Methodenartikel

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

31 augustus 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is te isoleren van herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA van geïnfecteerde cellen voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten door massaspectrometrie. Hoewel eiwitten die met virale genoom samenwerken belangrijke rol spelen bij de bepaling van het resultaat van een infectie, was een uitgebreide analyse van het virale genoom geassocieerde eiwitten niet eerder mogelijk. Hier tonen we een methode waarmee de directe zuivering van HSV-1 genomen van geïnfecteerde cellen. Repliceren viraal DNA heet selectief met gemodificeerde nucleotiden die een alkyn functionele groep bevatten. Gelabelde DNA is vervolgens specifiek en onherroepelijk gelabeld via de covalente bevestiging van biotine azide via een koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie of klik op reactie. Biotine-gelabeld DNA wordt gezuiverd op daar beklede kralen en geassocieerde eiwitten zijn geëlueerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie. Deze methode maakt het mogelijk selectief richten en isolatie van HSV-1 replicatie vorken of hele genoom van complexe biologische omgevingen. Aanpassing van deze aanpak zal bovendien zorgen voor het onderzoek van verschillende aspecten van herpesviral infectie, evenals het onderzoek van het genoom van andere DNA-virussen.

Inleiding

Virussen hebben een beperkte capaciteit om essentiële functies vervullen en dus afhankelijk van gastheer factoren om kritieke aspecten van infectie met inbegrip van virale genexpressie, replicatie, reparatie, recombinatie en vervoer. De activiteiten van deze host factoren zijn vaak aangevuld met viraal gecodeerde eiwitten. Daarnaast moeten virussen opsporen en interferentie voorkomen door cellulaire reacties op virale infectie. Daarom, virus-gastheer interacties dicteren de uitkomst van de infectie. Van het allergrootste belang is het begrijpen hoe virussen veranderen de cellulaire omgeving aan te passen van de cellulaire machines om virale processen. Van bijzonder belang is het identificeren welke factoren en processen op virale genoom gedurende de besmettelijke cyclus handelen.

Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) is dat een double strandde DNA-virus dat een aanzienlijk deel van de menselijke bevolking infecteert. Binnen het eerste uur van infectie treedt het virale genoom de kern, waar een geordende opeenvolging van virale genexpressie ensues in coördinatie met virale replicatie van het DNA (vDNA)1. In de kern, genomes gelden Epigenetische regulatie, reparatie en recombinatie ondergaan en worden verpakt in capsids, zodanig dat de eerste nakomelingen virionen worden geproduceerd binnen minder dan zes uur. De uitgebreide evaluatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten in de loop van de infectie zal leggen de basis voor het onderzoek naar de moleculaire details van processen die handelen op virale genoom, en geven inzicht in welke virale en cellulaire factoren zijn betrokken in verschillende stadia van de infectie.

Vorige methoden voor het onderzoek van gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie zijn affiniteit zuivering van virale eiwitten voor de analyse van de bijbehorende cellulaire eiwitten2,,3,,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. deze testen zijn instrumentale voor de identificatie van cellulaire factoren die betrokken zijn in host antivirale reacties, evenals virale chromatin wijziging, genexpressie, en DNA herstellen. Het is echter moeilijk om na te gaan of interacties afhankelijk zijn van de associatie met vDNA, en proteomics alleen bieden inzicht in interacties die als een functie van een specifieke virale factor plaatsvinden. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is gebruikt om te bepalen waar specifieke virale en cellulaire proteïnen binden aan virale genoom10,11,12,13,14 , 15 en Fluorescente kruising in situ (vissen) gecombineerd met immunocytochemie heeft de visualisatie van cellulaire factoren die colocalize met vDNA16,17,18, 19 , 20. deze gehaltebepalingen toestaan voor ruimtelijke en temporele analyse. Beperkingen bevatten echter de behoefte aan zeer specifieke antilichamen, beperkte gevoeligheid, en de noodzaak voor vorige inzicht in virus-gastheer interacties. Daarom ontwikkelden we een methode gebaseerd op de iPOND (isolatie van proteïnen op ontluikende DNA)21 en aniPOND (versnelde native iPOND)22 te selectief label en te zuiveren van vDNA van geïnfecteerde cellen voor de onbevooroordeelde identificatie van virale genoom geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie. iPOND behulpzaam voor het onderzoek van cellulaire replicatie vork dynamiek geweest.

Voor de selectieve zuivering van het virale genoom van geïnfecteerde cellen, met ethynyl bewerkt nucleosiden, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) of 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figuur 1), gevolgd door covalente repliceren vDNA heet vervoeging aan biotine azide via Klik op chemie om één stap zuivering van het virale genoom en geassocieerde eiwitten op daar beklede kralen (figuur 2B). Bovenal worden infecties uitgevoerd in stationaire cellen, die niet met cellulaire DNA-replicatie bezighouden zich om specifieke etikettering van vDNA. Bovendien, HSV-1 infectie veroorzaakt celcyclus arrestatie en remt cellulaire DNA replicatie23,24. Virus kan worden prelabeled voordat de infectie voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan binnenkomende virale genoom (figuur 1A) of label tijdens de replicatie van DNA voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan nieuw samengestelde vDNA (figuur 1B) 25. Bovendien pulse chase analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken van de aard van de eiwitten verbonden met de virale replicatie vorken (Figuur 1 c)26. Daarnaast kan ethynyl gemodificeerde vDNA covalent zijn geconjugeerd met een fluorophore voor ruimtelijke onderzoek van eiwit dynamiek (figuur 2A en Figuur 3). Imaging zorgt voor de directe visualisatie van vDNA is een gratis benadering voor de validatie van vDNA-eiwit interacties en kan worden aangepast aan het virale genoom gedurende infectie bijhouden. Wij verwachten dat deze aanpak verder kunnen worden gewijzigd om te studeren van enig aspect van herpesviral besmetting, met inbegrip van latentie en reactivering, en te bestuderen of andere DNA-virussen. Bovendien, labelen met 5-ethynyl uridine (EU) voor de analyse van het virale genoom RNA kan leiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. celcultuur, virale infectie en EdC Labeling ( Figuur 1)

het volgende protocol omvat werken met virussen. Gelieve te verwijzen naar uw instelling ' s bioveiligheid protocollen over veilig omgaan met virussen en andere biologische agentia. Dit protocol is goedgekeurd door de institutionele Review Board van de Universiteit van Pittsburgh.

  1. Trypsinize een confluente 150 cm 2 weefselkweek kolf met MRC-5 cellen en de cellen overbrengen in een 600 cm 2 weefselkweek plaat met 100 mL DMEM plus 10% FBS. Incubeer bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2 voor 3-4 dagen te bereiken confluency en stationaire fase. Een confluente 600 cm 2 schotel bevat ~ 7 x 10 7 cellen. Bereiden 1 plaat voor elke voorwaarde en 1 plaat voor elke overeenkomstige negatieve controle.
    Opmerking: Cellen moeten het bereiken van de stationaire fase om te remmen cellulaire DNA-replicatie om ervoor te zorgen dat alleen vDNA is gelabeld en gezuiverd in opeenvolgende stappen.
    Opmerking: Elk monster vereist een gratis ongelabelde negatieve controle opgesteld op basis van de dezelfde voorwaarden van de infectie en het tijdstip zonder de toevoeging van EdC.
    Opmerking: De A verkleinde versie van dit experiment moet worden uitgevoerd in tandem om te testen voor de etikettering van cellulaire DNA door beeldvorming met behulp van vergelijkbare celgroei, infectie, EdC voorwaarden, labelen en tijd punten (zie stap 2).
  2. Verdund 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL koude Tris-Buffered Saline (TBS). Groeimedium verwijderen en opslaan bij 37 ° C. Infecteren, de 7-mL verdunde virus op MRC-5 cellen toevoegen en rock gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Volgende adsorptie, verwijderen van entmateriaal, spoelen met 50 mL kamertemperatuur TBS en vervangen de originele groeimedium. Incubeer bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2. Deze stap moet worden uitgevoerd voor elke experimentele conditie en negatieve controle.
    Opmerking: Verhoogde EdC labeling kan worden bereikt met HSV-1 mutanten met gebreken voor de uitdrukking van de virale dUTPase (UL50-gen) en/of uracil glycosylase (UL2-gen). HSV-1 dUTPase heeft lage substraat specificiteit en kan verminderen de activering van verschillende nucleoside analogen 25 , 27.
  3. Label virale genoom met EdC. Volg de aanwijzingen om inkomende genoom (1.3.1.), repliceren genoom (1.3.2.), of virale replicatie vorken (1.3.3.) van een label.
    Opmerking: De enige stap 1.3.1, 1.3.2 en 1.3.3 moet worden uitgevoerd afhankelijk van of binnenkomende genoom, gerepliceerde genoom of replicatie vorken moeten worden geanalyseerd in opeenvolgende stappen, respectievelijk.
    Opmerking: EdU of f-ara EdU kan worden vervangen voor EdC. De toxiciteit van nucleoside-analogen moet worden gecontroleerd en worden geminimaliseerd.
    1. Gebruik prelabeled bestanden uit infectie in stap 1.2 te voeren en gaat u verder met stap 2 of 3 binnen 4 uur na infectie (hpi) om te onderzoeken niet-gerepliceerde vDNA ( figuur 1A).
      Opmerking: Bereiden prelabeled virus bestanden met behulp van de eerder beschreven protocol 25. Virusvoorraden moeten worden doorgegeven door middel van een G-25 kolom te verwijderen van alle resterende EdC.
    2. Label replicerende vDNA door toevoeging van 5-25 µM EdC aan het kweekmedium cel van geïnfecteerde cellen voor 2-4 h ( figuur 1B). Voordat u toevoegt, Verdun EdC in 1 mL groeimedium.
    3. Op het etiket van virale replicatie vorken, na het begin van de replicatie van de vDNA (≥ 4 hpi), pulse label repliceren vDNA met 5-25 µM EdC voor 5-20 min. Om te jagen, 3 x spoelen met chase medium met 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), en vervolgens in aanwezigheid van chase medium voor een extra 20-40 min ( Figuur 1 c) incuberen.
      Opmerking: Pulse en chase medium tot 37 ° C en 5% CO 2 vóór gebruik moet worden geëquilibreerd.
      Opmerking: Voor puls chase experimenten, het is belangrijk om te overwegen de hoeveelheid tijd die nodig is voor nucleosiden in te voeren van de cel en worden phosphorylated voordat ze kunnen worden opgenomen in het repliceren van DNA. Dit moet worden bepaald empirisch.
      Opmerking: Om te bepalen van de resolutie van pulse chase experimenten, bereken het percentage van de virale replicatie onder de experimentele omstandigheden gebruikt. Dit kan worden bepaald door de kwantitatieve PCR van het virale genoom tijdens een enkele stap groei tijd cursus 26.
      Opmerking: Voor het virale genoom imaging gaat u verder met stap 2 en voor de zuivering van het virale genoom gaat u verder met stap 3.

2. Beeldvorming van EdC label DNA ( figuur 2A)

Opmerking: het is handig om uit te voeren imaging in tandem met de virale genoom zuivering methode om te verifiëren dat cellulaire DNA is niet het label in experimenten. Beeldvorming kan ook worden gebruikt om te visualiseren van de aard van gelabelde vDNA en om proteomics gegevens te valideren. Voorbeelden van cellulaire en virale DNA kleuring patronen zijn afgebeeld in Figuur 3.

  1. Verrichten van infecties en EdC labeling zoals aangegeven in stap 1 behalve gebruik geschaald voorwaarden op coverslips in een 12-well weefselkweek schotel met 1 mL groeimedium.
  2. Fix cellen met 1 mL 3,7% paraformaldehyde in 1 x PBS gedurende 15 minuten op RT. Na fixatie, cellen spoelen 2 x met 1 mL 3% BSA in PBS.
    Let op: Paraformaldehyde kan ernstige of blijvende schade veroorzaken. Volg veiligheid voorzorgsmaatregelen.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en coverslips kan worden achtergelaten bij 4 ° C in de tweede wasbeurt maximaal 3 dagen.
  3. Permeabilize cellen met 1 mL permeabilization buffer [Zie Tabel of Materials] gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken.
  4. Spoel met 1 mL 3% BSA en vervolgens blok met 1 mL 3% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken.
  5. , Voeg 1 mL van de klik reactie cocktail [Zie Tabel of Materials] aan coverslips aan covalent conjugaat Alexa Fluor 488 azide aan EdC label DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl het schommelen. Gecombineerd en spoel tweemaal met 1 mL PBS.
  6. Vlek cellulaire DNA met 1 mL van een verdunning van de 1:2,000 van Hoechst in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het rocken. Gecombineerd en spoel tweemaal met 1 mL PBS.
  7. Vlek met primaire en secundaire antilichamen volgens norm indirecte immunofluorescentietest protocollen 25.
    Opmerking: Gelabelde vDNA colocalizes met ICP8, ICP4 of UL42 en label cellulaire DNA colocalizes met Hoechst vlek.
  8. Mount coverslips in dia's en afbeeldingen van cellen met behulp van een fluorescentie Microscoop.
    Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor verscheidene weken.

3. Zuivering van vDNA en geassocieerde eiwitten

Opmerking: verschillende aspecten van dit protocol zijn aangepast vanaf Leung et al. 22
Opmerking: alle buffers en reagentia moeten worden gekoeld op ijs vóór gebruik en alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs behoudens andersluidende.

  1. Oogst kernen.
    Opmerking: Voor isolatie van kernen, formaldehyde kan worden gebruikt voor dwarslijn eiwitten aan DNA. Strengere voorwaarden voor wassen kunnen vervolgens worden gebruikt tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de DNA op daar beklede kralen. Voor crosslinking en wastafel voorwaarden zie Sirbu et al. 21.
    1. groeimedium vervangen door 20 mL kernen extractie Buffer (NEB) en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C met occasionele rockende. Kernen zal zichtbaar zijn in de Microscoop.
    2. Kernen van de plaat met behulp van een cel schraper Schraap en transfer naar een conische tube van 50 mL. Centrifugeer gedurende 10 min bij 2.500 x g bij 4 ° C tot pellet kernen, verwijder het supernatant.
      Opmerking: Trypan blauw kleuring kan worden gebruikt om te controleren of het isolement van de kernen van cellen.
    3. Voorzichtig verjagen de nucleaire pellet in 10 mL PBS, overdracht naar een conische buis 15 mL, and -pellet door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen PBS.
      Opmerking: Kernen kunnen worden bevroren en het protocol op dit punt kan worden onderbroken. Om dit te doen, zachtjes resuspendeer de pellet van nucleaire in 500 µL bevriezing buffer en de buis in een ijsbad ethanol/droog uit te broeden. Opslaan van de kernen van de bevroren bij-80 ° C. Vóór gebruik, kernen op kamertemperatuur ontdooien en snel overbrengen van ijs en voeg 10 mL PBS, rock voorzichtig te mengen, pellet door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C, PBS volledig te verwijderen. Bevriezing van de kernen kan leiden tot verminderde opbrengst.
  2. Covalent geconjugeerde Biotine-azide aan EdC label vDNA.
    1. Resuspendeer de nucleaire pellet in 10 mL Klik reactie Meng [Zie Tabel of Materials] door zachtjes op en neer pipetteren 5 keer met een pipet 10 mL.
      Opmerking: Het is belangrijk dat de reagentia opgenomen in de klik reactie mix worden toegevoegd in de aangegeven volgorde.
    2. Draaien gedurende 1 uur bij 4 ° C. Terwijl het draaien van bereiden en chill Buffers B1, B2 en B3 [Zie Tabel of Materials].
    3. Pellet kernen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen Klik op reactie mix en wassen van de pellet door zachtjes resuspending in 10 mL PBS en centrifugeren voor 10 min bij 2.500 x g bij 4 ° C.
    4. Voorzichtig resuspendeer de nucleaire pellet in 1 mL PBS en overdracht aan een 1,5 mL microfuge buis met behulp van een grote boring pipette uiteinde. Pellet kernen door centrifugeren voor 10 min op 2.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen PBS en flash bevriezing in vloeibare stikstof.
      Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden onderbroken en bevroren kernen kunnen worden achtergelaten bij-80 ° C. Freeze dooi helpt met latere lysis, dus het is aangeraden dat de kernen worden flash bevroren zelfs wanneer u stap 3.3 op dezelfde dag.
  3. Lyse kernen en fragment van DNA.
    1. Kernen op ijs ontdooien en resuspendeer in 500 µL Buffer B1 door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer op ijs voor 45 min.
    2. Sonicate monsters 6 keer voor 30 s, elke bij 40% amplitude met behulp van een 3 mm microtip sonde. Leg monsters op ijs voor 30 s tussen pulsen. Na ultrasoonapparaat, moeten de monsters verschijnen duidelijk, niet bewolkt.
      Opmerking: Ultrasoonapparaat voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor individuele sonicators. Voor gedetailleerde instructies over hoe te optimaliseren ultrasoonapparaat voorwaarden verwijzen naar Leung et al. 22.
    3. pellet cel puin door centrifugatie bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De grootte van de pellet moet aanzienlijk afnemen. De bovendrijvende vloeistof filteren door 100 µM cel zeef en behouden van de stroom door.
    4. Voeg toe 500 µL Buffer B2 naar de gefilterde supernatant. 900 µL van dit voorbeeld zal worden gebruikt in stap 3.4.2.
    5. Nemen een aliquoot gedeelte van elke voorwaarde voor DNA isolatie (50 µL of 1/20e volume) en voeg 50 µL 2 x SDS-bicarb oplossing [Zie Tabel of Materials]. Gaat u verder met het DNA isolatie protocol (stap 3.6).
    6. Nemen een aliquoot gedeelte van elke voorwaarde voor input eiwit (50 µL of 1/20e volume) en voeg 50 µL 2 x Laemmli monster buffer, bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C. gebruik in stap 3.5.6.
  4. Bind biotinyleerd DNA aan daar gecoat kralen.
    1. Bereiden daar T1 magnetische kralen door 300 µL van kraal drijfmest te brengen naar een 1,5 mL microfuge buis. Één buis van kralen per monster te bereiden. Wash kralen 3 x met 1 mL Buffer B2 door vortexing aan resuspendeer, een magneet om te scheiden van de parels toe te passen en het was buffer aspirating.
      Opmerking: Geoptimaliseerd bindende voorwaarden resultaat in gemaximaliseerd rendement en bindende minimale achtergrond. Het was experimenteel bepaald dat streptavidine T1 magnetische kralen een aanzienlijk grotere bindingscapaciteit dan agarose kralen, evenals andere daar kralen, en hebben minder achtergrond bindend dan streptavidine C1 kralen ( figuur 4A ).
    2. Toevoegen 900 µL van monster uit stap 3.3.4. aan de gewassen kralen en draaien 's nachts bij 4 ° C.
      Opmerking: Niet vortex kralen doen zodra het monster is toegevoegd aan hen.
      Opmerking: Als significante hoeveelheden DNA of eiwit in de labelloze negatieve controle worden geïsoleerd, deze stap kan worden teruggebracht van overnachting tot 4 h te verminderen achtergrond bindende.
  5. Wassen van kralen en elueer vDNA en bijbehorende eiwitten.
    Opmerking: Het is aanbevolen om het filter tips gebruiken voor de resterende stappen.
    1. Plaats monsters in een magnetische microfuge buis rack, verwijderen supernatant, zachtjes resuspendeer in 1 mL Buffer B2, draaien bij 4 ° C gedurende 5 minuten
    2. Herhaal stap 3.5.1 driemaal.
    3. Leg de monsters in een magnetische microfuge buis rack, bovendrijvende vloeistof verwijderen, voorzichtig resuspendeer in 1 mL Buffer B3, en bij 4 ° C gedurende 5 min. draaien
    4. Transfer 100 µL kraal mengsel (1/10 th volume) aan een nieuwe buis voor afhankelijke DNA isolatie. Deze buis van toepassing op de magneet, bovendrijvende vloeistof verwijderen, resuspendeer kralen in 100 µL 1 x SDS-bicarb oplossing en gaat u verder met het DNA isolatie protocol (stap 3.6).
    5. Toepassing van de buis met de resterende 900 µL kraal mengsel uit stap 3.5.3. aan de magneet, verwijder supernatant en resuspendeer kralen in 50 µL 2 x Laemmli monster buffer Elueer eiwitten en DNA-eiwitcomplexen.
    6. Kook monsters bij 95 ° C gedurende 15 min, vortex, snel draaien in de microfuge, en toepassen van de magneet. Eluaat overbrengen in een nieuwe buis, flash bevriezen en winkel op -80 ° C.
      Opmerking: Gebruik GLB sloten om ervoor te zorgen dat de buizen niet doen pop openen terwijl kokend.
      Opmerking: Het protocol kan op dit moment worden gepauzeerd en monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor verscheidene weken.
    7. EiwitSteekproeven analyseren door Coomassie Blue kleuring, westelijke bevlekken of Spectrometrie van de massa door standaardprocedures 25. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5.
      Opmerking: Om te bepalen als eiwit opbrengst voldoende voor massaspectrometrie is, 7,5 µL van elk monster wordt gebruikt voor analyse door Coomassie Blue kleuring en 7,5 µL voor het westelijke bevlekken van een representatieve virale genoom geassocieerde eiwit (ICP4, ICP8 of UL42). Dezelfde hoeveelheid lysates uit stap 3.3.6. besturingselement voor invoer eiwitniveaus worden naast uitgevoerd. Het resterende monster (35 µL) wordt vervolgens geanalyseerd door massa spectrometrie zoals eerder beschreven 25.
  6. DNA isolatie
    1. broeden de monsters uit stappen 3.3.5. en 3.5.4. bij 65 ° C gedurende 4-16 h. verwijderen proeven van magnetische kralen, zonodig.
    2. Pak monsters met 150 µL fenol: chloroform: Isoamylalcohol (PCI) en de waterfase overbrengen in een nieuwe buis.
    3. Extract van de resterende PCI met 100 µL Tris-EDTA (TE) en de waterfase toevoegen aan een nieuwe buis.
    4. Extract monsters met 200 µL chloroform: Isoamylalcohol (24:1).
    5. Zuiveren de waterige fase met behulp van de PCR zuivering Kit volgens de fabrikant ' s-protocol.
      Opmerking: De pH-indicator in de Buffer PB kom paarse wanneer toegevoegd aan het monster. Voeg 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5.0 te verlagen de pH van het monster.
    6. DNA bepalen concentratie met behulp van een fluorescentiespectroscopie.
      Opmerking: Dit protocol levert meestal 100-400 ng kraal-gebonden DNA. Geen DNA moet worden gedetecteerd in het eluaat van de negatieve controle waarin EdC niet werd toegevoegd in stap 1.3.
    7. DNA kan worden opgeslagen in een lage DNA-bindende tube op 4 of -20 ° C en kan worden gebruikt voor PCR in real time of hoge doorvoer sequencing analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gebruik van klik chemie voor de zuivering van DNA uit cellen werd eerst bereikt door de methode iPOND21. Het doel van iPOND is om te zuiveren van cellulaire replicatie vorken voor de identificatie van geassocieerde eiwitten. Wij hebben deze techniek te studeren specifiek vDNA eiwitinteractie tijdens infectie aangepast. Manipulatie van de aanpak van label virale genoom met EdC (Figuur 1), gecombineerd met gesynchroniseerde infecties...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol omvat meerdere stappen die, indien niet zorgvuldig gevolgd in aanzienlijk verlaagd eiwit opbrengst of verontreiniging met cellulaire DNA resulteren kunnen. Het is essentieel dat de stationaire cellen om ervoor te zorgen dat de cellulaire DNA niet is gelabeld en gezuiverd voor alle experimenten worden gebruikt. Dit kan worden bevestigd door het ontbreken van cellulaire DNA-polymerase in de eiwitSteekproef omdat HSV-1 geen gebruik van cellulaire DNA-polymerase voor genoom-synthese. Tijdens EdC labeling en kern...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen Hannah Fox voor hulp bij de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door de NIH R01AI030612 verlenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MRC-5 cellenATCCCCL-171
Fetaal bovien serum (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082Vervangen door 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (voor groei in kolven) of 30 mM (voor groei in schalen) natrium-bicarbonaat
600 cm2 weefselkweekschaalThermo Fisher Scientific166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7,4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1 voorraadVoorraden met titers groter dan 1x109 PFU/mL werken het beste
Sephadex G-25  kolom (PD-10 ontziltingskolom)GE Healthcare17085101
Dimethylsulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307Oplossen in DMSO om een 40 mM voorraad te bereiden, af te vullen en bij -20 °C  te bewaren
2´-deoxycytidine (deoxyC)Sigma-AldrichD3897Oplossen in water om een 40 mM voorraad te bereiden, af te vullen en bij -20 °C  te bewaren
Nucleair extractiebuffer (NEB)Verversend bereiden (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0,5% Igepal)
CelschraperBellco glass7731-22000Autoclaveer voor gebruik
Trypanblauw oplossingSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7,2 (10x)1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (verdun tot 1x in steriel water voor gebruik)
Koper (II) sulfaat pentahydraat (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Bereid een 100 mM voorraad en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand
(+) Natrium L-ascorbinezuurSigma-AldrichA4034Bereid vers een 100 mM voorraad en bewaar op ijs tot gebruik
Biotine azideInvitrogenB10184Bereid een 10 mM voorraad in DMSO, af te vullen en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar 
Click Reactie MixBereid onmiddellijk voor gebruik door reagentia toe te voegen in de aangegeven volgorde (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotine Azide, 1 mL 100 mM natriumascorbinezuur)  
Complete Protease Remmer CocktailRoche11697498001Los op in 1 mL water om een 50x voorraad te bereiden, kan worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week, of direct 1 tablet toevoegen aan 50 mL buffer
Invries bufferVerversend bereiden (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease remmer)
Buffer B1Verversend bereiden (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease remmer)
Buffer B2Verversend bereiden (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x protease remmer)
Buffer B3Verversend bereiden (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease remmer)
Vibra Cell Ultra Sonische Processor uitgerust met een 3 mm microtip sondeSonicsVCX 130
Cel zeefFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagneetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
2x Laemmli monster bufferMeng 400 mg SDS, 2 mL 100% glycerol, 1,25 mL van 1 M Tris (pH 6,8) en 10 mg broomfenolblauw in 8 mL water. Bewaar bij 4  °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg voor gebruik 1 M DTT toe tot een eindconcentratie van 200 mM.
Cap locks voor 1,5 mL buisFisher ScientificNC9679153
Standaard westerse blotting reagentia
NOVEX Colloidal Blue Kleuring KitInvitrogenLC6025
12-wels weefselkweekschaalCorning3513
DekglasjesFisher Scientific12-545-100Autoclaveer voor gebruik
MicroscoopglaasjesFisher Scientific12-552-5
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Verdun tot 3,7% in 1x PBS voor gebruik
Bovine serum albumine (BSA)Fisher ScientificBP1605Bereid 3% in 1x PBS
Permeabilisatie buffer (0,5% Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Bereid 0,5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reactie cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitMolecular ProbesC10337Bereid volgens het protocol van de fabrikant
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Bereid 10 mg/mL in water, kan worden bewaard bij 4 °

Referenties

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuivering van viraal DNAHerpes simplexvirusclickchemiegebiotinyleerd DNAstreptavidinekralenmassaspectrometrieDNA replicatieisolatie van kernensonicatieprote neanalyse

Gerelateerde artikelen