Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

6.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

3 augustus 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een eenvoudig protocol voor overexpressie en zuivering van codon-geoptimaliseerde, humane cis -prenyltransferase, onder niet-denaturerende omstandigheden, van Escherichia Coli , wordt beschreven, samen met een enzymatische activiteitstest. Dit protocol kan worden genegaliseerd voor de productie van andere cis- prenyltransferase eiwitten in hoeveelheid en kwaliteit geschikt voor mechanistische studies.

Samenvatting

Prenyltransferases (PT) zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylic difosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties. DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT (vorming van cis-dubbele bindingen van de condensatiereactie) die ketenverlenging van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) katalyseert via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP). DHDDS is van biomedisch belang, aangezien een niet-conservatieve mutatie (K42E) in het enzym resulteert in retinitis pigmentosa , wat uiteindelijk tot blindheid leidt. Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om grote hoeveelheden gezuiverde DHDDS te verkrijgen, geschikt voor mechanistische studies. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in cis -PT tussen verschillende soorten suggereert dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT, zoals die welke betrokken zijn bij synthetische synthetische rubber.

Inleiding

Prenyltransferasen zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylischifosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties 1 , 2 . Z-type enzymen katalyseren de vorming van cis dubbele bindingen uit de condensatiereactie, terwijl E-type enzymen trans- dubbelbindingsvorming 3 katalyseren. cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-type enzymen) zijn klassiek geclassificeerd volgens hun product ketenlengte in korte keten (C15), middellange-keten (50-55) en lange-keten (70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT die ketenverlenging katalyseert van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP) 1, 5 , 6 . Dit resulteert in de vorming van dehydrodolichyldifosfaat, een C 55-100 polyprenyldifosfaat dat als voorloper voor dolichylpyrofosfaat, de glycosyldragermolecuul betrokken bij N-gekoppelde eiwitglycosylering 1 dient . Bij Ashkenazi-joden resulteert een missense niet-conservatieve mutatie (K42E) in DHDDS autosomale recessieve retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om zuiverde DHDDS te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies.

Escherichia coli wordt beschouwd als de meest geschikte en kosteneffectieve gastheer voor recombinante eiwit expressie, en is daarom ook de meest gebruikte gastheer. Wanneer men echter eiwitten in E. coli heterologisch overexpresseert, moeten eiwitspecifieke overwegingen worden gemaakt. Verkrijgen van goed gevouwen, actiefE recombinante eiwitten uit E. coli , is niet een eenvoudige kwestie door de verschillende eigenschappen van verschillende eiwitten. Er zijn talrijke aanpak ontwikkeld om deze hindernissen te overwinnen. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in E. coli toe te staan . Van te voren was een eerdere poging om gist cis -PT te overexpressen zonder eiwitfusie mislukt door volledige onoplosbaarheid zelfs in aanwezigheid van detergent 12 . Het beschreven protocol is eenvoudig, kosteneffectief, tijdbesparend en maakt het mogelijk om DHDDS preparaten te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies. Gezien de homologie van cis -PT tussen verschillende soorten, raden we aan dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Klonen van cis -PT voor overexpressie in E. coli

  1. Verkrijg pET-32b expressievector, ontworpen voor klonen en expressie op hoog niveau van eiwitsequenties gefuseerd met het 109aa thioredoxine (TRX) eiwit 17 , en E. coli codon-geoptimaliseerde 18 coderende sequentie van cis -PT met volledige lengte.
  2. Zorg ervoor dat een TEV-protease-splitsingsplaats (tabak etsvirus protease) is gesplitst (ENLYFQ / G, waar "/" het splitsingspunt aangeeft) 9 gevolgd door een korte flexibele linker (SGSGSG, om de toegankelijkheid van de splitsingsplaats te verbeteren) stroomopwaarts van de cis -PT-volgorde ( Figuur 1 A ). Voeg ook geschikte 5 'en 3' restrictieplaatsen toe voor het klonen.
  3. Kloneer het gesynthetiseerde DNA-construct in de pET-32b vector door gebruik te maken van standaard ligatie technieken 10 .

2. OverexpreSsion van Human DHDDS in E. coli

  1. Transformeer E. coli T7 express bevoegde cellen met de TRX-fusion DHDDS construct volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Platte de getransformeerde cellen volgens de instructies van de fabrikant op LB-agar onder ampicilline selectieve condities (200 mg / L).
  3. Inoculeer geselecteerde kolonies in 100 ml LB-medium in 250 ml flessen startculturen met 100 mg / L ampicilline en incubeer overnacht bij 37 ° C met constante schudden bij 200 rpm.
  4. Inoculeer 80 ml van de kweek in twee 5 liter kolven (40 ml per fles), die elk 1,5 l 2x YT medium (16 g / l trypton, 10 g / l gist extract, 5 g / L NaCl) bevatten met 100 mg / L ampicilline.
  5. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met constante schudden bij 180 rpm totdat OD 600 nm = 0,5 bereikt wordt.
  6. Verlaag de temperatuur tot 16 ° C en induceer de cellen door 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen. conInkuberen onder dezelfde conditie gedurende 16-20 uur voor eiwituitdrukking.
  7. Oog de cellen door centrifugeren (10.000 x g gedurende 10 minuten).
    Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken; De cellenpelletjes dienen bij -80 ° C te worden gehouden tot zuivering.

3. Zuivering van menselijke DHDDS

  1. Resuspendeer de cellen in buffer A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM p-mercaptoethanol), 1 ug / ml DNase I en een proteaseremmersmengsel.
  2. Homogeniseer de cellen met behulp van een glas-Teflon-homogenisator.
  3. Ontwricht de cellen met behulp van een microfluidizer of equivalent bij 12.000 - 15.000 psi 11 .
  4. Centrifugeer het cellysaat bij 40.000 xg gedurende 45 min bij 4 ° C. Herstel de supernatant, die de oplosbare fractie bevat.
  5. Laad de supernatant op een 5 - 10 ml kobalt geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (Co 2+ -IMAC) 12 kolom met 10MM imidazool, gevolgd door grondig wassen met buffer A en 10 mM imidazool om nonspecifieke eiwitbinding te verminderen.
  6. Verwijder de overexpressieerde eiwitten met buffer A aangevuld met 250 mM imidazool.
  7. Verwijder imidazool door gebruik te maken van een 53 ml preparatieve ontzoutkolom geëquilibreerd met buffer A.
  8. Voeg 6xHis-getagged TEV protease (1 mg TEV protease per 50 mg eiwit) toe aan de geëlueerde eiwitten om hun 6xHis-getagde TRX-fusie-eiwit bij 4 ° C overnacht te verwijderen.
  9. Laad de gesplitste eiwitten op een Co 2+ -IMAC kolom, geëquilibreerd met buffer A aangevuld met 5 mM imidazool, om het gesplitste 6x His-getagde TRX-fusie-eiwit en TEV-protease te verwijderen.
  10. Verzamel de doorstroming en concentreer op 3 - 4 ml met behulp van een 30 kDa molecuulgewicht afsnijcentrifugaalfilter.
  11. Laad het geconcentreerde eiwit op een superdex-200 grootte-exclusion chromatografie kolom geëquilibreerd met buffer A voor de uiteindelijke zuivering. Het eiwit eluteert als een dimer (~ 76 kDa).
  12. Selecteer relevante fracties door het elutieprofiel te vergelijken met een kolomkalibratiekromme.
  13. Bepaal de zuiverheid van het preparaat met SDS-PAGE.
  14. Bepaal de eiwitconcentratie die nodig is voor stroomafwaartse experimentatie en flash-bevriezen aliquots van gezuiverde, geconcentreerde eiwitten in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C tot gebruik.

4. Analytische grootte-uitsluiting chromatografie (SEC)

  1. Om het vermogen van het eiwit om de vries-ontdooicyclussen te verdragen, dient u een aliquot van de bevroren eiwitten te ontdooien en gedurende 10 minuten bij 21.000 x g te centrifugeren om onoplosbare aggregaten te verwijderen. Verzamel de supernatant.
  2. Laad de eiwitten op een superdex-200 analytische kolom, vooraf geëquilibreerd met 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM P-mercaptoethanol, onder toepassing van een ultraprestaties vloeistofchromatografie systeem 13 , 14 .
  3. Monitor tryptofaan fluorScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) om het elutie-elutieprofiel van de eiwitten te detecteren. Zorg ervoor dat u een geldige kalibratiekromme hebt voor het bepalen van de molecuulgewicht. Deze curven zijn verkrijgbaar via de SEC-kolomfabrikanten.

5. Enzym Kinetiek - Tijdafhankelijke Activiteit 15 , 16 , 17

  1. Om de activiteit van het gezuiverde eiwit te waarborgen, meng 5 uM gezuiverd DHDDS met 10 pM en 50 pM FPP 14C-IPP de reactie in buffer A te leiden met 0,5 mM MgCl2 bij 22 - 30 ° C.
    Opmerking: De exacte reactieomstandigheden kunnen variëren met preparaten van cis -PTs die verschillen van DHDDS. Bovendien hangt de activiteit van DHDDS ook af van de temperatuur en [Mg 2+ ].
    Let op: 14 C-IPP is radioactief en dient volgens de plaatselijke stralingsveiligheidsvoorschriften te worden gebruikt.
  2. 15 μL monsters uit de reactie op 0, 2, 4 en 6 uur opnemen, na onmiddellijke quenching van de reactie door toevoeging van 15 μl buffer A aangevuld 20 mM EDTA (tot een eindconcentratie van 10 mM EDTA).
  3. Voeg 1 ml H2O-verzadigd 1-butanol en vortex grondig de reactieproducten te extraheren.
    Opmerking: het protocol kan hier gestopt worden en de monsters kunnen worden bewaard voor latere lezing.
  4. Voeg scintillatiecocktail toe aan de monsters en, met behulp van een scintillatieteller, kwantificeer reactieproducten in de butanolfase 14 C, samen met de radioactiviteit van 15 ul uit het reactiemengsel, dat de totale radioactiviteit vertegenwoordigt.
  5. Trek de achtergrondwaarden af, gemeten met behulp van de 0 h monsters van elk tijdstip en bereken het percentage van 14 C-IPP dat wordt gebruikt.
  6. Bereken de netto 14 C-IPP-integratie op elk tijdstip door het percentage te berekenen dat wordt gebruikt uit het totaal van 14 C-IPP concentraties, en plot de resultaten als een functie van de tijd. Een stijging van de netto 14 C-IPP-integratie met de tijd wordt verwacht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Algemeen overzicht van het hier gebruikte constructie en het zuiveringsproces worden getoond in Figuur 1 . De bij elke zuiveringsstap verkregen monsters worden getoond in figuur 2 . Deze SDS-PAGE analyse toont de stapsgewijze zuivering van DHDDS, wat resulteert in een sterk gezuiverd product. Figuur 3 toont de resultaten van analytische SEC van het gezuiverde enzym, waarbij wordt gebleken dat het ei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol dat hier wordt beschreven voor zuivering van functionele humane DHDDS in E. coli cellen is eenvoudig en efficiënt, waardoor men het eiwit over 3-4 dagen kan uitdrukken en zuiveren zodra een geschikt construct beschikbaar is. Dergelijke protocollen voor eiwitzuivering zijn van bijzondere betekenis gegeven door de doorbraken in genoomsequentiebepaling, die veel informatie verschaft over de genetica van vele ziekten 18 , waardoor de ontwikkeling van high-throughputmethoden vere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het Israëlic Science Foundation's Center for Research Excellence (I-CORE) in de Structurele Celbiologie (1775/12) en de Israëlic Science Foundation verleent 1721/16 en 2338/16 (YH) en 825/14 (DK ). De steun van de Fields Estate Foundation naar DK wordt zeer gewaardeerd. Dit werk werd uitgevoerd door Ilan Edri en Michal Goldenberg in gedeeltelijke vervulling van de MD thesis eisen van de Sackler Faculteit Geneeskunde, Tel Aviv University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency)NEBC3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
TALON-superflow harsGE Healthcare28-9574-99
HiPrep 26/10 ontzouting kolom GE Healthcare17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Healthcare28989335
superdex-200 increase 5/150 GL GE Healthcare28990945
14C-Isopentenyl pyrofosfaatPerkin-ElmerNEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrofosfaatSigma44270-10MG

Referenties

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

DHDDS overexpressieeiwitzuiveringenzymatische activiteitsassaycodonoptimalisatiekobalt affiniteitschromatografiegrootte uitsluitingschromatografieSDS PAGE analyseretinitis pigmentosaisopreno desynthese
Overexpressie en zuivering van het menselijk Cis -prenyltransferase in Escherichia coli
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.