Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Summary

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Abstract

Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor verschillende ziekten bij de mens en een nuttig instrument voor een toenemend aantal experimentele studies die, verspreid over fundamentele ontwikkelingsbiologie via aan grootschalige genetische en chemische schermen. Echter, veel experimenten, met name die met betrekking tot infectie en xenograft modellen, rekenen op microinjection en beeldvorming van embryo's en larven, die moeizaam technieken die vaardigheid en expertise vereisen. Ter verbetering van de precisie en de doorvoer van huidige microinjection technieken, ontwikkelden we een reeks van microstructured apparaten te oriënteren en stabiliseren van de zebravis embryo's op 2 dagen post bevruchting (dpf) in ventrale, dorsal of laterale richting voorafgaand aan de procedure. Om te helpen bij de beeldvorming van embryo's, ontwierpen we ook een eenvoudig apparaat met kanalen die 4 zebrafish lateraal parallel tegen een glas cover slip oriënteren. Samen, tonen de instrumenten die wij hier presenteren de effectiviteit van photolithographic benaderingen voor het genereren van nuttige apparaten voor de optimalisatie van de zebravis technieken.

Introduction

Zebravis hebben ontpopt als een krachtig model voor veel velden uit studies van de fundamentele ontwikkelingsbiologie aan grootschalige genetische en chemische schermen^1,2. Routine genetische manipulaties, zoals overexpressie van het gen, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese en Transgenese afhankelijk van microinjection van genetisch materiaal in de zygote eencellige, die heeft geleid tot de ontwikkeling van eenvoudige, easy-to-use, commercieel beschikbare hulpmiddelen voor oriënteren en eieren voor injectie³te stabiliseren. Andere benaderingen, zoals transplantatie en infectie, vereisen v....

Protocol

Microinjection van larven werd goedgekeurd door het Massachusetts algemene ziekenhuis Subcommissie onderzoek Animal Care onder Protocol 2011N000127.

1. apparaat Fabrication

Opmerking: Alle computer assisted tekening (CAD) bestanden gebruikt om te ontwerpen fotolithografie maskers hier beschreven (Figuur 1) zijn beschikbaar voor download. Zie tabel van materialen voor links.

1. Het zegel van de master mold in een klasse 1.000 cleanroom met standaardtechnieken photolithographic⁷fabriceren. Patroon voor de microstructuur matrices en kanalen, de epoxy gebas....

Results

De hier beschreven aanpak toont het ontwerp (Figuur 1) en de vervaardiging van apparaten voor gebruik met 2 dpf zebravissen, met behulp van photolithographic (Figuur 2) en soft-lithografische (Figuur 3) technieken. Deze methode maakt het mogelijk snel testen van vele ontwerp iteraties en wijzigingen en aanpassingen en optimalisatie van de microstructuur afmetingen voor gebruik met zebravissen in ande.......

Discussion

Hier beschrijven we het gebruik van apparaten we onlangs ontwikkeld om 2 dpf zebrafish microinjection⁵te vergemakkelijken, en de invoering van een eenvoudige agarose-gratis montage apparaat voor handige beeldvorming van embryo's. Deze hulpprogramma's markeren het nut van photolithographic technieken voor de fabricage van apparaten die nuttig zijn voor de zebravis technieken.

Wij hebben gevonden MSA apparaten vooral handig voor injectie van cellen of deeltjes vatbaar voo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki