donkerscheiding 28. De homologie tussen zaad en substraat is niet vereist in RT-QuIC, zoals bijvoorbeeld in een eerdere studie, hamster rPrP bleek te zijn een gevoeliger substraat in vergelijking met het homologe substraat in menselijke PrPvCJD zaadjes en schapen scrapie agarvoedingsbodem reacties 29. hamster-schapen chimeer rPrP werd ook voorgesteld als een meer geschikt substraat dan menselijke rPrP te sporen van menselijke variant Creutzfeldt-Jakob prionen 30. Dus, het gebruik van rPrP substraten uit verschillende soorten is heel gebruikelijk in deze test. Deze bepaling is met succes toegepast op verschillende prionziekten, zoals de sporadische CJD 31,32,33, geneTIC prion ziekten 34,36,37van de 35,van de BSE- en scrapie 23,36CWD 38,39,40,41, 42. Studies met verwerkt cerebrospinale vloeistof, bloed, speeksel en urine zoals zaden in RT-QuIC allen succesvol waren te detecteren PrPSc 38,39,40,41, 42. ter bevordering van de detectie mogelijkheid in monsters zoals bloedplasma die remmers van amyloïde formatie bevatten kan, Orrú et al. (2011) een strategie om te verwijderen van potentiële remmers van amyloïde vorming door te kammen PrPSc immunoprecipitation (IP) stap en RT-QuIC ontwikkeld, genaamd "versterkte QuIC" assay (eQuIC). Daarnaast een substraat vervanging stap werkte na ~ 24 h van reactietijd ter verbetering van de gevoeligheid. Uiteindelijk, als laag als 1 ag voor PrPSc was aantoonbaar met eQuIC 30.

Fecale monsters verzameld in preklinische en klinische stadia van elk na experimentele mondelinge infectie waren te zuiveren van extracten van de ontlasting mogelijk assay remmers verwijderen in ontlasting, gehomogeniseerd in buffer met detergenten en proteaseinhibitors. De ontlasting-extracten werden verder ingediend bij verschillende methodologieën te concentreren PrPSc in de monsters met behulp van eiwit neerslag via natrium phosphotungstic zuur (NaPTA) neerslag. De neerslag van de NaPTA methode, voor het eerst beschreven door Safar et al. 43, wordt gebruikt om zich te concentreren PrPSc van analysemonsters. De incubatie van NaPTA met de resultaten van de steekproef in preferentiële neerslag van PrPSc in plaats van PrPC. Het moleculaire mechanisme is echter nog onduidelijk. Deze stap heeft ook geholpen dat bevat en het voorkomen van de spontane omzetting van rPrP, die in sommige gevallen wordt waargenomen. Tot slot, de ontlasting extracten zijn getest door geoptimaliseerde RT-QuIC met behulp van de muis rPrP (aa 23-231) als substraat en met inbegrip van basismateriaal vervanging in het protocol ter verbetering van de gevoeligheid van detectie.

De resultaten hier laten zien dat deze verbeterde methode zeer lage concentraties van CWD prionen detecteren kan en de gevoeligheid van de detectie- en specificiteit in fecale monsters in vergelijking met een protocol zonder neerslag en substraat vervanging van de NaPTA verhoogt. Deze methode kan worden toegepast op andere weefsels en lichaamsvloeistoffen potentieel en kan van groot nut zijn voor toezicht op CWD bij hertachtigen wild en in gevangenschap.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RT-QuIC met behulp van fecaal materiaal

de fecale homogenaat
  1. voorbereiding van cervid ontlasting wordt geëxtraheerd
    1. maken door toevoeging van 1 g van fecaal materiaal tot 10 mL van ontlasting extract buffer (20 mM natriumfosfaat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF en 1 x voltooien proteaseinhibitors, EDTA-gratis) om een eindconcentratie van 10% (m/v). De homogenisering buffer kan worden voorbereid voordat het gebruik en opgeslagen bij -20 ° C.
    2. Homogenize fecale pellets (1 g) en buffer (10 mL) in buizen (b.v., gentleMACS M buizen) met behulp van een dissociator met een vooraf ingestelde programma van de fabrikant voor eiwitten voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee tot drie keer totdat de fecale monsters zijn volledig gehomogeniseerd in de buffer.
    3. Zegel van de buizen met parafilm en plaats ze op een rockende platform of rotary shaker voor een incubatieperiode van 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. De buizen bij 18.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur Centrifugeer.
    5. Collect de supernatant die het eiwit bevatten extracten en aliquoot hen in 1,5 mL tubes. Aliquots bij-80 ° C voor verdere toepassingen kunnen worden opgeslagen.
  2. Extracten van de concentratie van PrP Sc in ontlasting
    Opmerking: om zich te concentreren CWD prionen in de ontlasting extract monsters, waardoor de gevoeligheid voor detectie door RT-QuIC, een eiwit neerslag stap is toegevoegd bij het protocol.
    1. NaPTA neerslag methode
    2. Voeg toe 250 µL van 10% (m/v) van N-lauryl dat (sarkosyl) tot 1 mL van fecale eiwit extract om een eindconcentratie van sarkosyl van 2% (v/v).
    3. Zegel van de buizen die de monsters met parafilm bevatten en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder voortdurend schudden bij 1400 t/min in een thermomixer.
    4. De mix van fecale eiwit extract en sarkosyl aanpassen met een voorraadoplossing met 10% (m/v) van natrium phosphotungstic zuur en 170 mM van magnesiumchloride, pH 7.4 te verkrijgen van een eindconcentratie van 0,3% (m/v) natrium phosphotungstic zuur in de steekproeven.
    5. Broeden van de monsters bij 37 ° C gedurende 2 uur met een constante schudden bij 400 rpm.
    6. Centrifugeren van de monsters bij 14 ° C, voor 30 min op 15.800 x g. Verwijder zorgvuldig de supernatant.
    7. Wassen van de korrels door resuspending hen in was buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, de 0,5% natrium de deoxycholate (m/v) en 0,1% sarkosyl (w/v)).
    8. Centrifugeren van de monsters bij 14 ° C, voor 15 min op 15.800 x g. Verwijder zorgvuldig de supernatant.
    9. Resuspendeer de pellets in 100 µL (1/10 van het oorspronkelijke volume van de fecale proteïne uittreksel) van RT-QuIC verdunning buffer.
      Opmerking: RT-QuIC verdunning buffer (20 mM natriumfosfaat, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) en 1 X N2 supplement) is opgesteld voorafgaand aan het gebruik. Een totaal volume van 10 mL is gefilterd via een 0,2 µm acrodisc spuit filter door middel van een spuit en vervolgens opgeslagen bij-20 ° C tot gebruik.
    10. Bewaren de monsters NaPTA behandeld bij-20 ° C tot ze met behulp van in de RT-QuIC assay.
  3. RT-QuIC assay
    1. bereiden een stamoplossing vers 10 mM Th-T (0.032 g Th-T in 10 mL dubbel gedestilleerd H 2 O).
    2. Maken van een verdunning 1:10 van de Th-T stockoplossing in dubbel gedestilleerd H 2 O het filter het door een 0,2 µm acrodisc spuit filteren met behulp van een spuit om een eindconcentratie van Th-T van 1 mM.
    3. Ontdooien muis recombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substraat (10 µg/mL per RT-QuIC reactie) opgeslagen bij -80 ° C op ice.
    4. Load 500 µL van rPrP substraat tegelijk in 100 kDa grootte uitsluiting filter slangen en centrifuge op 14.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (één buis/filter kan worden gebruikt tot twee keer).
    5. Breng het eluted substraat in een steriele 1,5 mL-buis en houd het bij 4 ° C tot gebruik.
    6. Ontdooien RT-QuIC verdunning buffer opgeslagen bij -20 ° C.
    7. Make verdunningen van het zaad (fecale eiwit uittreksel) in RT-QuIC verdunning buffer:
      Onverdund monster: het extract van de fecale eiwit onverdund gebruiken
      verdund 2 x 10 -1
      2 x 10 -2 verdund
      verdund 2 x 10 -3
    8. bereiden van stamoplossingen voor RT-QuIC reactiemengsel:
      -fosfaatgebufferde zoutoplossing ( PBS): 5 X
      NaCl: 2 M stockoplossing van NaCl bereid in dubbel gedestilleerd H 2 O.
      EDTA: 100 mM stockoplossing van EDTA bereid in dubbel gedestilleerd H 2 O.
    9. Voorafgaand aan het gebruik van alle oplossingen (stap 1.3.8), afzonderlijk doordringen elke oplossing een 0,2 µm acrodisc spuit filter door middel van een spuit en houd ze steriel bij kamertemperatuur.
    10. Bereiden een totaal volume van RT-QuIC reactiemengsel volgens het aantal monsters (98 µL hoeveelheid reactie per monster en vier repliceert per monster) plus 10% van dit volume worden gebruikt om ervoor te zorgen dat voldoende mengsel voor alle reacties.
      1. Gebruik een tube van 15 mL ter voorbereiding van de RT-QuIC reactiemengsel (20 mM natriumfosfaat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T 10 µg/mL rPrP substraat en dubbel gedestilleerd water aan te passen van de uiteindelijke rPrP-concentratie in de reactie) met behulp van de voorraad sol utions.
      2. Meng alle oplossingen goed door pipetteren op en neer met behulp van een precisiepipet met een filter-tip. Vermijd zoveel mogelijk het gebruik van de vortex.
      3. Giet het mengsel in een wegwerp pipetting reservoir van 50 mL.
      4. Gebruiken een meerkanaalspipet 98 µL van RT-QuIC reactiemengsel in ieder putje van een 96-Wells optische bodemplaat geladen.
    11. Toevoegen aan elke RT-QuIC reactie 2 µL van onverdund of 10-fold serieel verdunde fecale eiwit extract. Testen van elk monster in vier replicatieonderzoeken.
      Opmerking: In elk experiment, seriële verdunningen van fecale monsters (variërend van onverdunde tot 2 x 10 -3) van het CWD-negatief en geverifieerde CWD-positieve dieren zijn gebruikt als negatieve en positieve controles, respectievelijk.
    12. Zegel van de plaat met een afdichtende tape voordat het broeden in een afleesapparaat bij 42 ° C gedurende 25 h met herhaalde cycli van 1 min dubbele orbitale schudden (700 rpm) en 1 min rusten tijdens de incubatie.
    13. Definiëren fluorescentie meting instellingen:
      Excitatie: 450 nm
      uitstoot: 480 nm
      onder lezen, aantal flitsen: 20
      handmatige winst: 1000 (afhankelijk van de machine)
      integratie tijd: 20 µs
    14. verwijderen de plaat uit de lezer van de plaat aan het einde van de 25 h.
    15. Spin naar beneden de plaat bij 3000 x g gedurende 3 minuten om te voorkomen dat potentiële verontreiniging tussen de putjes.
    16. Verwijderen van het zegel van de plaat.
    17. Een nieuwe 96-wells-plaat voor te bereiden door het toevoegen van 90 µL van RT-QuIC reactiemengsel met verse substraat en verse fluorescentie kleurstof Th-T als beschreven in punt 1.3.1 aan 1.3.6.
    18. Transfer 10 µL van elk putje van de eerste plaat aan de onlangs bereid 96 goed plate.
    19. Zegel van de nieuwe plaat en blijven de RT-QuIC assay voor extra 50 h de procedure die wordt beschreven in stap 1.3.13. Deze extra stap van 50 h zal de totale reactietijd van 75 h.
      Opmerking: Alle procedures van RT-QuIC assay zijn gedaan onder bioveiligheid kabinet.
    20. De gegevens te verzamelen.
      1. Lezen en document het signaal van de fluorescentie Th-T van elk putje elke 15 minuten
      2. Gegevens verzamelen van totale cycli met gebruik van Data-analyse software en overdracht in een spreadsheet met het gemiddelde van de quadruplicate reacties.
      3. Plot de gemiddelden van de gegevens. De x-as komt overeen met de reactietijd van RT-QuIC (h) en de y-as komt overeen met de relatieve fluorescentie eenheden (RFU). Elke kromme komt overeen met een verdunning van een bekend monster.
      4. In elk experiment, bakenen een drempel door het berekenen van de hoogste gemiddelde waarden van de negatieve controle plus 5 standaarddeviaties zoals beschreven in de huidige gepubliceerde literatuur 41.
        OPMERKING: Alle replicatieonderzoeken die de gedefinieerde drempel overschreden worden als positief beschouwd. Als ten minste twee van de vier replicatieonderzoeken Kruis de drempel, het monster wordt vervolgens als positief beschouwd.

2. Zuivering van Recombinant Prion-eiwit (rPrP)

  1. groei van bacteriële materieel en expressie van rPrP
    Opmerking: de Escherichia coli (E. coli) stam Rosetta (DE3) getransformeerd met vector huisdier-24 codering de muis PrP (residuen 23-231) werd gebruikt voor het bereiden van het rPrP.
    1. Ontdooien glycerol voorraad van Rosetta (DE3) getransformeerd met huisdier-24 mPrP(23-231) op ice.
    2. Streak LB (Luria Bertani) platen met een eindconcentratie van kanamycine 50 µg/ml en na een nacht bebroeden in een 37 ° C incubator. Zorg ervoor dat de platen ondersteboven om te voorkomen dat de condensatie van vochtigheid in de vaste voedingsbodems met de bacteriën. Bereiden van twee platen moet ervoor zorgen dat de groei in ten minste één van de twee platen.
    3. Bereiden 1 L van LB en autoclaaf te maken het steriele.
    4. Supplement 1 L van steriele LB-media met 1 mL kanamycine (50 mg/mL) en 1 mL van chlooramfenicol (34 mg/mL).
    5. Halen één kolonie van elke plaat met behulp van een wegwerp inoculatie-lus om te enten van 3 mL LB opslagmedium met kanamycine en chlooramfenicol.
    6. Plaats de mini-culturen in een incubator bij 37 ° C, met constante schudden bij 225 t/min voor 5-6-h.
    7. Toevoegen van de mini-culturen aan de rest van de oorspronkelijke 1 l van LB-media samen met Express Autoinduction System 1 voor inductie van eiwit expressie.
    8. Plaats de cultuur in de maatkolf van 2 L of groter, in een incubator bij 37 ° C, met constante schudden bij 200 t/min voor 20-24 h.
    9. De cultuur 1 L gesplitst in 4 x 250 mL centrifuge buizen.
    10. Spin down de buizen met de cultuur bij 3.750 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Verwijder het supernatant en verzamelen de bacteriële pellets in 50 mL centrifuge buizen, dan bevriezen ze bij-80 ° C totdat zij worden verwerkt. De resulterende pellets heb gewogen 3 tot en met 4 g voor een goede eiwit opbrengst.
  2. Voorbereiding van integratie lichaam
    1. ontdooien van de bevroren pellet (3 tot en met 4 g) bij 37 ° C gedurende enkele minuten.
    2. De pellet één meer tijd voor 10 min bij-80 ° C bevriezen en ontdooien weer. Herhaal deze stap voor bevriezen en ontdooien van twee meer tijden.
    3. Resuspendeer de bacteriële pellet in 1 X lysis reagens (b.v. BugBuster Master Mix) door pipetteren grondig. Gebruik 5 mL van het reagens voor 1 g van bacteriële pellet. Zorg ervoor dat u volledig de mix meng.
    4. Het homogenaat op een rocker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    5. Het homogenaat bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur Centrifugeer.
    6. Gooi het supernatant door het zorgvuldig af te gieten
    7. De pellets in hetzelfde volume 1 X lysis reagens zoals gebruikt in de vorige stap homogeniseren.
    8. Het homogenaat gedurende 15 minuten op een rocker bij kamertemperatuur incuberen.
    9. Toevoegen van een voldoende volume van 1:10 (0.1 x) lysis reagens om een totale homogenaat volume van 40 mL. Meng door inversie ervoor te homogeniseren goed.
    10. Het homogenaat bij 7.900 x g gedurende 15 min Centrifugeer bij 4 ° C.
    11. Verwijder het supernatant door zorgvuldig gieten it.
    12. Resuspendeer de pellet in 40 mL 0,1 x lysis reagens.
    13. Het homogenaat bij 16.000 x g gedurende 15 min Centrifugeer bij 4 ° C.
    14. Verwijder het supernatant zorgvuldig door het gieten en opslaan van de pellet met de integratie-organen bij-20 ° C totdat zij worden verwerkt.
  3. Eiwitreiniging
    1. de integratie-organen op kamertemperatuur ontdooien.
    2. Los van de ontdooide integratie-organen in 14 mL 8 M guanidine-HCL (38 g Guanidine waterstofchloride in 0,1 M NaPO 4 pH 8,0 en vul de vering met H 2 O tot 50 mL; pH op definitieve oplossing niet aanpassen) aan eiwitten solubilize.
    3. Zorg ervoor dat u meng goed door omhoog en omlaag pipetteren.
    4. Incubate de lysate op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 50 minuten
    5. Bereiden 18 g Ni-NTA hars kralen (18 g voor 3 tot 4 g bacteriële pellet); spoel ze af met 100 mL water met behulp van vacuüm en een 100 mL 0,22 µm fles top filter.
      1. Plaats van de 18 g van Ni-NTA harsparels in tube 50 mL en voeg voldoende hoeveelheid denaturering van de buffer (100 mM natriumfosfaat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine hydrochloride, pH 8) zodat het uiteindelijke volume op 50 mL.
      2. De kralen in de denatureren buffer voor 50 min op een rocker bij kamertemperatuur equilibreer.
    6. De integratie lichaam lysate bij 16.000 x g gedurende 5 min voor het verwijderen van de onoplosbare puin Centrifugeer.
    7. Het supernatant toevoegen aan de equilibrated kralen en zich ontdoen van de pellets.
    8. Zet de mix op een rocker gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur toe binding aan eiwitten te Ni-NTA hars.
      Opmerking: Nikkel chelate kralen worden gebruikt voor het zuiveren van PrP door haar nikkel affiniteit. De regio van de N-terminale histidine-rijk van PrP maakt de affiniteit met nickel(II), waarmee het eiwit te binden aan nikkel ionen zonder enige zijn-tag.
    9. FPLC van het wassen met water om schoon uit beide lijnen (A en B).
    10. Uitvoeren van denatureren buffer (100 mM natriumfosfaat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidine hydrochloride, pH 8) via beide lijnen (A en B) naar prime van het systeem (de kolom is nog niet bijgevoegd.)
    11. Laden de hars op kolom. Zorg ervoor om te minimaliseren van luchtbellen.
    12. De kolom toevoegen aan de FPLC en loopt van een lineair verloop van 100% denaturering buffer A en 0% voor uiteinde buffer B (natriumfosfaat 100 mM, 10 mM Tris, pH 8,0) aanvankelijk tot 0% denaturering buffer en 100% uiteinde buffer tegen het einde. Deze geleidelijke verschuiving wordt uitgevoerd bij een debiet van 0,75 mL/min voor 240 min en is nodig voor de juiste vouwing van PrP.
      Opmerking: Tijdens de chromatografische zuiveringsproces, de gedenatureerde PrP is eerst langzaam refolded op de hars door een lineair verloop voor uiteinde buffer ter vervanging van de denatureren buffer toe te passen. Deze stap verwijdert u ook de chaotropic guanidine-HCl.
    13. Zorg ervoor dat 100% uiteinde buffer blijft doorstromen naar de kolom voor een extra 30 min op 0,75 mL/min.
    14. Rinse lijn A met water gevolgd door elutie buffer (100 mM natriumfosfaat, 10 mM Tris, 500 mM imidazool, pH 5,8) omzeilen van de kolom. Dit zal de denatureren buffer die nu door de elutie buffer in het systeem van AKTA vervangen is leeghalen.
    15. Elute eiwit op 2 mL/min. door het uitvoeren van een lineair verloop voor 40 min van 100% uiteinde buffer B en 0% elutie buffer A aanvankelijk op 0% uiteinde buffer en buffer van 100% elutie.
      Opmerking: De hoge concentratie van imidazool in elutie buffer zal concurreren PrP ' s binding aan de nickel(II). De piek van de primaire eiwit moet beginnen te elueren ongeveer 1/3 van de weg door het verloop.
      1. Bekijk chromatografische voor OD 280 nm toe.
    16. Verzamelen alleen de buizen die de eiwitten in het midden van de grote piek bevatten.
      Opmerking: De eluted breuken van elk 2 mL worden verzameld in buizen van 15 mL.
    17. De proteïne die zijn opgenomen in de buizen onmiddellijk met ongeveer 1/3 volume (1 mL) verdund voor dialyse buffer (10 mM natriumfosfaat, pH 5,8).
    18. Onmiddellijk het plaatsen van de buizen op ice.
    19. Pool van de eluted eiwitten die zijn opgenomen in de buisjes.
    20. Arme het eiwit in dialyse Cassettes (moleculair gewicht cut-off 10 kDa).
    21. Zet de cassettes in vooraf gekoeld dialyse buffer (3,6 L) gedurende 2 uur bij 4 ° C, dan breng de cassettes in een verse dialyse buffer (3,6 L) voor overnachting. Maken ervoor dat de buffer van de dialyse onder constante agitatie is.
    22. Eiwit na dialyse filtreer door een 0,2 µm acrodisc spuit filter met behulp van een injectiespuit.
    23. Meten van de met behulp van een BCA eiwit assay kit eiwitconcentratie.
    24. Concentraat of indien nodig aan te passen de eiwitconcentratie tot 0.3 mg/mL verdund.
      Opmerking: Bevestigen zuiverheid door SDS-pagina en Coomassie Blue kleuring.
    25. Maken van 1 mL aliquots van eiwit in microcentrifuge buizen en onmiddellijk een bewaren bij-80 ° C tot verder gebruik, zoals beschreven in het protocol van de RT-QuIC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De CWD fecale extracten, bereid op 10% (m/v) waren in staat om het zaad van de RT-QuIC reactie, maar de gevoeligheid van detectie was laag 27. Met behulp van een specifieke buffer voor fecale homogenisering was een belangrijke stap om te voorkomen dat hoge achtergrond fluorescentie in RT-QuIC reacties die daarmee gepaard gaande zijn op het gebruik van muis rPrP substraat in plaats van herten rPrP waardoor om meer specifieke resultaten 27. De...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-QuIC was eerder werkzaam voor de opsporing van CWD prionen in urine en fecale extracten van mondeling besmette Witstaarthert en Muildierhert 38. Het systeem dat is afgebeeld in dit manuscript is een aangepaste methode van de RT-QuIC assay. Extra stappen werden ingelijfd bij de "klassieke" RT-QuIC assay de detectie en de gevoeligheid van de test voor CWD prionen in fecaal materiaal van besmette dieren te verbeteren.

De lage gevoeligheid voor detection in ontlasting ex...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan Dr Byron Caughey (NIH Rocky Mountain laboratoria) voor het verstrekken van opleiding en het cervid PrP bacteriële expressie plasmide. SG wordt ondersteund door het programma van de Canada Research Chair. Wij erkennen dat financiering voor dit onderzoek met SG van genoom Canada, Alberta Prion Research Institute en Alberta land- en bosbouw door genoom Alberta, en de Universiteit van Calgary ter ondersteuning van dit werk. Wij erkennen een onderzoeksbeurs van de Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen
Acrodisc seringe filtersPALL4652
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter UnitMilliporeUCF901024
BD 10 ml seringeVWRCA75846-842
ChloramfenicolSigma-AldrichC0378
Corning bottle-top vacuum filtersSigma-Aldrich431118
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-AldrichE4884
GentleMACS M TubeMiltenyi Biotec130-093-236
Guanidine hydrochlorideSigma-AldrichG4505
ImidazoolSigma-AldrichI5513
IsopropanolSigma-AldrichI9516
Kanamycin sulfateSigma-Aldrich60615
Luria-Bertani (LB) bouillonThermoFisher Scientific12780029
Magnesium chlorideSigma-AldrichM9272
N2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific15502048
N-lauroylsarcosinatriumzout (sarkosyl)Sigma-AldrichML9150
Nanosep centrifugale apparaten met omega membraan 100KPALLOD100C34
Nunc afdichtingstapesThermoFisher Scientific232702
Parafilm MVWR52858-000
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626
Protease inhibitor tabletRoche4693159001
NatriumchlorideSigma-AldrichS3014
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Calbiochem7910-OP
NatriumfosfaatSigma-Aldrich342483
Natriumfosfaat dibasisch watervrijSigma-AldrichS9763
Natriumfosfaat monobasisch monohydraatSigma-AldrichS9638
Natriumfosfowolframaathydraat (NaPTA)Sigma-Aldrich496626
Thioflavine TSigma-AldrichT3516
Tris-hydroxymethylaminomethaan (Tris)Sigma-AldrichT6066
Triton-100Calbiochem9410-OP
Tween 20Sigma-AldrichP7949
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Commerciële buffers en oplossingen
BugBuster Master MixNovagen71456-4
Ni-NTA superflowQiagen1018401
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (1X)Life TechnoligiesP5493
UltraPure Gedestilleerde WaterInvitrogen10977015
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Standaarden en commerciële kits
Express Autoinduction System 1Novagen71300-4
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuuropstelling
AKTA-eiwitzuiveringssystemen FPLCGE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 CentrifugeBeckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplaatlezerBMG Labtech
GentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
MARS Data AnalysisBMG Labtech
GraphPad Prism6GraphPad software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835(2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88(2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93(2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848(2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187(2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915(2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983(2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377(2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203(2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488(2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277(2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116(2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van CWD prionenanalyse van fecaal materiaalprecipitatie met natriumfosfotungstaatthioflavine T fluorescentie assayrecombinant prioneiwitsubstraatChronic Wasting Diseasefecale monsters van cervidenprion seeding activiteithigh throughput screening

Gerelateerde artikelen