Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56498

⸱

8 december 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Samenvatting

Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor verschillende ziekten bij de mens en een nuttig instrument voor een toenemend aantal experimentele studies die, verspreid over fundamentele ontwikkelingsbiologie via aan grootschalige genetische en chemische schermen. Echter, veel experimenten, met name die met betrekking tot infectie en xenograft modellen, rekenen op microinjection en beeldvorming van embryo's en larven, die moeizaam technieken die vaardigheid en expertise vereisen. Ter verbetering van de precisie en de doorvoer van huidige microinjection technieken, ontwikkelden we een reeks van microstructured apparaten te oriënteren en stabiliseren van de zebravis embryo's op 2 dagen post bevruchting (dpf) in ventrale, dorsal of laterale richting voorafgaand aan de procedure. Om te helpen bij de beeldvorming van embryo's, ontwierpen we ook een eenvoudig apparaat met kanalen die 4 zebrafish lateraal parallel tegen een glas cover slip oriënteren. Samen, tonen de instrumenten die wij hier presenteren de effectiviteit van photolithographic benaderingen voor het genereren van nuttige apparaten voor de optimalisatie van de zebravis technieken.

Inleiding

Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor veel velden uit studies van de fundamentele ontwikkelingsbiologie aan grootschalige genetische en chemische schermen1,2. Routine genetische manipulaties, zoals overexpressie van het gen, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese en Transgenese afhankelijk van microinjection van genetisch materiaal in de zygote eencellige, die heeft geleid tot de ontwikkeling van eenvoudige, easy-to-use, commercieel beschikbare hulpmiddelen voor oriënteren en eieren voor injectie3te stabiliseren. Andere benaderingen, zoals transplantatie en infectie, vereisen vaak microinjection in later stadium embryo's en larven met grotere spoorbreedte capillaire naalden4. Gebruik van grotere spoorbreedte naalden kampt echter met grote technische uitdagingen, zoals het is moeilijker om te penetreren het doelweefsel is terechtgekomen zonder duwen of rollen van het embryo. Onder deze omstandigheden wellicht het verkrijgen van de juiste water spanning nodig om te stabiliseren van het embryo, terwijl het vermijden van drogen tijdens de procedure moeilijk is, en de embryo's niet ideaal georiënteerd voor injectie in het doelweefsel.

Naar aanleiding van microinjection is het vaak handig om het scherm van de geïnjecteerde embryo's te selecteren die met succes zijn ingespoten en opnames van de eerste tijdstip. Om deze uitdagingen, hebben we een waaier van microstructured apparaten die bijdragen aan het stabiliseren van 2 dpf-embryo's in verschillende richtingen microinjection5, zowel voor snelle beeld-gebaseerde screening na injectie.

Voor het verkrijgen van voldoende structurele resolutie in deze apparaten, we photolithographic technieken gebruikt. Gebruikte micro-elektronische industrieën en meer onlangs geëxtrapoleerd naar microfluidic fabricage, kunnen deze benaderingen verticale structuren, variërend van 1-1000 µm, een schaal geschikt voor manipulatie van zebravis embryo's en larven. Alle apparaten werden vervaardigd gebruikend Polydimethylsiloxaan (PDMS), die goedkoop, fysiek robuuste biologisch inert en transparant is.

Microstructured oppervlakte matrices (MSAs) werden opgemaakt als blokken voor PDMS met een patroon bovenvlak, analoog aan de eenvoudige kanalen in agarose blokken gebruikte voor ei microinjection. Voor na injectie voorstelling kan 6 imaging-apparatuur worden gekleed in een standaard glassbottom 6-well plaat. Deze apparaten zijn ontworpen voor het eenvoudig laden van embryo's, terwijl de lossen procedure kan gunstig redding van specifieke embryo's, vergemakkelijken van beeld-gebaseerde benaderingen in een meer gebruikersvriendelijke manier dan die apparaten screening eerder ontwikkeld door de Beebe laboratorium6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Microinjection van larven werd goedgekeurd door het Massachusetts algemene ziekenhuis Subcommissie onderzoek Animal Care onder Protocol 2011N000127.

1. apparaat Fabrication

Opmerking: Alle computer assisted tekening (CAD) bestanden gebruikt om te ontwerpen fotolithografie maskers hier beschreven (Figuur 1) zijn beschikbaar voor download. Zie tabel van materialen voor links.

  1. Het zegel van de master mold in een klasse 1.000 cleanroom met standaardtechnieken photolithographic7fabriceren. Patroon voor de microstructuur matrices en kanalen, de epoxy gebaseerde negatieve fotoresist opeenvolgend in 3 lagen met behulp van 3 afzonderlijke maskers, volgens de instructies van de fabrikant: 100 µm voor de ondiepe functies, 200 µm voor de middellange functies en 400 µm voor de diepe functies. Voor het beeldapparaat lagen patroon twee met behulp van 400 µm voor de ondiepe functies en 600 µm voor de diepe functies.
  2. Tape de voltooide wafer aan de basis van een 15 cm petrischaal voor het gieten (Figuur 2).

2. voorbereiding van de Microstructured oppervlakte Arrays - PDMS

  1. Gegoten om bruikbare apparaten, Polydimethylsiloxaan (PDMS), met behulp van de master wafer als een mal. 50 g PDMS monomeer combineren met 5 g van initiatiefnemer en meng in een plastic wegen schotel met een plastic vork.
  2. Giet mengsel zorgvuldig de mal.
  3. Ontgas in een vacuüm exsiccator op 16-25 inHg (54-85 kPa) gedurende 1 uur.
  4. Om te genezen het PDMS, bak bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur. De PDMS moeten genezen aan een sterke maar flexibele solid.
  5. Zorgvuldig gesneden rond het apparaat op de master wafer met behulp van een scalpel, ervoor zorgend om het onderhouden van contact tussen het uiteinde van de scalpel en het oppervlak van de wafer. Met behulp van Tang, schil de PDMS replica uit de buurt van de wafer en overdracht aan een schone 10 cm petrischaal, functie kant naar boven (Figuur 3).
  6. Behandel het apparaat met zuurstof plasma met behulp van een plasma-oven voor 35 s tot het verminderen van hydrophobicity.
  7. Bedek met de zebravis embryo medium (E3) met 168 mg/L ethyl 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Verwijder alle bubbels uit diepere functies door het stromende water over het oppervlak van het apparaat met behulp van een precisiepipet overdracht.

3. bereiding van Microstructured oppervlakte Arrays - Agarose

  1. Om een negatieve PDMS schimmel, eerst een PDMS apparaat met zuurstof plasma te behandelen.
  2. Behandel het PDMS apparaat met 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane damp te creëren een inert oppervlakte8. Kort:
    1. Plaats de PDMS als functie-side-up van de behandelde in een vacuuemcel in een zuurkast.
    2. Naast het PDMS, plaats een kleine open glazen of aluminium schaal en zorgvuldig Pipetteer 200 µL van PFDTS (98% silane) in de schotel.
      Let op: PFDTS silane is zeer vluchtige, reageert heftig met water, is brandbaar en veroorzaakt schade voor huid en ogen op contact. Lees MSDS in detail vóór gebruik.
    3. Sluit de Vacuuemcel en toepassen van vacuüm gedurende 15-30 min of totdat de PFDTS silane volledig is verdampt.
  3. Plaats het apparaat in een petrischaal en gebruiken als een mal voor verse PDMS, voorbereid zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
  4. Bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur, bak dan schil de hele laag van verse PDMS van het behandelde apparaat en plaats in een verse petrischaal. Dit kan vervolgens worden gebruikt als een negatieve mal te gieten agarose.
  5. Ter voorbereiding van agarose, kook een 2%-oplossing van lage gelerend temperatuur agarose in E3 in een magnetron totdat de agarose is volledig opgelost.
  6. Giet de hete agarose over de PDMS negatieve schimmel en verwijder alle bubbels in de agarose die betrekking hebben op het apparaat door stromend warm agarose over de kenmerken met een pipet overdracht.
  7. Zodra bubbels zijn verwijderd, koelkast bij 4 ° C tot het instellen van het agarose.
  8. Het agarose blok uit de negatieve PDMS schimmel verwijderen door het vervormen van het PDMS van onder met de hand, het blok agarose overbrengen in een nieuwe petrischaal en nat met E3 met MS-222.

4. voorbereiding van PDMS Imaging-apparatuur

  1. Gegoten om bruikbare apparaten, PDMS, met behulp van de master wafer als een mal. 50 g PDMS monomeer combineren met 5 g initiatiefnemer (hetzelfde als gebruikt in stap 2.1) en meng grondig in een plastic wegen schotel met een plastic vork.
  2. Giet mengsel zorgvuldig de mal.
  3. Ontgas in een vacuüm exsiccator op 16-25 inHg (54-85 kPa) gedurende 1 uur.
  4. Om te genezen het PDMS, bak bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur. De PDMS moeten genezen aan een sterke maar flexibele solid.
  5. Gesneden van de apparaten uit de Master Wafer en punch out poorten met behulp van een punch van 1,5 mm.
  6. Behandelen de apparaten en een 6-well glas-bodem goed met zuurstof plasma voor 35 plaat s, zoals beschreven in stap 2.6.
  7. Obligatie apparaat functie-side-down van de één naar elk glas dekglaasje aan van de 6-well plaat door deze te plaatsen op een kookplaat 85 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Om te bevestigen succesvolle hechting, stevige druk uitoefenen op één zijde van het gekleefde apparaat met behulp van de verlostang. Het apparaat moet blijven verbonden met de glazen dekglaasje aan.

5. Zebrafish cultuur

  1. Cultuur zebrafish de embryo's naar 2 dpf met standaardtechnieken3.
  2. Dechorionate embryo's gebruik van pincet of 1 mg/mL protease Meng (Zie materialen tabel)3 ten minste 30-60 minuten vóór het laden op apparaat, te laten rechtzetten.
  3. Anaesthetize embryo's (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) door toevoeging van 25 X 1 mL stockoplossing aan de E3 met hun petrischaal.

6. oriëntatie van zebravis op Microstructured oppervlak - Divot Arrays

  1. Bereid het PDMS blok uit stap 2.7 (figuur 3A) in haar petrischaal zodanig zijn dat het is bedekt met een laag van dunne (1-2 mm) van E3, waardoor gemakkelijker manipulatie van de embryo's.
  2. Vereiste aantal embryo's (over het algemeen 10-20 per voorwaarde) overbrengen op het oppervlak van het PDMS blok met behulp van een precisiepipet overdracht.
  3. Met behulp van een micromanipulation-tool (haar lus of gelijkaardig), duw de embryo's in de microstructured divots (figuur 3A). Gebruik van divots is bijzonder geschikt voor dorsale en ventrale oriëntaties.
    Opmerking: Voor de divots met een strakkere passen (dorsale en ventrale), probeer positionering van de embryo's op het oppervlak van het blok in parallel aan de divot, en dan rollen ze in positie met behulp van een lus van de haren. Het duwen van hen dieper in de divot zal helpen hen om stabiel te houden.

7. richting van de zebravis op Microstructured oppervlak - Microstructured kanalen

  1. E3 trekken uit het PDMS blok patroon met microstructured kanalen (figuur 3B) met behulp van een precisiepipet van de overdracht tot het niveau van de E3 zakt tot onder de rand van het blok, maar nog steeds aanwezig in het reservoir en de kanalen en in een dunne laag op de PDMS is.
  2. Pipetteer 10 embryo's uit stap 5.3 in het reservoir met behulp van een precisiepipet overdracht, dat evenwel niet tot overloop van de randen.
  3. Met behulp van een haar lus, manipuleren van elk embryo in de trechter bij de ingang van het juiste kanaal en oriënteren zodanig dat het hoofd van het embryo is de richting van het kanaal en het embryo de juiste afdrukstand heeft als het binnenkomt het kanaal.
  4. Schuif elk embryo neer het kanaal met behulp van een lus haar, totdat zij de oriënterende microfeatures in de muren van het kanaal die helpen tot te houden in plaats. Gebruik van microstructured kanalen wordt met name aanbevolen voor de laterale richting.
    Opmerking: Verklein embryo glijden tijdens microinjection en proberen de hoeveelheid oppervlaktespanning aanpassen door E3 te trekken uit het reservoir.

8. microinjection van zebravis

  1. Bereiden van microinjection naald.
    1. Maken van borosilicaatglas microcapillary naalden met behulp van een micropipet-trekker als eerder beschreven4. De resulterende naalden moeten worden kegelvormige tot een punt aan de ene kant, met een conus lengte van ongeveer 10 mm.
    2. Oplossing voor injectie, in dit geval 100 nM chemoattractant bereiden (N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanine (fMLP) of leukotriënen B4 (LTB4)) en 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran tracer in PBS.
    3. 5 µL van de oplossing in de naald met behulp van een precisiepipet fijn taps toelopende laden tip (Zie materialen tabel).
    4. Monteer de naald in een micromanipulator op een magnetische standaard gemonteerd en aangesloten op een picopump microinjector.
  2. Breek het puntje van de naald onder een hoek van 45 ° door knijpen de taps toelopende tip met een tang.
  3. Aanpassen van de grootte van de bolus van de injectie tot 1 nL door de injectie tijd op de picopump-controller aan te passen.
  4. Pas de hoek van de microinjection naald. Een naald hoek van 45 ° op de micromanipulation controller is over het algemeen een goed uitgangspunt, met de naald parallel aan de lengte van het embryo. Een steilere invalshoek kan worden gebruikt om te minimaliseren van de zijdelingse beweging van het embryo tijdens microinjection.
  5. Beheersing van de petrischaal met de linkerhand en de micromanipulator van de naald met de juiste, breng de naald zo dicht mogelijk aan de gewenste site van microinjection, in dit geval de otic blaasje.
    Opmerking: De otic blaasje kan worden geïdentificeerd als de langwerpige orgel posterieure voor het oog met twee kleinere afzonderlijke donkere langwerpige structuren (Otolieten).
  6. Met behulp van de micromanipulation-controller, penetreren het doelweefsel (in dit geval de otic vesikel) zodanig dat het uiteinde van de naald binnen het blaasje is en injecteren van de vooraf ingestelde volume met behulp van de picopump-voetschakelaar.
    Opmerking: Als het weefsel penetratie weerstaat, probeer zachtjes te tikken op de knop van de controller micromanipulation.
  7. Als u wilt vrijgeven van de embryo's, stromen E3 over het oppervlak van boven naar beneden met behulp van een precisiepipet overdracht, of door de schotel wervelende zodanig zijn dat de embryo's worden vrijgelaten in de omliggende E3.
  8. De embryo's overbrengen in een herstel schotel van E3 zonder MS-222 met behulp van een precisiepipet overdracht.

9. screening van embryo's met behulp van het Imaging apparaat PDMS

  1. Prime het apparaat uit stap 4.7 met vloeiende E3 (+ MS-222) via de poort. Dit kan gedaan worden met behulp van een pipet 1.000 µL of een smalle-tip overdracht pipet.
  2. Vul de put met E3 + MS-222 totdat het apparaat is gedekt.
  3. 4 ingespoten embryo's van stap 8,7 in elke goed met behulp van een pipet overdracht leveren. Embryo's kunnen vooraf narcose indien gewenst door broeden in E3 + MS-222 voor 1-2 min vóór het laden (stap 5.3).
  4. Met behulp van een micromanipulation-tool (haar lus of gelijkaardig) oriënteren de embryo's bij de ingangen van de beeldvorming kanalen in de gewenste richting (staart-eerste of hoofd-eerste, afhankelijk van het apparaat gebruikt) en duw ze gedeeltelijk in het apparaat (figuur 4A). Dit zal helpen trekken ze gelijkmatig in het apparaat.
  5. Trekken E3 door het apparaat uit de poort met een 1.000 µL pipet of overdracht Pipetteer totdat de embryo's zijn getrokken in de kanalen in de juiste stand voor imaging (figuur 4B).
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te zuigen van de embryo's voorbij de punt van de overlapping, dit zal schade toebrengen aan de embryo's en veranderen hun geaardheid.
  6. Well-plate overbrengen Microscoop voor imaging (figuur 4C).
  7. Beeld met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop.
    1. Vergroting aanpassen door te selecteren van de juiste lens. 10 X is meestal een nuttige vergroting voor imaging zebrafish neutrofiele migratie.
    2. Intensiteit van de lichtbron en belichtingstijd voor elk kanaal zodanig aanpassen dat elk signaal duidelijk, maar niet verzadigd is.
    3. Opnamen voor elk kanaal. Hier, we gebruikten groen fluorescente proteïne (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) en uitgezonden kanalen. Meerkanaals afbeeldingen kunnen worden gecombineerd tijdens post-processing (figuur 4B-Ik).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven aanpak toont het ontwerp (Figuur 1) en de vervaardiging van apparaten voor gebruik met 2 dpf zebravissen, met behulp van photolithographic (Figuur 2) en soft-lithografische (Figuur 3) technieken. Deze methode maakt het mogelijk snel testen van vele ontwerp iteraties en wijzigingen en aanpassingen en optimalisatie van de microstructuur afmetingen voor gebruik met zebravissen in ande...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we het gebruik van apparaten we onlangs ontwikkeld om 2 dpf zebrafish microinjection5te vergemakkelijken, en de invoering van een eenvoudige agarose-gratis montage apparaat voor handige beeldvorming van embryo's. Deze hulpprogramma's markeren het nut van photolithographic technieken voor de fabricage van apparaten die nuttig zijn voor de zebravis technieken.

Wij hebben gevonden MSA apparaten vooral handig voor injectie van cellen of deeltjes vatbaar voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank David Langenau royaal voorzien van aquarium ruimte; Eric Stone, John C. Moore en Qin Tang voor helpen met onderhoud van de zebravis en reagentia, en Anne Robertson en Elliott Hagedorn van Leonard Zon van lab voor de aanschaf van de stam van de zebravis hier gebruikt. Ze wil ook bedanken Octavio Hurtado voor advies over photolithographic technieken. FE werd gefinancierd door beurzen uit de Shriner ziekenhuis voor kinderen en de American Australian Association. Dit werk werd gefinancierd door de NIH GM92804 verlenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0.5KGVoor het gieten van de apparaten. Kit bevat PDMS monomeer en Initiator
Low gelling temperature agaroseSigma AldrichA9414-10GVoor het gieten van agarose apparaten
PFDTS silaneSigma Aldrich448931-10GVoor het gieten van negatieve PDMS mallen
Tricaine (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GOm zebravissen te verdoven
Rhodamine Dextran 70,000 DaThermoFisherD1818Om microinjecties te traceren
Leukotriene B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Neutrofiel chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNeutrofiel chemoattractant
15 cm Petri schotelFisher scientific08-757-148Voor het gieten vanaf de master wafer
Glasbodem 6-well platenMatTekP06G-0-20-FVoor beeldvorming apparaten
Borosilicaat glas microcapillairenWorld Scientific InstrumentsTW-100-4Voor microinjectienaalden
Transfer pipettenSigma AldrichZ350796Voor het overbrengen van zebravis embryo's
Microloader tipsFisher scientificE5242956003Voor het laden van de microinjectienaalden
Harris Uni-Core 1.5 mm punchTed Pella Inc.15111-15Om poorten in PDMS beeldvorming apparaten te ponsen
No. 11 ScalpelFine Science Tools10011-00Voor het snijden van PDMS
Dumont No. 5 ForcepsFine Science Tools11252-10Voor het dechorioneren van embryo's en het breken van microinjectienaadlen tips
Marzhauser MicromanipulatorASIMM33-RVoor het manipuleren van de microinjectienaad
Magnetische standaardMSCSPI - 87242624Voor het monteren van de micromanipulator
MPPI-3 Picopump controllerASIMPPI-3Om het microinjectievolume en timing te regelen
EVOS inverted fluorescent microscoopThermoFisherEVOS FLOm geïnjecteerde embryo's te beeldvormen
Dissectie microscoopNikonSMZ745Voor het visualiseren van microinjectie
AutoCAD softwareAutodeskDownload AutoCAD bestanden van: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 en op de ZFIN community protocollen wiki pagina: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  

Referenties

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
  3. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
  4. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  5. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
  6. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  7. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
  8. Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
  9. Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
  10. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636(2013).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
  12. Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
  13. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
  14. Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
  15. Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
  16. Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
  17. Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792(2014).
  18. Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630(2012).
  19. Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
  20. Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
  21. Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Microinjectie bij zebravissenembryo-oriëntatiebeeldvormingskanalenPDMS-blokmanipulatie met haarlusPICO-pompfluorescentiemicroscopieotische blaasneutrofielrekrutering
Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.