Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een techniek gebruikt om te modelleren Zika virusinfectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Wildtype of gemanipuleerde stamcellijnen kunnen, onderzoekers gebruiken deze techniek te ontdekken van de verschillende mechanismen of behandelingen die vroege infectie van de hersenen en de resulterende microcefalie in Zika virus-geïnfecteerde embryo's kunnen beïnvloeden.

Samenvatting

De recente opkomst van Zika-virus (ZIKV) in gevoelig populaties heeft geleid tot een plotselinge toename microcefalie en andere neurologische aandoeningen bij pasgeboren zuigelingen. Terwijl muggen de hoofdroute van virale transmissie zijn, is het ook aangetoond te verspreiden via seksueel contact en verticale overdracht van moeder naar foetus. In dit laatste geval van overdracht, als gevolg van de unieke virale tropisme van ZIKV, wordt het virus verondersteld om overwegend doel de neurale voorlopercellen (NPC) van de ontwikkelende hersenen.

Hier een methode voor het modelleren van ZIKV infectie, en de resulterende microcefalie, die optreden wanneer menselijke cerebrale organoids worden blootgesteld om te leven van de ZIKV wordt beschreven. De organoids hoge niveaus van virus binnen hun bevolking neurale voorlopercellen weergeven, en ernstige celdood en microcefalie vertonen na verloop van tijd. Dit drie-dimensionale cerebrale organoid model kunnen onderzoekers uit te voeren soorten-matched experimenten om te observeren en potentieel grijpen met ZIKV infectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Het model biedt betere relevantie ten opzichte van twee-dimensionale standaardmethoden, en bevat mens-specifieke cellulaire architectuur en eiwit expressie die niet mogelijk in diermodellen.

Inleiding

Zika virus (ZIKV) heeft snel verspreid in Micronesia, Frans-Polynesië, en Amerika, en heeft onlangs aangetoond dat de placenta^1,2 te infecteren de ontwikkelende foetale hersenen, leiden tot neurologische aandoeningen, die cross Als microcefalie^3,4,5,6 . Het langetermijneffect op deze patiënten leven, en het huidige gebrek aan behandeling, heeft geleid onderzoekers en clinici om een beter inzicht te verschaffen in de mechanismen achter ZIKV infectie en replicatie onleesbaar te maken. Eerdere studies hebben onderzocht ZIKV infectie van in vitro -systemen in een verscheidenheid van fysiologisch relevante cel typen,^7,,^8,9, evenals in vivo¹⁰ met immunocompetent en immuungecompromitteerde muizen^11,12,13 en^15,16van de^14,van de niet-menselijke primaten. Naast deze meer conventionele technieken, hebben verscheidene groepen uitgevoerd stamcel afkomstige cerebrale organoids om te begrijpen meer over ZIKV infectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Deze groepen hebben menselijke cerebrale organoids te bevestigen de microcefalie fenotype^17,18, onderzoeken van receptoren gekoppeld aan virus post¹⁹, onderzoeken van fysiologische reacties op infectie²⁰ gebruikt ^{, 21}, en potentieel scherm voor drug kandidaten²². Hier is een techniek voor het snel produceren en infecteren-cel van de stam afgeleid cerebrale organoids beschreven, zoals eerder¹⁹, ter verbetering van het inzicht van ZIKV infectie van de ontwikkeling van de menselijke hersenen.

Aangezien de organoids zijn gevormd uit standaard pluripotente stamcel (PSC) culturen, deze techniek maakt het mogelijk voor een aantal wetenschappelijke vragen worden beantwoord met betrekking tot virale infectie van de ontwikkelende hersenen. CRISPR engineering kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te wijzigen deze PVC lijnen vóór organoid infectie in een sneller tempo dan de meeste in vivo genetische studies¹⁹. Bovendien, in tegenstelling tot in standaard twee dimensionale (2D) differentiatie culturen, organoids vertonen de complexe cellulaire architectuur die essentieel zijn voor corticogenesis, en recente studies hebben aangetoond dat deze architectuur kan worden verstoord na infectie ²¹. Ten slotte, de relatief lage kosten van het genereren van organoids staat voor hogere doorvoer experimenten en screening in vergelijking met in vivo modellen. Aan de andere kant, zijn er enkele nadelen aan het gebruik van organoids te bestuderen van de ZIKV. Terwijl organoids veel meer biologisch relevant dan 2D culturen zijn, zijn er extra uitdagingen in de beoordeling van organoids vanwege hun driedimensionale (3D) aard. Beeldvorming en dissociatie van organoids heeft de neiging om meer apparatuur en een grotere investering van middelen dan in standaard 2D culturen te betrekken. Bovendien ontbreekt organoids aan de therapieën en immunologische onderdelen die aanwezig in in-vivo modellen, zijn zodat onderzoekers geïnteresseerd in die aspecten van virale infectie worden geadviseerd om een alternatieve protocol.

Er zijn een aantal technieken voor de vorming van menselijk organoids en neurospheres in cultuur, en ze meestal vallen binnen de categorie met patroon of unpatterned . Gedessineerde methoden implementeren factoren voor het regelen van de Wnt, BMP, TGFβ en andere signaalroutes differentiatie naar specifieke lineages²³duwen. Unpatterned methoden, zoals hier beschreven, die profiteren van de neiging tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en menselijke embryonale stamcellen (hESCs) om te differentiëren naar een neuroectodermal afstamming door standaard²⁴. Na ongeveer drie weken van differentiatie bestaat de resulterende organoids uit grote, biomimetische neuroepithelial structuren die verschillende celtypes die worden waargenomen in de vroege ontwikkelende hersenen bevatten.

De techniek voor het produceren van organoids uit standaard, feeder-free PVC culturen, en infecteren van deze organoids met ZIKV wordt volledig gepresenteerd. Raadpleeg voor meer informatie over het kweken methoden die nodig zijn voor de feeder-vrije PSC's, vorige methoden publicaties^25,26. Bovendien, om toe te passen consistent hoeveelheid virus voor meerdere experimenten, is het belangrijk om te berekenen van de MOI tevoren. Dit wordt gedaan door het uitvoeren van een infectie van Vero-cellen, gevolgd door behandeling met overlay medium, incubatie en immunokleuring. Beschrijvingen en methoden van deze techniek al eerder beschreven^19,27.

Zodra de PSC cultuur bereikt de samenvloeiing van de doelstelling van 50% - 70%, zijn de cellen vervolgens losgekoppeld en samengevoegd in ultra-lage bijlage 96-wells-platen. De cellen worden gehandhaafd voor 3 dagen in de cel van de stam van de xeno-gratis onderhoud media (PCMZ), en vervolgens geconverteerd naar een neurale inductie media voor de rest van de cultuur. Zodra de organoids hebben gedifferentieerd voor 3 weken, kan de infectie worden uitgevoerd. Door regelmatig opnamen tijdens de week na infectie, ziet de onderzoekers progressieve celdood en verstoring van de organoid. Onderzoekers kunnen ook distantiëren van de organoids bij deze tijd om te voeren transcriptionele of proteomic profilering. Cryosectioning en lightsheet methoden worden aanbevolen voor beeldvorming, en onderzoekers kunnen verwachten om te zien van hoge niveaus van infecties en virale replicatie met name binnen de neurale progenitor cel (NPC) populaties in de organoids. Uiteindelijk, deze techniek kan onderzoekers te snel onderzoeken de mechanismen van virale infectie van de hersenen met lage kosten en beperkte apparatuur.

Protocol

1. creëren van cerebrale Organoids van iPSC / hESC 2D cultuur (dag 0)

Opmerking: dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de cel van de stam (SC) onderhoud wordt uitgevoerd in de PCMZ medium met een vitronectin of Geltrex substraat. Als een alternatieve, eiwitrijk stamcel kweken media gebruikt, is het raadzaam om overgang SC culturen PCMZ voor ten minste twee passages vóór het initiëren van de vorming van de organoid. Het protocol is niet getest met feeder gebaseerde SC kweekmethoden.

1. Met regelmatige SC onderhoud methoden ^{25 , 26}, brengen culturen tot 50% - 70% samenkomst. Dit is meestal 3-4 dagen na het passaging, maar dit kan afhankelijk van de cultuur methode en cel lijn.
   Opmerking: Ongeveer 2 putten van een 6-well-plate zijn nodig voor de productie van een volledige 96-wells-plaat van organoids.
2. Inspecteren culturen via helderveld microscopie op 10 X-20 X vergroting om gezonde kolonie morfologie, met geen detecteerbare differentiatie.
3. Brengen PCMZ tot 37 ° C in een waterbad, en de dooi een flacon 50 µL van 50 mM Y-27632 (Rock-remmer) en 2 mL enzymatische detachement reagens tot kamertemperatuur.
4. Bereiden een ultra-lage bijlage (ULA) U-onder 96 goed plaat, een meerkanaalspipet P200 en een reservoir van 25 mL reagens.
5. Aliquoot 45 mL PCMZ in een conische buis van 50 mL, en voeg 45 µL van 50 mM Y-27632. Meng grondig door triturating.
6. Vacuüm gecombineerd de twee putten met SCs en snel toevoegen van 1 mL van het enzym-vrije detachement reagens aan elke goed met behulp van een pipet P1000. Incubeer de plaat in een incubator 37 ° C gedurende 4 minuten
7. Vacuüm gecombineerd de behandelde putten, en voeg 1 mL van enzymatische detachement reagens aan elk putje met behulp van een precisiepipet P1000.
   1. De plaat in een 37 ° C incubator voor een extra 5 min. Incubate
   2. Verwijderen van de plaat en de behandelde putten te onderzoeken. Tik zachtjes op de plaat te breken van samengevoegde cellen. Als grote cel clusters nog steeds zichtbaar zijn, Incubeer de plaat gedurende 2 extra minuten bij 37 ° C. Herhaal deze stap totdat clusters niet langer zichtbaar met het blote oog zijn.
8. Zodra de cellen goed zijn gekoppeld, voeg 1 mL PCMZ aan elk putje deactiveren de dissociatie enzymen. Zwembad de 4 mL celsuspensie in een conische buis van 50 mL en neem een kleine hoeveelheid voor het tellen van de cel.
   1. Alle resterende, onbehandelde putjes in de plaat onderhoud terugkomen de 37 ° C incubator.
9. Centrifugeren terwijl tot nu toe, de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
10. Bepalen van het totale aantal cellen, en berekent het bedrag van de PCMZ + Y-27632 oplossing die nodig zullen zijn om een opschorting van 60.000 cellen/mL.
11. Vacuüm zorgvuldig gecombineerd het supernatant en voeg de berekende hoeveelheid PCMZ + Y-27632 oplossing. Meng 5 - 10 keer met een 5 mL-pipet, zorgen voor een uniforme celsuspensie.
12. Onmiddellijk de celsuspensie overboeken naar een reagens reservoir, en Pipetteer 150 µL in elk putje van de ULA U beneden 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet P200. Dit produceert 96 individuele organoids, elk in eerste instantie bestaande uit 9.000 cellen.
13. De plaat bij 150 x g gedurende 1 min. centrifuge
14. Plaats de plaat in een incubator van 37 ° C, en de plaat voor 48 h. niet storen

2. Cerebrale Organoid onderhoud (dag 2)

1. bereiden 17 mL PCMZ met 17 µL van 50 mM Y-27643 in een conische buis van 50 mL. Warm de PCMZ + Y-27632 oplossing tot 37 ° C in een waterbad.
2. Nemen de organoid plaat uit de incubator, en met behulp van een meerkanaalspipet van P200 ingesteld op 75 µL, langzaam stelt medium vanaf de rand van de put op de eerste rij. Zodra het medium heeft opgesteld, snel de middellange terug in de put te verheffen van losse cellen en organoids te verdrijven. Herhaal deze procedure voor elke rij.
   Opmerking: Deze techniek, hierna te noemen een " dispersie, " liften cellulaire puin en de organoid in de opschorting. De organoid zinkt snel naar de bodem van de put, maar blijft het kleinere puin in suspensie, toestaand het om te worden verwijderd met een verandering van de media. Dit helpt om te voorkomen dat de organoid rust in cellulaire puin tijdens cultuur.
   1. Na hebben alle putjes zijn verspreid, wacht 15 s om ervoor te zorgen dat de organoids aan de onderkant van elk putje gezonken.
3. Langzaam en zorgvuldig gecombineerd 75 µL van medium van elk goed met de meerkanaalspipet P200 en afzien in een afval reservoir.
   Opmerking: De meeste gebruikers gecombineerd af en toe een organoid tijdens regelmatige feeds. Dit kan ongeveer 1% van de tijd gebeuren. Gelieve dienovereenkomstig plannen om ervoor te zorgen dat voldoende organoids tot experimentele tijdstippen overleven.
4. Transfer PCMZ + Y-27632 solution in een reagens reservoir, en afzien van 150 µL in elke organoid goed met behulp van de P200 meerkanaalspipet.
5. Plaats van de plaat terug in een 37 ° C incubator.

3. Cerebrale Organoid onderhoud (dag 3)

1. Warm PCMZ tot 37 ° C, dit keer zonder Y-27643 17 mL.
2. Met de P200 meerkanaalspipet ingesteld op 100 µL, dispergeren alle putjes van de plaat van organoid (zie stap 2.2). Wacht 15 s om ervoor te zorgen dat organoids tot naar de bodem van hun putten zinken hebben.
3. Bereiden een afval reservoir en verwarmde PCMZ overbrengen in een reservoir bron.
4. Zorgvuldig gecombineerd 125 µL van medium uit elk putje, en vervangen met 150 µL van verse PCMZ met de P200 meerkanaalspipet.
5. Plaats van de plaat terug in een 37 ° C incubator.

4. Cerebrale Organoid onderhoud (dag 4 +)

Opmerking: voeren deze regelmatig onderhoud om de andere dag tot infectie.

1. Bereiden voordat u begint met het diervoeder op dag 4, neurale inductie (NI) medium.
   1. Dooi een 250 µL aliquoot deel van 2 mg/mL heparine, samen met een 5 mL flesje van 100 X N-2 Supplement. Voeg de 250 µL van heparine, 5 mL 100 X N-2 en 5 mL van 100 X MEM-NEAA tot 500 mL van DMEM / F12 + GlutaMAX. Steriel filter de gemengde oplossing in een filter van 500 mL.
      Opmerking: NI bewaren bij 4 ° C wanneer niet in gebruik; NI duurt maximaal twee weken voordat het verse medium moet worden voorbereid.
2. Warm 17 mL NI middellange tot 37 ° C.
3. Met de P200 meerkanaalspipet ingesteld op 100 µL, dispergeren alle putjes van de plaat van organoid (zie stap 2.2). Wacht 15 s om ervoor te zorgen dat organoids tot naar de bodem van hun putten zinken hebben.
4. Bereiden een afval reservoir en verwarmde NI overbrengen in een reservoir bron.
5. Zorgvuldig gecombineerd 125 µL van medium uit elk putje, en vervangen met 125 µL van verse NI met de P200 meerkanaalspipet.
6. Plaats van de plaat terug in een 37 ° C incubator.

5. Organoid besmetting met ZIKV (~ dag 24)

Opmerking: na ongeveer 3 weken voor differentiatie, daar will worden grote neuroepithelial structuren en rozetten zichtbaar is binnen het organoid dat zeer gevoelig voor infectie ZIKV zijn zal.

1. Brengen Earle ' s 1 X evenwichtig zout oplossing (EBSS), 1 X PBS en NI tot 37 ° C in een waterbad.
2. Dilute ZIKV van bekende concentratie in 1 X EBSS aan de target-infectie multipliciteit van infectie (MOI).
   Opmerking: Titraties van verschillende MOIs worden aanbevolen om een virale dosis-respons. Dit kan variëren door virusstam; voor ATCC VR-1838 en ATCC VR-1843, typische MOI waarden variëren tussen 0,1 en 10).
3. Verwijder voorzichtig alle medium van organoid goed met behulp van een pipet enkellijns P200. 200 µL van 1 X PBS snel kunt toevoegen aan elk goed met behulp van een meerkanaalspipet P200 te wassen de organoids.
4. Verwijder voorzichtig alle medium van organoid goed met behulp van een pipet enkellijns P200. Snel toevoegen 50 µL van 1 X alleen-EBSS (mock infectie) of ZIKV virus oplossing goed en zorgen dat de organoid volledig is ondergedompeld. Herhaal dit voor elke organoid die besmet voor de studie is.
5. Plaats de plaat terug in een 37 ° C incubator voor 2 h.
   Opmerking: Mock-geïnfecteerde organoids broeden voor deze duur aanzienlijk geen op hun groei ten opzichte van ongestoord organoids impact moet.
6. Ongeveer 30 minuten vóór de virale incubatie is voltooid, aliquoot 25 mL NI in een conische buis van 50 mL, en brengen tot 37 ° C in een waterbad.
7. Nadat virale blootstelling is voltooid, was de organoids met 200 µL van 1 X PBS voor elk putje, toestaan organoids te regelen voor 15 s, en vervolgens verwijderen 1 X PBS met behulp van een precisiepipet enkellijns P200.
8. Voeg toe 200 µL van verse NI aan elk goed, en plaats terug in de incubator.
   1. Optioneel: voor een dag 0 tijd wijs, organoids kan één uur na infectie worden beeld.
9. Doorgaan om cultuur door vervanging van 125 µL NI om de andere dag met de dispersie-methode (zie stap 4). Zorg ervoor dat u goed beschikken over verbruikte media en tips, zoals deze besmettelijke ZIKV deeltjes bevat.

Resultaten

Tijdens de dag van de organoid formatie, SC culturen worden in de log-groei fase, waarin ze 50% - 70% heuvels, zijn zoals aangegeven in Figuur 1(A-C). Culturen moeten vormen afgeronde kolonies met duidelijke randen en de putten moet duidelijk zijn van differentiatie Figuur 1(D-E). Als differentiatie plaatsvindt, is het raadzaam om een pick te verwijderen om de getroffen gebieden binnen de platen ten minste één dag vóór het maken van organoids schoon te maken. Als een groot deel van de cultuur is gedifferentieerd, het mogelijk moet voeren een extra passage, ontdooien van een nieuwe flacon of wijzigen van de cel van de stam cultuur technieken om ervoor te zorgen dat de organoids worden gevormd door de cel van de stam van de zuivere culturen.

De Dissociatieconstante door een combinatie van enzym-vrij en enzymatische detachement reagentia behandeling moet leiden tot meestal enkele cellen, al kunnen er nog kleine aggregaten van de cellen zich heeft voorgedaan tijdens het tellen. De aanwezigheid van kleine aggregaten lijkt niet te verstoren de vorming van de organoid, hoewel het tellen nauwkeurigheid kan beïnvloeden. Het is aanbevolen dat veelvoudige tellingen per monster zijn gemaakt, en als de graven variëren door meer dan 20%, wellicht dissociatie tijd om singularize cellen verder toenemen.

Zodra de cellen worden overgeënt en beneden in een ULA U beneden 96-wells-plaat (Figuur 2A gesponnen), worden deze weergegeven als een platte, dichte vel cellen op de bodem van elk putje. De cellen zal langzaam aggregaat in de komende twee dagen. Het is best niet te verstoren, de plaat tijdens deze 48 uur, zoals mechanische krachten het losjes gevormde aggregaat kunnen verstoren. Voor de eerste 10 dagen, de organoid blijft meestal bolvormige, en zal groeien van ~ 300 µm tot 600-800 µm (Figuur 2B). Meer waarneembare structuren beginnen te verschijnen in de organoid tussen 10 en dag 20 (Figuur 2C-E). Overdag 24, moeten onderzoekers zitten kundig voor observeren rozet-achtige structuren via helderveld microscopie (Figuur 2F). Terwijl het voortdurend de cultuur, kunnen deze neuroepithelial structuren toenemen in aantal en grootte over meerdere dagen (Figuur 2G). Tijdens feeds ziet de onderzoeker aanzienlijke hoeveelheden puin verzamelen aan de onderkant van elk putje, vooral tijdens de eerste 2 weken van cultuur. De techniek van de dispersie beschreven in stap 2.2 verwijdert de meeste van deze cellulaire puin om te voorkomen dat de apoptotic puin accumuleren over meerdere feeds (Figuur 3A). Dit puin kan interfereren met imaging kan, het het uitdagend om te observeren en te kwantificeren van infectie-veroorzaakte celdood, en kan zij bepalen asymmetrische signalering naar het naburige organoid dat differentiatie in het gedrang. Indien de dispersie-techniek wordt naar behoren uitgevoerd, dit moet worden verminderd (Figuur 3B-C, 3D-E).

Het is raadzaam cryosecties of lightsheet imaging inspecteren van de corticale structuur vormen binnen de organoids uit te voeren. In dag 25 organoids zijn de rozet structuren en de ventriculaire zones duidelijk zichtbaar in de DAPI (Figuur 4A) en phospho-vimentin (Figuur 4B) kleuring. De aanwezigheid van TBR2 (Figuur 4C) geeft aan dat tussenliggende progenitoren uitmaken, met een morfologie dat leegloop suggereert. (Figuur 4D) neuronen map2 + bevolken de buitenste regio's van elke rozet. Van deze proteïnen, een kunt visualiseren de ventriculaire zone (VZ), subventriculaire zone (SVZ) intermediaire zone (IZ) en corticale plaat (CP) binnen elke rozet (Figuur 4E, 4E'). Een kunt blijven deze organoids cultuur om het observeren van de latere stadia van ontwikkeling. Hoewel corticale gelaagdheid niet zo prominent in dit soort organoid is, treedt de natuurlijke overgang naar gliogenesis veel zoals het hoort in vivo. Dit kan worden waargenomen in dag 108 organoids, waarin een groot deel van de cellen uitspreken MAP2 of GFAP (Figuur 4F-ik).

De gebruikers kunnen verwachten verschillen in grootte van de organoid door ongeveer 3 dagen na ZIKV infectie, afhankelijk van de virale MOI toegepast op de organoids (Figuur 5A-B). Na deze 3 dagen zullen er ook een stijging in cellulaire puin in de besmette putten in vergelijking met de mock putten. Dit verschil in organoid grootte zal toenemen in de volgende week, totdat de besmette organoids beginnen te breken uit elkaar (Figuur 5C-D). Allerlei testen kan op dit punt te onderzoeken infectie mechanismen, met inbegrip van de virale RNA extractie en cryosectioning (aanbevolen antilichamen gemeld in de tabel van materialen) worden gebruikt. Op cryosectioning ziet gebruikers een grote aanwezigheid van virus in de apicale regio van neuroepithelial structuren, hetgeen wijst op een gevoeligheid van neurale voorlopercellen (NPC) aan ZIKV besmetting (Figuur 6). Immunofluorescentie van verdeelde organoids zal ook stijgen in gekloofd caspase-3 expressie in de besmette organoids (Figuur 7).

Figuur 1 : Stamcel kolonie morfologie voorafgaand aan de vorming organoid.
Kolonies moet 50% - 70% heuvels ten tijde van dissociatie te produceren van een groot aantal consistente organoids. (A) Sparse, onlangs geplaatste culturen nog niet hebben bereikt log-groei fase, en zal niet veel organoids produceren. (B) zodra de cellen de juiste samenvloeiing bereiken, zijn ze klaar voor dissociatie. Het is ook belangrijk dat deze kolonies worden geïnspecteerd om te garanderen dat zij zich bewust zijn van differentiatie. (C) koloniën die te ver zijn genomen overmatige samenvloeiing zal bereiken en worden niet aanbevolen voor de vorming van de organoid. Culturen in deze toestand zijn meer kans om te differentiëren cellen bevatten. (D) kolonie randen moeten worden onderscheiden, met een consistente cel morfologie van afgeronde cellen in het midden, en iets langwerpige cellen naar de randen. (E) minimale differentiatie aanwezig moet zijn in de culturen. Als grotere, samengevoegde cellen worden waargenomen bij de centra of de randen van koloniën (witte pijlpunten) en make-up meer dan ongeveer 1% van de cultuur, is het raadzaam dat de pick te verwijderen of extra passages worden uitgevoerd om te vormen van de bevolking van een uniforme cel van de stam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Cerebrale organoid groei mettertijd.
(A) een diagram voor de productie van cerebrale organoids van 2D PSC's gehandhaafd in xeno-gratis, feeder-gratis medium. (B) voor de eerste 8 dagen, organoids blijft meestal bolvormige met paar detecteerbare functies. De diameter van de organoid zal variëren van ongeveer 300 µm tot 500 µm. (C-E) op dag 10, duidelijker regio's zal beginnen te worden langs de rand van de organoids detecteerbare en zullen ze verliezen hun bolvorm. Zij zal blijven toenemen in grootte tot ongeveer 1 mm in diameter, grotendeels afhankelijk van de cellijn wordt gebruikt voor de productie van de organoids. (F) na ongeveer 20 dagen van differentiatie, de gebruikers ziet de vorming van neuroepithelial structuren (zwarte pijlpunten) in de duidelijke perifere regio's van de meeste organoids zijn. Deze hebben een ring-achtige morfologie, met apicale en basale structuren nabootsen die van de ontwikkelingslanden cortex. (G) deze neuroepithelial structuren zal blijven groeien en toenemen in grootte ongeveer 20-30 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Clearing van cellulaire puin via dispersie feed techniek.
Tijdens de groei van de organoid, een grote hoeveelheid celdood is naar verwachting, en kan leiden tot de opeenstapeling van cellulaire puin rond de basis van de organoid. (A) de afgebeelde dispersie-techniek kan onderzoekers allermeest dit puin verwijderen tijdens elke feed. Om dit te doen, met behulp van een meerkanaalspipet P200, langzaam aan het gebruikte medium opstellen en snel verdrijven om te heffen van het organoid en cel puin in suspensie. De organoid zal snel dalen naar de bodem van de put, waarna een regelmatige feed kan worden uitgevoerd. Voorbeelden van een dag 6-organoid voor (B) en na (C) dispersie voederen aanzienlijke puin vermindering toont. Dit blijft voor enkele weken, zoals blijkt uit een dag 18 organoid voor (D) en na het voeden van de spreiding van de (E) . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Karakterisering van cerebrale organoids via immunohistochemistry.
Lightsheet beelden van cerebrale organoids staan om een voorbeeld van de cellulaire architectuur die vormt te verstrekken. Op dag 25, DAPI (A) en fosfor-Vimentin (B) aangeven losse rozetten en de ventriculaire zones, respectievelijk. (C) TBR2 etiketten tussenliggende progenitoren die migreren naar buiten, en MAP2 (D) etiketten neuronen die in de corticale plaat hebben gevormd. (E, E') De combinatie van deze proteïnen blijkt duidelijk de recapitulatie van corticale ontwikkeling in de cerebrale organoid modellen. (F-ik) Per dag 108, heeft gliogenesis plaatsgevonden, met een mengsel van GFAP + en MAP2 + cellen vullen van veel van de organoid. VZ = ventriculaire zone, SVZ = subventriculaire zone, IZ = tussenliggende zone, CP = corticale plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Afbraak van besmette organoids.
(A) helder veld beelden van Mock en ZIKV-geïnfecteerde cerebrale organoids op MOI = 0.1 en 10. Beelden werden genomen onmiddellijk na infectie (dag 0), ook als 3 en 6 dagen na infectie. (B-C) Helderveld beelden van het puin van de cel rond mock (B) en (C) ZIKV-besmet op MOI = 10 cerebrale organoids 3 dagen na infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Cryosection en immunofluorescentie van besmette organoids.
Dag 24 organoids werden blootgesteld aan ZIKV op de MOI = 0,1 en cryosectioned 6 dagen later. In dit stadium is er een duidelijke aanwezigheid van virus in de ventriculaire subventriculaire en tussenliggende zones van de organoid, waar de neurale voorlopercellen en radiale glia woont. (A) Via nucleaire kleuring, deze neuroepithelial regio's duidelijk zichtbaar zijn verschuldigd (witte pijlen) aan de hoge densiteit van kernen die ring-achtige structuren rond de apicale oppervlak vormen. (B) door de kleuring van de virale envelop, kan men een relatief hoge aanwezigheid van het virus binnen deze structuur van de rozet (witte pijlpunten) waarnemen. Merk op dat er een kleine hoeveelheid virus in verschillende niet-geïdentificeerde perifere cellen aanwezig. (C-D) Map2 of andere neuron-specifieke vlekken tonen aan dat er neuronen in de culturen die niet lijken te worden geïnfecteerd door het virus als ze elkaar overlappen met de virale vlek aanwezig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7 : Gekloofd caspase-3 immunofluorescentie van besmette organoid.
Na infectie, kan een apoptotic indicatoren gebruiken om te onderzoeken van de mechanismen van de dood van de cel die zich binnen de organoids voordoen. In dit voorbeeld dag 24 organoids werden blootgesteld aan ZIKV op de MOI = 0,1 en cryosectioned 6 dagen later. (A) niet-geïnfecteerde organoids Toon geen virale envelop (2 van 4 g eiwit), en een minimale hoeveelheid gekloofd caspase-3 als gevolg van homeostatische apoptosis die zich voordoen in het weefsel. (B) Infected rozetten beginnen te tonen verhoogde niveaus van apoptosis. (C) rozetten die ernstige infectie via 4 g 2 ook vlekken vertonen de neiging om vertonen van hoge niveaus van gekloofd caspase-3 in deze regio's. Er is een directe correlatie tussen de ernst van de infectie en gekloofd caspase-3 expressie binnen de besmette rozetten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Er zijn verschillende valkuilen om te overwegen wanneer met behulp van menselijke cerebrale organoids te onderzoeken ZIKV infectie. Een belangrijke overweging is dat organoid-formatie en structuur is sterk afhankelijk van de lijn van de cel van de stam waaruit ze zijn ontstaan. Wees voorzichtig bij het vergelijken tussen cellijnen, met inbegrip van isogene aangelegde lijnen; het is het beste te maken van de conclusies met behulp van meerdere subklonen, en een ideale meerdere stamcellijnen. Bovendien is als gevolg van dit verschil in cellijnen, proefprojecten om ervoor te zorgen dat de juiste differentiatie in de organoids plaatsvindt aanbevolen. Terwijl de neuroepithelial structuren door helderveld microscopie zichtbaar zijn, is er ook gesuggereerd om uit te voeren van de experimenten van de qRT-PCR of cryosectioning om te zoeken naar Neurale differentiatie markeringen zoals PAX6 of phospho-vimentin.

Men moet ook anticiperen op aanzienlijke variabiliteit tussen organoids binnen dezelfde cellijn. Vanwege de unpatterned aard van het protocol, kunnen het aantal en de grootte van de structuren van de neuroepithelial variëren tussen individuele organoids. Meestal kan men verwachten ten minste twee grote (> 200 µm in diameter door D24) neurale rozetten per organoid. Om deze reden zijn longitudinale studies, zoals de waarneming van de verandering in organoid grootte na infectie, bijzonder verhelderend. Variabiliteit tussen de partijen kan zich ook voordoen, met de meest waarschijnlijke oorzaak hiervoor wordt onjuist cel tellen of zaaien. Het wordt aangeraden om veelvoudige tellingen en om ervoor te zorgen dat de celsuspensie is goed gemengd vóór het zaaien op de ULA U beneden 96-wells-platen.

Wanneer kweken organoids in ULA U beneden 96-wells-platen, plan bij het zien van aanzienlijke verdamping effecten rond de randen van de platen. Het is ideaal om deze putjes vullen met PBS en werken alleen met de center 60 putten. Als gevolg van de verdamping, zal organoids in de buitenste wells worden blootgesteld aan verschillende voorwaarden toe dan die in het midden, die waarschijnlijk gevolgen voor hun groei en differentiatie hebben zal. Kunt u dit te overwegen bij het plannen van het aantal organoids die nodig zullen zijn voor experimenten. Bovendien zal organoids beginnen te overwoekeren de 96-Wells-indeling na ongeveer 30 dagen, die zichtbaar als gevolg van de verkleuring van het kweekmedium worden zal. Als plan nemen de organoids voorbij de 30 dagen, is het aanbevolen om de organoids overbrengen in een ULA 24-well plaat. Voeren van de overdracht, gebruik van schaar te snijden een P1000 tip zodat de opening veel groter dan de organoids zelf is en de organoids door pipetteren overbrengen.

Menselijke cerebrale organoids houdt groot potentieel in het bevorderen van het veld begrip van neurologische en ziekte. Onderzoekers worden aangemoedigd om het protocol zo nodig wijzigen. Bijvoorbeeld, kon één implementeren patronen factoren ter verbetering van de efficiëntie van de differentiatie naar specifieke celtypes, waardoor ze de virale effecten op bepaalde anatomische gebieden verkennen. De neurologische effecten van ZIKV zijn nog slecht begrepen, maar deze nieuwe aanpak zal plaatsmaken onderzoekers een toegankelijk, snelle en hoge-doorvoer van onderzoek naar de mechanismen van de infectie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR	StemCell Technologies	5873
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X)	Gibco	10565-018	(+)2.438 g/L natriumbicarbonaat, (+)natriumpyruvaat
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502-048
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11140-050
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30029.02
Stericup Filter (500mL)	Millipore	220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom	Corning	7007
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)	Integra	4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible	Thermo Scientific	75007210
Culture Plate Centrifuge Rotor	Thermo Scientific	75005706
Vero Cells	ATCC	CCL-81	Voor virusexpansie, indien nodig
Zika Virus (Uganda Strain)	ATCC	VR-1838	Andere stammen kunnen worden gebruikt
Zika Virus (Puerto Rico Strain)	ATCC	VR-1843	Andere stammen kunnen worden gebruikt
phospho-vimentin	MBL	D076-3	muis polyklonaal,  1:250 verdunning
TBR2	Abcam	ab23345	konijn polyklonaal, 1:300 verdunning
MAP2	Novus	NB300-213	kip polyklonaal, 1:1500 verdunning
GFAP	Cell Signaling Technologies	CST12389S	konijn polyklonaal, 1:200 verdunning
D1-4G2 flavivirus envelop-eiwit	EMD Millipore	MAB10216	muis monoklonaal, 1:500 verdunning
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technologies	9661	konijn polyklonaal, 1:200 verdunning
488 anti-muis IgG	Thermo Fisher	A-11001	geit polyklonaal, 1:1000
594 anti-konijn IgG	Thermo Fisher	A-11037	geit polyklonaal, 1:1000 verdunning
647 anti-kip IgY	Thermo Fisher	A-21449	geit polyklonaal, 1:1000 verdunning