Method Article

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vele uitzonderlijke vooruitgang geboekt in de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomics, met bijzondere technische vooruitgang in vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie tandem (LC-MS/MS) en isobaar labeling multiplexing capaciteit. Hier introduceren we een diep-proteomics profiling protocol dat 10-plex tandem massa tag (TMT combineert) labelen met een uitgebreide LC/LC-MS/MS platform, en na MS computationele interferentie correctie op het hele proteomes nauwkeurig te kwantificeren. Dit protocol omvat de volgende hoofdstappen: eiwit extractie en spijsvertering, labelen van de TMT, 2-dimensionale (2D) LC, hoge-resolutie massa spectrometrie en computationele gegevensverwerking. Kwaliteitscontrole stappen zijn opgenomen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Meer dan 10.000 eiwitten in zoogdieren monsters kunnen vol vertrouwen met dit protocol worden quantitated. Dit protocol kan ook worden toegepast op de kwantificatie van post-vertalende wijzigingen met kleine wijzigingen. Deze methode multiplexed, robuuste biedt een krachtige tool voor proteoom analyse in een verscheidenheid van complexe monsters, met inbegrip van celkweek, dierlijke weefsels en menselijke klinische specimens.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in de technologie van de volgende generatie sequencing hebben geleid tot een nieuw landschap voor de studie van biologische systemen en ziekten bij de mens. Dit heeft een groot aantal metingen van het genoom, transcriptome Proteoom, metabolome en andere moleculaire systemen tot tastbare toegestaan. De Spectrometrie van de massa (MS) is een van de meest gevoelige methoden in de analytische chemie, en de toepassing ervan in proteomics is snel uitgebreid na de sequencing van het menselijk genoom. Op het gebied van proteomics, hebben de afgelopen jaren grote vooruitgang in op basis van MS kwantitatieve analyses, met inbegrip van isobaar labeling en multiplexin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Raadpleeg alle relevante gegevens omtrent de veiligheid (d.w.z., MSDS) vóór gebruik. Gebruik bij het uitvoeren van dit protocol op alle passende veiligheidspraktijken.

Opmerking: een TMT 10-plex isobaar label reagens set wordt gebruikt in dit protocol voor het proteoom kwantificatie van 10 monsters.

1. voorbereiding van de cellen/weefsels

Opmerking: het is van cruciaal belang voor het verzamelen van monsters in minimale tijd bij lage temperatuur om te houden van de eiwitten in hun oorspronkelijke biologische toestand.

  1. Wash Adherente cellen (bijvoorbee....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten een eerder beschreven Kruis-soorten peptide mix om systematisch analyseren het effect van de compressie verhouding in 3 stappen van de grote protocol, met inbegrip van pre-MS fractionering, MS-instellingen en post-MS correctie23. De pre-MS fractionering werd geëvalueerd en geoptimaliseerd met behulp van een combinatie van fundamentele pH RPLC en zure pH RPLC. Voor de analyse van de post-MS, werden alleen soortspecifieke peptiden beschouwd. We gebruikt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een hoge-doorvoer-protocol voor de kwantificatie van eiwitten met een 10-plex isobaar labeling strategie, die is met succes geïmplementeerd in verschillende publicaties12,13,14,32 . In dit protocol, kunnen we maximaal 10 verschillende biologische EiwitSteekproeven in 1 experiment analyseren. We kunnen routinematig identificeren en kwantificeren van ruim 10.000 eiwitten met hoge v.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken alle andere lab en faciliteit leden voor nuttige discussie. Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door NI H verleent R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 en ALSAC. De MS-analyse werd uitgevoerd in de St. Jude Children's Research Hospital Proteomics Facility, slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH Cancer Center ondersteuning subsidie P30CA021765. De auteurs bedanken Nisha Badders voor hulp bij het bewerken van het manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1220 LC systemAgilentG4288B
50% HydroxylamineThermo Scientific90115
AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeaterPhoenix S&TPST-BPH-20
C18 tipsHarvard Apparatus74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formic acidSigma94318
Fraction CollectorGilsonFC203B
Glass BeadsNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
Mass SpectrometerThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self Pck ColumnsNew ObjectivePF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholateSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagentThermo Scientific90110
Trifluoroacetic acid (TFA)Applied Biosystems400003
TrypsinPromegaV511C
UreaSigmaU5378
Xbridge Column C18 columnWaters186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

Related Articles