Methodenartikel

Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56401

⸱

20 december 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA--1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA--1 epitopes in een eiwit.

Samenvatting

QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen. Recente gegevens suggereren dat QA--1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit, inducerende immuunregulatie, en de beperking van immuun reacties op virale infecties. Bovendien, functionele vergroting van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen via epitoop immunisatie therapeutische effecten heeft aangetoond in verschillende auto-immuunziekte diermodellen, bijvoorbeeld experimentele allergische encephalomyelitis, collageen-geïnduceerde artritis en nietzwaarlijvige diabetes. Daarom is er dringend behoefte aan een methode die snel en efficiënt functionele QA--1 epitopes in een eiwit identificeren kan. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van Qa-1-beperkte CD8+ T cel lijnen specifiek voor een overlappende peptide (OLP) bibliotheek voor het bepalen van de QA--1 epitopes in een eiwit. Deze OLP bibliotheek bevat 15-mer overlappende peptiden die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit en aangrenzende peptiden overlappen door 11 aminozuren. Met behulp van dit protocol, we onlangs geïdentificeerd een epitoop QA--1 9-mer in myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). Deze nieuw toegewezen MOG QA--1 epitoop bleek voor het opwekken van epitoop-specifieke, QA--1-beperkte CD8+ T cellen die verbeterde myeline-specifieke immuunregulatie. Dit protocol is daarom nuttig voor toekomstige onderzoek van nieuwe doelstellingen en functies van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen.

Inleiding

QA-1 behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen in muizen. De menselijke homolog is HLA-E. Vorige bewijs heeft aangetoond dat QA--1 moleculen belangrijke biologische functies hebben. Ten eerste, QA--1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit. In dit verband QA--1 moleculen geëvolueerd verschillende strategieën voor het controleren van de normale functie van een cel. Een dergelijke strategie kunt QA--1 moleculen naar formulier complexen met een verwerkte leider peptide (epitope), dat wil zeggen de Qa-1 determinant modifier (Qdm) dat is verwerkt uit klassieke MHC-Ia moleculen in het endoplasmatisch reticulum-1. Deze QA--1/Qdm complexen later weer op het oppervlak van een cel en een binding met remmende NKG2A receptoren op NK-cellen voor de remming van de NK activiteit2doden. Als de expressie van MHC-Ia moleculen verbroken wordt, wordt een cel (bijvoorbeeld een kwaadaardige cel) gevoelig voor NK doden2. De andere strategie mogelijk maakt QA--1 moleculen te vormen nieuwe QA--1/epitoop complexen op het oppervlak van een cel dat tekortschiet in TAP (vervoerder gekoppeld aan antigeen processing)3 en/of ERAAP (endoplasmatisch reticulum aminopeptidase gekoppeld in4 van het antigeen processing) (beide tekortkomingen vaak voorkomen in kwaadaardige cellen). De cel die deze nieuwe QA--1/epitoop complexen uitdrukt kan vervolgens worden herkend en uitgeschakeld door de epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen. Ten tweede, QA--1 moleculen induceren immuunregulatie5. In dit verband QA--1/epitoop complexen is aangetoond dat het stimuleren van CD8+ regulatoire T (Walter) cellen die belangrijk voor de preventie van immuun-gemedieerde schade van zelf-weefsels6,7,8 zijn ,9,10. Ten derde, Qa-1-beperkte CD8+ Treg cellen is aangetoond dat het beperken van de immuunrespons tegen virale infectie11.

Dus, de vergroting van het specifieke van epitoop-specifieke QA--1-restrictred CD8+ T cellen is een potentieel veelbelovende strategie voor het wegwerken van abnormale cellen, voor de verhoging van de immuunregulatie, en voor de controle van de omvang van virus-geïnduceerde immuunreacties. Terwijl het is niet vastgesteld of vergroting van epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen kunnen vergroten immuun toezicht en virus-geïnduceerde immuunreacties beperken, onze laboratoria en anderen hebben duidelijk aangetoond dat immunisatie met QA--1 epitopes kan vergroten de functie van Qa-1-beperkte CD8+ Treg specifieke cellen voor pathogene auto-immune CD4+ T cellen, wat leidt tot efficiënte controle van CD4+ T-cel-gemedieerde auto-immune ziekten in een scala aan dierlijke modellen zoals experimentele allergische encefalomyelitis (een dierlijk model van menselijke multiple sclerose)6,10, collageen-geïnduceerde artritis (een dierlijk model van menselijke reumatoïde artritis)7, en nietzwaarlijvige diabetes (een dierlijk model van menselijke type 1 diabetes)8. Daarnaast hebben we ontdekt dat immunisatie met een epitoop weefsel-specifieke QA--1 tot een specifiek besturingselement van immuun-gemedieerde ontsteking in dat weefsel door vergroting van CD8 leidt+ Treg cellen12. De bovenstaande successen van preklinische studies geven een behoefte aan een volledige beoordeling van QA--1 epitoop immunisatie voor de behandeling van weefsel-specifieke immuun-gemedieerde aandoeningen en potentieel voor de therapie van andere ziekten in verband met tekortkomingen in de kraan en ERAAP.

Dienovereenkomstig, is er een vraag voor een technologie die betrouwbaar en snel QA--1 epitopes in een eiwit analyseren kan. In dit verband is een beperkt aantal biologisch belangrijke QA--1 epitopes beschreven. De meeste van deze epitopen QA--1 per werden vastgesteld tijdens de studie van CD8+ T cel reacties op bacteriën13, tekort aan TAP3cellen, tekort aan ERAAP4cellen en cellen die EAE6veroorzaken, 9. Daarom is een hoge doorvoer techniek wenselijk voor de identificatie van biologisch belangrijke QA--1 epitopes in een bepaald eiwit. In het volgende, beschrijven we een overlappende peptide (OLP) bibliotheek strategie die kaarten van functionele QA--1 epitopes in een proteïne met behulp van CD8 QA--1-resrticted+ T cel lijnen specifiek voor de OLP zwembad (OLP_pool) van een eiwit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden gedaan met inachtneming van een institutionele Animal Care en gebruik Protocol goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Texas in El Paso en Loma Linda University.

1. generatie van een OLP bibliotheek die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit

  1. Ontwerp een OLP bibliotheek waarin alle peptiden zijn 15-mer in lengte, en aangrenzende peptiden overlappen door 11 aminozuren.
    Opmerking: In de studie van de MOG OLP, volgorde van de voorloper van de MOG [Mus musculus] was uit NCBI eiwit database opgehaald door het volgen van deze link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. De voorloper van MOG (247 aminozuren), die zowel signaal en volwassen peptiden, werd gebruikt omdat het merendeel van de gerapporteerde QA--1 (HLA-E) epitopes waren gevestigd in signaal peptiden (bijvoorbeeld Qdm1). Vanaf de N-terminus, werden de sequenties van 15-mer peptiden geïdentificeerd zodat twee aangrenzende peptiden door 11 aminozuren (Figuur 1 overlapt). Vandaar, precies 59 OLPs werden geïdentificeerd in de voorloper van de MOG 247 aminozuur. Echter, de laatste OLP kan variëren van 12 tot 15-mer afhankelijk van de lengte van het eiwit. Bovendien kiezen we 15-mer bibliotheek omdat wij en anderen hebben aangetoond dat 15-mer peptides, wanneer toegevoegd in dendritische cellen (DC's) of macrofagen, efficiënt kunnen worden verwerkt tot epitopes voor erkenning door CD8+ T cellen14,15 .
  2. Elke individuele peptide commercieel kopen. 5 mg per peptide moet voldoende zijn voor de screening. OLPs en afgekapte peptiden (stap 6.1) kunnen ontzout peptiden (zuiverheid is ongeveer 50-70%). De zuiverheid van optimale peptide (stap 6.2) die wordt gebruikt voor de generatie van tetrameer en voor toekomstige biologische analyses moet > 90%. Reconstrueren de peptiden onder steriele toestand.
  3. 50 mg/mL individuele peptide voorraden in 100% DMSO maken. 5 mg elke peptide, voeg 100 μl van DMSO in elke buis, meng, en slaan de peptiden bij-20 ° C. Deze bestanden worden gebruikt voor het maken van een OLP_pool voorraad voor de generatie van CD8+ T cel lijnen reactief naar de OLP_pool. Bovendien zal deze bestanden ook worden gebruikt om het maken van 10 mg/mL individuele peptide voorraden voor het bepalen van het vermogen van elke individuele peptide te stimuleren een Qa-1-beperkte reactie in een OLP_pool-reactieve CD8+ T cellijn.
  4. Make OLP_pool voorraad door toevoeging van een gelijk volume van elke peptide in een verse buis. Deze OLP_pool voorraad bevat 100% DMSO. In de studie van de MOG OLP waren er 59 OLPs12. Vandaar, was de concentratie van elke peptide in de OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. 10 mg/mL individuele peptide voorraden te maken door verdunnen (5 x) de voorraad van 50 mg/mL in steriel H2O in een V-bodem 96-wells-plaat (dit bestand bevat 20% DMSO). Deze voorraden in een 96-wells-plaat maken, omdat de bepaling van de Qa-1-beperkte reactie van elke individuele peptide zal worden uitgevoerd in een 96-wells-plaat met een 8 - of 12-kanaals meerkanaalspipet.
    Opmerking: Alle peptides, zoals OLPs en afgekapte peptides, moeten worden verdund in ofwel een V-bodem 96-wells-plaat of een monster van de 96-Wells-rek gevuld met 1 mL buizen, aangezien de peptide bibliotheek screening wordt uitgevoerd in 96-wells-platen met een meerkanaalspipet. Als het is moeilijk te Verdun een peptide, voeg 1 N NaOH druppel verstandig om te helpen de peptide ontbinden.

2. priming van Kb-/- Db-/- CD8+ T cellen met de OLP_pool-gepulseerde Kb-/- Db-/- dendritische cellen (DC's).

Opmerking: Er zijn twee grote QA--1 allelen: een QA--1eenis, en anderzijds QA--1b. Sinds de dieren gebruikte voor academisch onderzoek, bijvoorbeeld C57BL/6 en Balb/c muizen, voeren QA--1b, dit protocol wordt de procedure beschreven voor toewijzing QA--1b epitopes in een eiwit. CD8+ T cellen die worden gebruikt in dit protocol worden gezuiverd van Kb-/-Db-/- muizen (C57BL/6 achtergrond) in welke CD8+ T cellen zijn meestal door niet-klassieke MHC-Ib moleculen met inbegrip van Qa-1 beperkt.

  1. Beenmerg-afgeleide DCs als eerder beschreven12produceren.
    1. Kort, cultuur beenmerg eencellige schorsingen (1 x 106 cellen/mL) in RPMI-10 medium (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuur 0.1 mM) bevattende 10 U/mL IL-4 en 100 U/mL GM-CSF in een 6-well-plate (4 mL/putje) bij 37 ° C, 5% CO2.
    2. Twee dagen later, niet-aanhanger cellen zorgvuldig verwijderen en toevoegen van nieuwe media en cytokinen.
    3. Na het kweken van de cellen nog eens twee dagen, overdracht van niet-aanhanger cellen met verse media en cytokinen in een nieuwe 6-well-plaat.
    4. De cellen nog eens twee dagen cultuur en aangevuld met nieuwe media en cytokines met LPS (0,1 µg/mL) te activeren de DCs.
    5. 24 uur later, verzamelen de DCs voor experimenten.
  2. De DCs met 3000 Rads bestralen.
    1. Als alternatief, behandelen de DCs (5 x 10,7 cellen/mL) met mitomycine C (50 μg/mL) in PBS bij 37 ° C gedurende 20 min. toevoegen RPMI-0 (RPMI 1640 zonder serum) om te vullen van de buis (~ 12 mL) en draaien de cellen gedurende 10 minuten in een centrifuge tafelblad bij 300 x g. Discard supernatant en repea t de wassen procedure nog tweemaal. Deze drie wast zijn van cruciaal belang omdat elke trace hoeveelheid mitomycine C kan de reactie van CD8 remmen+ T cellen tijdens de celcultuur co DC-T.
  3. Pas de DC tot 5 x 106 cellen/mL in een serumvrij medium (doel-V serumvrij medium aangevuld met 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuur 0.1 mM).
  4. Voeg de OLP_pool-stockoplossing, die 100% DMSO, naar de DCs bevat zodanig dat DMSO eindconcentratie 0,5% (200 x is). In de studie van de MOG OLP was de concentratie van elke OLP in de OLP_pool 847.46 μg/mL; dus was de uiteindelijke concentratie van elk OLP in de DC cultuur 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Echter kan deze concentratie tot 100 μg/mL worden aangepast zolang de DMSO-concentratie in de cultuur van de cel minder dan 1 blijft %.
  • Incubeer de DCs bij kamertemperatuur gedurende 3 uur en schud de cellen voorzichtig elke 15 min.
  • Tijdens deze incubatieperiode, zuiveren CD8+ T cellen uit de geoogste milt of lymfklieren van Kb-/-Db-/- muizen met behulp van een commerciële CD8+ T cel zuivering kit, aanpassen van de concentratie van de cel tot 10 x 106 cellen/mL in het serumvrij medium met 50 U/mL Interleukine 2 (IL-2) en 100 U/mL voor IL-7.
  • Nu, voeg de CD8+ T cellen in een 48-well plaat als 0,5 mL per putje (na toevoeging van 0,5 mL/goed van de OLP_pool-gepulseerde DCs in stap 2.8, de uiteindelijke concentratie van de CD8+ T cellen zullen 5 x 106 cellen/mL).
    Opmerking: CD8+ T cellen uit muis milt en lymfklieren gezuiverd kunnen worden met behulp van CD8 positieve isolatie Kit door het volgen van de instructies van de fabrikant. CD8+ T cellen verkregen vrij zijn van kralen.
  • Spin down de OLP_pool pulsed DCs (300 x g, 10 min) op de RT. reconstrueren de OLP_pool pulsed DCs tot 2 x 106 cellen/mL in het medium serumvrij en Voeg 0,5 mL per putje in de 48-well-plaat waarin de CD8+ T cellen (eindconcentratie van de OLP _pool-gepulseerde DCs is 1 x 106 cellen/mL, eindconcentratie van CD8+ T cellen is 5 x 106 cellen/mL, eindconcentratie van IL-2 25 U/mL en eindconcentratie van IL-7 is 50 U/mL). Cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  • Op dag 4, verwijderen en verwijderen van ongeveer 400 μL van het kweekmedium en toevoegen van 500 μL van de verse serumvrij opslagmedium met 100 U/mL IL-2 en 100U/mL voor IL-7 aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  • Op dag 7 of 8, opnieuw stimuleren de OLP_pool-primer CD8+ T cellen met de OLP_pool.

    • 3. restimulation van de primer CD8+ T cellen met macrofagen gepulseerde met de OLP_pool

    1. Vier dagen vóór de hernieuwde stimulatie van de OLP_pool-primer CD8+ T cellen, bereid 2% (v/v) polyacrylamide kraal oplossing: wassen 2 g van polyacrylamide kralen tweemaal in 20 mL endotoxine-vrije H2O of PBS. De parels van polyacrylamide pellet door centrifugeren (400 x g) voor 5 min en resuspendeer in 100 mL PBS. Autoclaaf 15 lb/m voor 20 min. winkel bij kamertemperatuur.
    2. Injecteren intraperitoneally muizen met 1 mL/muis van de steriele oplossing polyacrylamide Parel 2% voor het aantrekken van de migratie van de monocyten/macrofagen in de peritoneale holte16.
    3. Vier dagen later, offeren de dieren door CO2 overdosis.
      1. Onder steriele condities, snijd een kleine opening in het midden van de buik, zodanig dat de opening net genoeg is voor het doorgeven van een pipet 5 mL overdracht. Vul de overdracht pipet met RPMI-0 en plaats de pipet in de buik-holte door de opening.
      2. Spoel de buik-holte door pipetteren. Pipetteer uit zo veel vloeistof mogelijk uit de buik-holte in een steriele buis (dit zijn peritoneale macrofagen). Herhaal de spoeling stap 4 - 5 keer.
    4. De peritoneale macrofagen met 3000 Rads bestralen.
      1. U kunt ook behandelen de peritoneale macrofagen met mitomycine C (volg de procedure die wordt beschreven in stap 2.2).
    5. De concentratie van de peritoneale macrofagen tot 5 x 106 cellen/mL in het medium serumvrij aanpassen. Voeg OLP_pool voorraad (de eindconcentratie van DMSO is minder dan 1%) en M-CSF (eindconcentratie = 100 U/mL).
      Opmerking: In deze studie MOG OLP gebruikten we 0,5% DMSO. Dus, MOG OLP_pool voorraad was verdunde 200 x (bijvoorbeeld 1 μL van MOG OLP_Pool voorraad is toegevoegd in 199 μL van peritoneale macrofagen). Vandaar, de uiteindelijke concentratie van elk OLP was 4.2 μg/mL).
    6. Toevoegen van 200 μl per putje (1 x 106 cellen/well) in een 48-well weefselkweek plaat en de plaat bij 37 ° C gedurende 4 uur uit te broeden.
    7. Verwijder de cellen niet-aanhanger en de polyacrylamide kralen door zachte wassen met 200 μl per putje van de voorverwarmde RPMI-0.
    8. Verzamelen en zwembad de OLP_pool primer CD8+ T cellen uit stap 2.10. Passen de OLP_pool primer CD8+ T cel concentratie aan 1 x 106 cellen/mL in het serumvrij medium met 25 U/mL IL-2 en 50 U/mL voor IL-7. 1 mL/putje aan de 48-well-plaat waarin de OLP_pool-gepulseerde peritoneale macrofagen toevoegen.
    9. Vier dagen later, vullen het medium in de plaat van 48-well. Verwijderen en verwijderen van ongeveer 400 μL van de voedingsbodem in de platen 48-well cultuur. Voeg 500 μL van verse serumvrij middellange met 100 U/mL IL-2 en 100 U/mL voor IL-7 in elk putje. Cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
    10. Drie of vier dagen later, onderzoeken de CD8 OLP_pool-restimulated+ T cellen voor OLP_pool-specifieke, QA--1-beperkte reactie door enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT). Na dit punt opnieuw stimuleren de CD8+ T cellen elke 7-10 dagen.
      Opmerking: De macrofagen zijn voorkeur voor de hernieuwde stimulatie van de OLP_pool-primer CD8+ T cellen. We hebben gemerkt dat CD8+ T cellen opnieuw gestimuleerd door de macrofaag groeide beter dan DCs in vitro.

    4. vaststelling van OLP_pool-specifiek, Qa-1-beperkte reactie in een CD8 OLP_pool-restimulated+ T cel lijn

    Opmerking: OLP_pool-specifieke, QA--1-beperkte reactie in een CD8 OLP_pool-restimulated+ T cellenvariëteit wordt bepaald door IFNγ afscheiding na stimulatie van de OLP_pool in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van een IFNγ ELISPOT assay. C1R cellen kunnen commercieel worden verkregen. C1R. QA-1b -cellen kunnen worden gegenereerd door het transducing van de C1R cellen met de QA--1 lentivirale vector.

    1. Voeg 100 μl per putje van een opname anti-IFN-γ antilichaam verdund in coating buffer (PBS) in de putjes van de plaat van een ELISPOT.
    Seal en Incubeer de plaat bij 4 ° C's nachts.
  • Op de tweede dag, negeren van de buffer van de coating met het antilichaam van de anti-IFN-γ vastleggen en toevoegen van 200 μl/goed-blocking oplossing (serumvrij medium) en de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  • Het bestralen van de C1R en de C1R. QA-1b -cellen met 9.600 Rads.
    1. Als alternatief, de C1R en de C1R te behandelen. QA-1b -cellen met mitomycine C zoals beschreven in de stap 2.2, behalve dat de behandeltijd 30 min zullen.
  • De C1R en de C1R aanpassen. QA-1b -cellen in de serumvrij middellange tot 4 x 106 cellen/mL.
  • Negeren van de blokkerende oplossing in de plaat en voeg de C1R en de C1R. QA-1b -cellen bij 50 μl per putje (200.000 cellen per putje) en meng.
  • Voeg 50 μl per putje van 100 x verdund OLP_pool voorraad (in het serumvrij medium) en meng goed. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur.
  • Aanpassen van de CD8 OLP_pool-restimulated+ T cellen voor 1-2 x 106 cellen/mL in het serumvrij medium met 150 U/mL voor IL-7 en 50 μl per putje (50.000-100.000 cellen per putje) toevoegen aan de plaat. Centrifugeer de plaat (58 x g) gedurende 5 minuten.
  • Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 's nachts.
  • Gecombineerd celsuspensie. Was de putjes 2 keer met gedeïoniseerd water (DI) water (250 μl per putje). Kunnen putten om weken voor 5 min bij elke stap van het wassen.
  • Wassen wells 3 keer met wassen Buffer ik (PBS met 0,05% Tween20). Kunnen putten om weken voor 1 min bij elke stap van het wassen. Gooi was buffer.
  • Voeg 100 μl van detectieantilichaam verdund in een verdunning buffer (PBS met 10% foetale runderserum (FBS)).
  • Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  • Gooi detectie antilichaam oplossing. Was de putjes goed 3 keer met 250 µL per putje wassen Buffer I. staat putten te genieten voor 1 min bij elke stap van het wassen.
  • Voeg 100 μl per putje van enzym geconjugeerde (streptavidine-HRP) verdund in de verdunning buffer bij 1:100 verdunning.
  • Incubeer de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  • Gooi enzym geconjugeerde oplossing. Was de putjes goed 4 keer met 250 µL per putje wassen Buffer I. staat putten te genieten voor 1 min bij elke stap van het wassen.
  • Was de putjes 2 keer met 250 µL per putje wassen Buffer II (PBS).
  • Voeg 100 µL van substraat oplossing (mix 1 druppel = 20 µL van AEC chromogeen met 1 mL AEC substraat) aan elk putje. Monitor ter plaatse ontwikkeling gedurende 5 tot 60 minuten.
  • Als gewenste resultaten verschijnen, stop de substraat-reactie door putjes met gedestilleerd water wassen.
  • De platen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur drogen of nachtelijke totdat het helemaal droog is. Verwijdering van de kunststof lade onder de platen zal vergemakkelijken drogen. Platen worden opgeslagen in een verzegelde plastic zak in het donker totdat het wordt geanalyseerd.
  • Opsommen vlekken handmatig door inspectie onder een Microscoop ontleden of met behulp van een ELISPOT-afleesapparaat. De representatieve resultaten zien in Figuur 2.

    • 5. de bepaling van afzonderlijke Peptides in de OLP_pool die stimuleren om de Qa-1 beperkt secretie van IFN-γ in een OLP_pool-specifieke CD8+ T cellijn

    1. Bepalen van de afzonderlijke peptiden die het stimuleren van de OLP_pool-specifieke secretie van IFN-γ QA--1-restrictred in een OLP_pool-specifieke CD8+ T cellijn met behulp van de hierboven beschreven IFN-γ ELISPOT assay (eindconcentratie van elke individuele peptide gebruikt voor de ELISOPT is assay 10 μg/mL). Zie representatieve resultaten in Figuur 3.
      Opmerking: Een OLP-specifieke, QA--1-restircted-reactie wordt gedefinieerd als een antwoord dat ten minste driemaal van de reactie in de aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen, maar zonder de OLP. In de studie van de MOG OLP, OLP68, OLP96 en OLP105 voldaan al aan dit criterium. Daarom bevatten alle de drie OLPs potentieel QA--1 epitopes12 (Figuur 3). Echter gaf de OLP105 consequent de sterkste reactie; we vandaar een gedetailleerde analyse van de OLP105 uitgevoerd (Figuur 4 en Figuur 5)12.

    6. identificatie van de optimale Qa-1 epitoop in een 15-mer OLP, dat de epitoop-specifieke, QA--1-beperkte reactie in een OLP_pool-specifieke CD8 stimuleert+ T cellijn

    1. Synthetiseren van C - en N-terminaal afgekapt peptiden van een 15-mer OLP zoals weergegeven in Figuur 4.
    2. Onderzoeken van de secretie van IFN-γ in een OLP-specifieke CD8+ T cellijn door het stimuleren van de CD8+ T cellen met elk van de afgekapte peptiden, alsmede de ouderlijke 15-mer OLP in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van de hierboven beschreven IFN-γ ELISPOT assay. De uiteindelijke concentratie van elke individuele peptide gebruikt voor de bepaling van de ELISPOT is 10 μg/mL. Een peptide wordt gedefinieerd als de optimale epitoop QA--1 als de peptide: 1) consequent geeft vergelijkbare of sterker IFN-γ reactie, in vergelijking met de oorspronkelijke 15-mer peptide, in aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen; 2) is tussen 8 - 10-mer (9-mer peptide voorkeur) die zijn de lengtes van de peptide gebonden aan MHC-ik moleculen15,17. Zie Vertegenwoordiger resultaten in Figuur 5.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    Ontwerp van een OLP bibliotheek die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit

    Vanaf de N-terminus van een eiwit, is elke peptide 15 aminozuren (15-mer). Vandaar, beslaat de eerste peptide positie 1 naar positie 15. De N-terminus van de tweede peptide overlapt met de C-terminus van de eerste peptide 11 aminozuur. Vandaar, de tweede peptide overspant de positie 5 naar positie 19. Het ontwerp van de rest van de peptiden aan he...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    Hier hebben we een protocol voor het analyseren van QA--1 epitopes in een eiwit beschreven. Met betrekking tot dit protocol, werden verschillende andere strategieën ook eerder gemeld. Eerste, allogene CD8+ T cellijnen en klonen werden gebruikt voor de identificatie van de Qdm1. Ten tweede, een vermeende QA--1-bindende motief uit de analyse van Qdm werd gebruikt voor de identificatie van de HSP60p216-224 en een TCRBV8.1 epitoop9,18

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    Auteurs verklaren geen belangenconflict.

    Dankbetuigingen

    Wij danken Penelope Garcia voor haar technische bijstand en de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie voor innovatie (RIG) van het departement of Medicine aan de Loma Linda University (681205-2967) en een pilot subsidie van de National Multiple Sclerosis Society (PP1685) voor de XT.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Het te analyseren eiwitN/AN/ADe sequentie van het eiwit kan worden verkregen via NCBI
    Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichCat#: D2650 SIGMADMSO moet sterieel en getest voor celkweek zijn.
    Kb-/-Db-/- muizenThe Lackson LaboratoryStock#: 019995We gebruikten Taconic H2-KbH2-Db dubbele knockout muizen (Cat#: 4215-F en 4215-M) die echter niet meer beschikbaar zijn.
    AIM V Serum Free MediumThermoFisher ScientificCat#: 12055091
    2-mercaptoethanolThermoFisher ScientificCat#: 21985023
    NatriumpyruvaatThermoFisher ScientificCat#: 11360070
    Niet-essentiële aminozurenThermoFisher ScientificCat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation KitThermoFisher ScientificCat#: 11333D
    Bio-Gel P-100Bio-RadCat#: 150-4171
    Fosfaat gebufferde oplossing (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: 20012027
    TransferpipetGlobe ScientificMfg#: 137238
    Murine M-CSFPeproTechCat#: 315-02
    48-well tissuecultuur platenUSA ScientificCat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-behandelde meervoudige plaatjes, 96-well, V-vormige bodemSigma-AldrichCat#: Z372129 Sigma
    1ml diepe 06-well PP plaat, sterieelUSA ScientificItem#: 1896-1110
    Recombinant muur IL-2PeproTechCat#: 212-12
    Recombinant muur IL-7PeproTechCat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antilichaamBD BiosciencesCat#: 551881
    ELISPOT plaatSigma-AldrichCat#: S2EM004M99
    C1RATCCCat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1bOp maat gemaakt (GenBank toegang#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentivirale vectorGeneCopoeiaProduct#: Mm02955
    Detectie anti-IFN-γ antilichaamBD BiosciencesCat#: 551881
    Tween20Sigma-AldrichCat#: P9416
    Streptavidine-HRPBD BiosciencesCat#: BD557630
    AEC substraatBD BiosciencesCat#: 551951
    ImmunoSpot AnalyzerImmunoSpotElke immunoSpot analizer zou voor dit doel moeten werken.

    Referenties

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064(2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210(2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457(2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Qa 1 beperkte CD8 T cellenELISPOT assaypeptide truncatieimmuunregulatieMHC Ib moleculenpulseren van dendritische celleninterferon gamma secretiescreening van peptidepools

    Gerelateerde artikelen