Methodenartikel

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

DOI:

10.3791/56606

⸱

8 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immune cellen zijn belangrijke componenten van de communicatie van de tumor en tumorgroei en evolutie beïnvloeden in alle stadia van carcinogenese. Met name nu ook vaststaat dat de immuun infiltreren in menselijke tumoren met de prognose en respons op therapie correleren kan. De analyse van de immuun infiltreren in de communicatie van de tumor is uitgegroeid tot een grote uitdaging voor de classificatie van patiënten en de reactie op behandeling.

De co uitdrukking van remmende receptoren zoals programma cel dood eiwit 1 (PD1; ook bekend als CD279), cytotoxische T-lymfocyten geassocieerde eiwit 4 (CTLA-4), T-cel Immunoglobulin Mucin bevattende eiwitten-3 (Tim-3; ook bekend als CD366) en lymfocyt Activering gen 3 (Lag-3; ook bekend als CD223), is een kenmerk van T cel uitputting. We ontwikkelden een multiparametric in situ immunofluorescentie kleuring te identificeren en te kwantificeren op cellulair niveau de co uitdrukking van deze remmende receptoren. Op een retrospectieve serie van bevroren weefsel van renaal cel carcinomen (RCC), met behulp van een fluorescentie multispectrale imaging technologie in combinatie met de software van de analyse van een afbeelding, bleek dat mede uiting van PD-1 en Tim-3 op tumor infiltreren CD8+ T cellen is gecorreleerd met een slechte prognose in RCC. Om onze kennis, dit is de eerste studie waaruit blijkt dat dit geautomatiseerd multiplex in situ technologie wellicht sommige klinische relevantie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren, heeft immunotherapie ontpopt als een zeer veelbelovende behandeling voor vele soorten van kanker, met inbegrip van de RCC. Bijzonder, immunotherapie, gebaseerd op de remming van remmende checkpoints als PD-1 en CTLA-4 is gemeld te worden klinisch effectief1,2,3,4,5, 6. monoklonale antilichamen tegen CTLA-4, PD-1, of programma dood Ligand 1 (PD-L1) zijn al goedgekeurd in verschillende kankers en leiden tot langdurige klinische reacties in meer dan 20% van de patiënten7. Echter niet alle patiënten responders, de kosten van de behandeling is hoog, en deze behandelingen zijn giftig, wat leidt tot potentiële ernstige bijwerkingen van de auto-immune-achtige. Daarom is de huidige uitdaging het identificeren van voorspellende markers aan die nieuwe immuuntherapie. Het tempo van de mutaties in de tumor, de uitdrukking van PD-L1 of de niveaus van intratumoral CD8+ T cel infiltratie gemeld te correleren met de klinische respons. Deze vereniging is echter nog steeds te zwak om te raden het gebruik van deze klinische biomarkers in de klinische praktijk met uitzondering van de test van de metgezel voor PD-L1 vóór de administratie voor Pembrolizumab in niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK) patiënten8 ,9,1011,12. Het is aangetoond dat de co uitdrukking van vele remmende receptoren als PD-1, Tim-3, Lag-3, en CTLA-4, induceert een cel uitputting fenotype en weerstand tegen therapie13,14,15. Aangezien perifeer bloed niet representatief zijn voor de communicatie van de tumor is, is het van groot belang voor het analyseren van de fenotypische kenmerken van de cellen in situ. PD-1 en Tim-3 mede waarin T-cellen zitten bekend voor zitten functioneel verminderde cellen in verschillende contexten13,16,17. In deze studie, de prognostische impact van de co uitdrukking van de twee remmende receptoren PD-1 en Tim-3 op CD8+ T cellen werd beoordeeld.

Omhoog tot nu toe, het bestuderen van de co uitdrukking van meerdere markeringen op tumor infiltreren lymfocyten (TILs) is voornamelijk door stroom cytometry analyse, waardoor het noodzakelijk wordt om te werken aan nieuwe tumoren en daarom uitschakeling retrospectieve analyses verricht. Met conventionele in situ kleuring, slechts één kleuring tegelijk kan worden uitgevoerd, en de karakterisatie van het celtype die mede de markers uitdrukt is niet mogelijk. Bijvoorbeeld, wordt PD-L1 uitgedrukt door veel celtypen van het tumoraal communicatie, waardoor het moeilijk te definiëren door conventionele immunohistochemistry analyse welke cellen uiten van PD-L1 relevanter voor oereenstemming studies zijn. In dit werk, ontwikkelden we een methode van multiparametric immunofluorescentie innovatieve in situ met computer-tellen om te correleren de co uitdrukking van PD-1 en Tim-3 door tumor infiltreren CD8+ T-cellen met klinische resultaten in de RCC. Deze techniek heeft meerdere voordelen, met inbegrip van de mogelijkheid om te analyseren op het niveau van een enkele cel en meerdere markeringen op hetzelfde moment met behulp van een multispectrale camera die beperkt intervallen vangen kan > 10 nm via vloeibare kristallen filters18. De procedure is bovendien automatische waardoor een inter exploitant reproduceerbaarheid en een verkorte analyse in vergelijking met manuele technieken19. Op het gebied van kanker, verschillende studies gerapporteerd overtuigend meerdere technieken van immuun moleculen zoals PD-1, PD-L1 en CD8 in Merkel-cel carcinoom, longkanker, en hoofd en nek kanker20,21,22, 23. de telling van de geautomatiseerde cel is mogelijk met de opleiding door de gebruiker (fenotypering stap). De fluorescentie wordt gemeten in de andere cel compartimenten (kernen cytoplasma en membraan).

Hier, de verschillende subgroepen van tumor-infiltreren CD8+ T cellen waarin PD-1 en/of Tim-3 in een grote cohort van RCC werden geteld en de resultaten werden gecorreleerd met klinische Ernst scores en overleving parameters. Het was ook mogelijk om het analyseren van membraan intensiteit van de fluorescentie bij de cellulaire resolutie met bedoel fluorescentie intensiteit (MFI) gegevens zoals in cytometry. As far as we know, vertegenwoordigt dit de eerste rapportage prognostische studieresultaten met behulp van deze multispectrale imaging gebaseerde graaf techniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Geïnformeerde toestemming was verkregen van de deelnemer in de cohorten opgenomen.

1. de weefsels materiaal

  1. Verzamelen RCC weefselsteekproeven op de dag van de operatie. Omgaan met de chirurgische model bij kamertemperatuur (Afdeling Pathologie).
  2. Een monster van de tumor van ongeveer 0,5 x 0,5 cm x 0.5 cm grootte in een droge buis verzameld. Module bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C.
  3. De monsters in optimale scherpe temperatuur samengestelde jas. Het gedeelte van de monsters met een cryostaat bij-20 ° C in 4-6 µm dik secties. Laat de monsters lucht droog op dia's voor 12u en direct opslaan bij-80 ° C tot het vermijden van uitdroging.
  4. Controleer de kwaliteit van het monster door een haematoxyline en eosine gekleurd sectie te bekijken.

2. in Situ immunofluorescentie kleuring van TILs

  1. Procedurele richtsnoeren
    1. Voer alle experimentele stappen uit bij kamertemperatuur.
    2. Voor alle stappen, verrichten de verdunningen met Tris Buffer Saline (TBS; Zie Tabel van materialen).
    3. Voeren de wash in TBS voor alle stappen behalve na de incubatie met primair antilichaam. Voor deze laatsten gebruiken Tris Buffer zoute Tween20 (TBST, Zie Tabel van materialen). Zie aanvullende tabel 1voor buffer samenstelling en reconstitutie.
    4. Gebruik een kamer vochtigheid voor antilichaam incubations en een kleuring pot voor wassen.
    5. Laat niet het gedeelte uitdrogen tijdens de procedure.
  2. Voorbehandeling
    1. Ontdooi de dia met het monster weefsel en zorgvuldig drogen de dia rond het model met een papieren handdoek. Afgebakend op het gebied van de reactie met het weefsel met een hydrofobe barrière pen (Zie Tabel van materialen). Droge gedurende 2 minuten.
    2. Los van de monsters in 100% aceton voor 5 min, droge gedurende 2 minuten, en wassen met TBS voor 10 min.
  3. Verzadiging en blokkade
    1. Voorbehandeling van de dia's gedurende 10 minuten met 3 druppels van avidin 0,1%, kraan en/of flick de dia de avidin distribueren en verwijderen van luchtbellen en vervolgens behandelen voor 10 min met 3 druppels van biotine 0,01% (Zie Tabel of Materials), tikt u op en/of flick. Wassen met eetlepels
    2. Het uitvoeren van een blokkade van Fc receptoren. Breng 100 µL van een 5% volume/volume van normale serum verdund in eetlepels gebruik serum van dezelfde host soorten als de gelabelde secundaire of tertiaire antilichaam (Zie Tabel van materialen); hier, werd ezel serum gebruikt. Incubeer gedurende 30 min.
    3. Tijdens de incubatie, spin kort de anti-CD8, PD-1 en Tim-3 antilichamen (Tabel van materialen). De mix van primaire antilichamen in TBS bereiden zoals beschreven in aanvullende tabel 2.
  4. Immuno-kleuring voor CD8, PD-1 en Tim-3
    1. Het primaire antilichaam mengsel te bereiden. Zie Tabel van materialen en aanvullende tabel 2 voor de antilichamen die gebruikt (anti-CD8, PD-1, Tim-3, en hun overeenkomstige secundaire antilichamen) en de concentraties ervan.
    2. Tik op en/of flick de resterende ezel serum (toegevoegd in stap 2.3.2). Incubeer de dia's met 100 µL van de mix van niet-met de label primaire antilichamen voor 1 h in een bevochtigde kamer.
    3. Tijdens de incubatie, kort spin de Cyanine anti-konijn, AF488-anti-geit, 5en biotinyleerd anti-muis-antilichamen, en de mix van secundaire antilichamen bereiden zoals beschreven in aanvullende tabel 2.
    4. Wassen van de dia's in TBST voor 5 min. droog de dia's.
    5. Incubeer de dia's met 100 µL van de secundaire antilichamen gedurende 30 min. in een bevochtigde kamer.
    6. Het mengsel van tertiaire antilichaam met Cy3-daar, zoals beschreven in aanvullende tabel 2voor te bereiden.
    7. Wassen van de dia's in TBS voor 10 min. drogen de dia's.
    8. Incubeer de dia's met 100 µL van het mengsel van de tertiaire antilichaam voor 30 min.
    9. Wassen van de dia's in TBS voor 10 min. drogen de dia's.
  5. Montage van de cel
    1. Monteren van de dia's in een 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-bevattende montage medium (1,5 µg/mL DAPI) met een dekglaasje aan compatibel voor fluorescentie microscopie (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Als een negatieve controle voor elk experiment, één dia met isotype-matched antilichamen werd gebruikt op dezelfde concentratie als de overeenkomstige antilichamen. Voor deze kleuring gebruikten we IgG1 muis, konijn IgG en geit IgG negatieve controle antilichamen (Zie Tabel van materialen). Als positieve controle gebruikten we menselijke hyperplasic tonsillen waarvan bekend is dat gunstig zijn voor de geteste markeringen, voor elk experiment. Een typische kleuring wordt beschreven in de resultaten (Figuur 1). Mono-kleuring van CD8, PD-1 en Tim-3 moet worden uitgevoerd individueel (een kleuring per dia) met de zelfde voorbehandeling en zonder DAPI. Een dia in de dezelfde proefomstandigheden zonder antilichaam en alleen DAPI montage medium moet ook worden uitgevoerd. Een dia moet worden beeld met behulp van identieke experimentele omstandigheden zonder enige antilichaam en zonder DAPI.

3. fluorescentie analyse en geautomatiseerde cellen

  1. Beeldacquisitie met de geautomatiseerde Microscoop
    1. Maak een protocol.
      1. Zet de geautomatiseerde Microscoop software en de verlichter van de fluorescentie.
      2. In de menubalk, klik op 'Bestand', "Maak protocol," Selecteer "DAPI," "FITC", en "TRITC."
      3. Klik op "Volgende", "Weefselsectie," en klik op "Next", "Protocolnaam." Kies een naam, bijvoorbeeld "CD8-PD-1-Tim-3," Klik "Next", en "opslaan".
      4. Handmatig een dia in het werkgebied plaatsen.
      5. Klik in de menubalk op "setup," "instellingen." Klik op 'Stel in huis Z' in het nieuwe venster.
      6. Belichtingstijd aanpassen met een positieve controle schuif d.w.z. een CD8, PD-1 en Tim-3 triple-gekleurd met DAPI monster.
      7. Klik in de balk met besturingselementen op "set blootstelling."
      8. De belichtingstijd voor elk filter aanpassen tot een voldoende maar niet verzadigen signaal wordt verkregen.
      9. Voor zwart-wit beeldvorming, doet u het volgende:
      10. Selecteer verwerving en kies onder 'autofocus' DAPI filter.
      11. In de "scan gebied te beperken", de objectieve bovenste naar de linkerbovenhoek van de dia te verplaatsen. Klik op de "Mark". Doe hetzelfde voor de lagere juiste hoek.
        Opmerking: Deze stap delimitates het gebied van energiebesparende denkbaar (de weergave van de LP) ter 4 X; Let erop dat u plaats rond het merk zo goed over het omringen van alle monsters van de serie.
      12. Voor hoog vermogen (HP) imaging, doet u het volgende:
      13. Kies onder 'Autofocus', "DAPI".
      14. Kies onder 'Verwerving' band, "DAPI", "FITC", "Cy3" en "Cy5". Klik op "OK". Klik op de menubalk op "Bestand", "Save protocol".
    2. De dia's scannen.
      1. Het laden van het protocol door te klikken op "Bestand", "protocol laden' in de menubalk. Klik op "Start".
      2. Voer 'Lab ID' (de locatie van de map voor beeldopslag). Geef dia-ID te identificeren van de dia. Klik op "Next".
      3. Klik op "Zwart-wit Imaging" (voor het scannen van de hele dia onder heldere veld licht en verwerven van opeenvolgende beelden met behulp van een doelstelling 4 x).
        Opmerking: Dit geeft een overzicht van de grijswaarden van de dia.
      4. Klik op "Zoeken Specimen". Selecteer het gebied van weefsel worden gescand met een lage resolutie (4 x): Houd de 'Ctrl'-toets ingedrukt en klik op een veld met behulp van de cursor selecteren of deselecteren velden (figuur 2A).
      5. Klik op "LP Imaging" (4 x imaging) voor fluorescerende rood blauw groen Beeldacquisitie van elk veld.
      6. Voor HP veldselectie, 'Ctrl' toets ingedrukt en klik op een veld met behulp van de cursor selecteren of hef de selectie van velden die overeenkomen met het gebied van weefsels die zal worden gescand met een hoge resolutie (20 x). Selecteer 5 velden (figuur 2B).
      7. Klik op "HP Imaging" (20 x imaging) voor een multispectrale Beeldacquisitie van elk veld (figuur 2C).
      8. Klik op 'Data Storage' voor het opslaan van afbeeldingen in de map die aan het begin in LabID werd geselecteerd.
        Opmerking: Het proces is samengevat en geïllustreerd in Figuur 2. Voor elke stap (weefsel detection, Veldselectie) kan een algoritme worden verhoogd en opgeleid door de gebruiker voor een geheel geautomatiseerde scanproces.
  2. Fluorescentie beeldanalyse en geautomatiseerde cellen tellen met gekoppelde analysesoftware
    1. De spectrale bibliotheek bouwen.
      1. Open de software van de analyse van de afbeelding.
      2. Open op het linker paneel, "Bouwen bibliotheken". Onder 'load image', klik op "Bladeren" en selecteer één mono gebeitste afbeelding (bijvoorbeeldCD8/Cyanine 5).
      3. Selecteer de fluorophore, (b.v., Cyanine 5). Klik op "uitpakken". Klik op "Opslaan" om op te slaan in de bibliotheek. Klik op "Opslaan".
      4. Herhaal het zelfde proces voor PD-1, Tim-3 en DAPI mono gebeitste dia's teneinde het spectrum van elke fluorophore van belang.
        Opmerking: De spectrale bibliotheek gebouw integreert het spectrum voor elke fluorophore gebruikt voor het specifieke weefsel (hier, nier), maar "synthetische" bibliotheken die al aanwezig zijn kunnen worden gebruikt. Zoals het autofluorescence-spectrum strikt ten opzichte van het weefsel is, is het belangrijk om een auto-fluorescentie en spectrale bibliotheek per project te voeren.
    2. Maak een nieuw project.
      1. In de menubalk, klikt u op 'Bestand', 'Nieuw Project'. Selecteer in het tabblad 'Zoekfunctie' "de segmentering van de cel". Selecteer in het tabblad 'Fenotypering' "fenotypering". Klik op 'Maak aan'.
      2. De representatieve beelden in het project integreren.
        1. In het tabblad 'Bestand', klik op "open image". Kies 10 tot 30 representatieve beelden van de hele reeks. De niet-gekleurde dia als u wilt verwijderen van de autofluorescence toevoegen. Op het juiste paneel: Selecteer bibliotheek bron. Selecteer fluorophore en kies die overeenkomen met de spectrale bibliotheek eerder gebouwd.
      3. Als u wilt verwijderen van weefsel autofluorescence, klikt u op de "AF" en selecteer vervolgens het gebied van de autofluorescence op de lege dia.
      4. Afbeelding behandeling en Composietbeeld generatie.
        1. Klik op "Voorbereiden alle" de fluorescentie-bibliotheek en de spectra van de autofluorescence voor het genereren van de samengestelde afbeelding (Figuur 3) te integreren. Klik op het pictogram van het 'oog' opent u het paneel 'weergave-editor' en selecteer de gegevens die worden weergegeven: Selecteer de markeringen CD8, PD-1, Tim-3 en DAPI. Verwijder de autofluorescence. Volg de stappen die zijn gepresenteerd door de software.
      5. Segment van de cellen.
        1. Selecteer om het segment de gewenste cellen, in 'Compartiment', "Kernen" en "Membrane". Stel in het tabblad "Kernen" DAPI als de nucleaire counterstain.
        2. In het tabblad 'Maximale en minimale grootte (px)' Voer "40" en "176" als minimale en maximale grootte, respectievelijk. Voor de 'Minimum' signaal, stelt "0.13". Stel "2,60" in "Split" tabblad. Stel "0,81" in "Kernen" tabblad. Selecteer 'gebruik membraan signaal voor segmentatie hulp'.
        3. Klik op 'Segment cellen"op het onderste gedeelte van het scherm. Controleer de segmentatie van de kernen en membranen van cellen en opnieuw met verschillende parameters, als het niet overeenkomt met de DAPI en membraan fluorescentie van de cellen.
          Opmerking: De software herkent de cellen met de nucleaire DAPI kleuring en gebaseerd op de grootte van de cel. De cel-parameters (grootte, split, pixels) volgens het project aanpassen.
      6. Fenotype de cellen.
        1. Klik in het tabblad 'Fenotype' op 'Voeg toe'. Maak cel fenotype Categorieën: CD8 (blauwe stip) / CD8-PD-1 (rode stip) / CD8-PD-1-Tim-3 (groene stip) / andere (zwarte) (Figuur 4).
        2. Meer dan 5 voorbeelden van cellen van elke categorie selecteren Klik op "Train classificatie".
          Opmerking: Dit genereert een statistische classificatie algoritme van de software.
        3. Klik op "Fenotype alle" om op te halen van het fenotype van elke cel.
          Opmerking: De software geeft het fenotype van een cel met een betrouwbaarheidsinterval (CI) van nauwkeurigheid.
        4. Het algoritme te verbeteren door het trainen van de software tot het verschil tussen oog en geautomatiseerde graaf concordante is (fout < 5%). Kies een CI die aanvaardbaar is voor de cellen van belang is.
          Opmerking: We kozen te maken van de opleiding op basis van 55% CI als aanvaardbaar.
      7. Sla het algoritme en project.
      8. Selecteer "project" onder 'Bestand'. Naam en klik op "Opslaan".
    3. Batch analyses van de serie uit te voeren.
      1. Selecteer "Batch analyse". Selecteer het project. Voeg toe de beelden om te analyseren. Selecteer een map voor veilige opslag van de gegevens. Klik "Run". Controleer de kwaliteit van de samengestelde afbeelding. Controleer of de fenotypering voor alle de beelden van de serie.
        Opmerking: De software van de analyse van de gekoppelde afbeelding integreert alle compartimenten (membraan/cytoplasma/kernen)-signalen van de cel. De fenotypering stap is cruciaal, zij de opleiding van het algoritme een tijdrovende stap kan zijn. Alle gegevens van elke afbeelding zijn in een txt-bestand. Alle gegevens van één cel (met name zijn fenotype gegeven met haar CI) zijn in één lijn. Voor elke dia werden de Beeldacquisitie en latere graven uitgevoerd op 5 velden.
  3. Integratie van de ruwe gegevens en de generatie van de graaf van geautomatiseerde cel
    1. Berekenen van de gegevens met een statistische programma.
      1. Berekent alle gegevens uit de 5 beelden die overeenkomt met de 5 velden geanalyseerd voor 1 patiënt. Gebruik een statistische platform, en hebben een ervaren statisticus, manager van de gegevens of gegevens wetenschapper de analyses uit te voeren. Het bouwen van een script dat automatisch telt het aantal cellen afhankelijk van hun fenotype, selecteren de CI > 55%.
      2. Alle .txt-bestanden van de reeks in dezelfde map plaatsen
    2. Het uittreksel van de gegevens.
      1. Zet alle .txt-bestanden in één map. Het automatische script gebouwd in stap 3.3.1 uitvoeren. Open de uitvoer CSV-bestand gegenereerd door de R-script. Opslaan als .xl formaat. De output verzamelt het aantal cellen voor elk fenotype (dat wil zeggen, alleen, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) voor elke patiënt.
      2. Bereken het gemiddelde aantal cellen voor elke patiënt per veld: verdelen van het aantal cellen per het aantal velden (dat wil zeggen, 5) om te normaliseren van het aantal cellen voor elke patiënt per veld.
      3. Bereken het percentage van PD-1+ cellen onder totale CD8+ T cellen en PD-1+ Tim-3+ cellen onder totale CD8+ T cellen. Zie Figuur 5 voor een samenvatting van deze stap.
        Opmerking: R taal (of andere programmeersoftware van keuze) is vereist voor correct maken en uitvoeren van de opdrachten, en dus een ervaren gebruiker of statisticus/gegevens wetenschapper is essentieel. De R-programma kan de gegevens van de dezelfde patiënt berekenen, maar de naam van de 5 .txt-bestanden van één patiënt moet een identieke begin, overeenkomt met een unieke id van de patiënt.
  4. Statistische analyse
    1. Gebruik statistische software voor de statistische analyse van de resultaten.
    2. Uitvoeren van passende statistische analyses uitgevoerd met de hulp van een statisticus.
      1. Gebruik de niet-parametrische Wilcoxon ondertekend rangschikking tests voor vergelijking van PD-1 MFI tussen twee fenotypes van de cel (Figuur 6). De covariate en de histologische kenmerken met een Pearson de chi-kwadraatverdeling test correleren.
      2. Gebruik een Kaplan-Meier-methode om de progressie vrije overleving en Cox regressiemodellen om een schatting van de effecten van de covariate op tijd-aan-event resultaten, zoals de totale overleving en ziektevrije overleving te schatten.
      3. Overwegen van p-waarden lager dan 0,05 belangrijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het algemeen protocol zoals hierboven beschreven, we gericht op het kwantificeren van intratumoral CD8+ T cellen samen uiting geven aan de remmende receptoren PD-1 en Tim-3 in bevroren weefsels van patiënten met RCC, en de resultaten correleren met klinische resultaten25.

Optimalisatie van de kleuring van CD8/PD-1/Tim-3:

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wijzigingen en probleemoplossing:

De kwaliteit van het weefsel is een belangrijke parameter; het kan gemakkelijk worden gecontroleerd door de haematoxyline en eosine-kleuring.

Een voordeel van de techniek is de mogelijkheid van multiplexed technieken, maar om te voorkomen dat fluorophore spill-over, het aanbevolen te kiezen emissie golflengten met delta van 10 nm minimum. Hier, omdat we 4 technieken waaronder DAPI hadden, we kozen te spreiden de gol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-oncologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG werd gefinancierd door een beurs van de Fondation ARC. EV en CD werden gefinancierd door een beurs van APHP (bourse année recherche). ChB wordt gefinancierd door een beurs van de universiteit Sorbonne Paris Cité (contrat promovendi). De auteurs bedanken Bristol-Myers Squibb voor hun financiering in dit project. De auteurs bedanken de afdeling pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel en Gisèle Legall). De auteurs bedanken de histologie platform van PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging Perkin ElmerCLS142338
inForm cell analysis 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen delimiting penDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablets
Biotin blocking systemDakoX0590Avidin 0.1% en Biotin 0.01%
normal donkey serumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentratie
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µg/mL concentratie
Knittel glass coverslipKnittel Gläser,10003924x60 mm 100 dekselglasjes
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055gebruik bij 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587gebruik bij 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3R&DAF2365gebruik bij 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001gebruik bij 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11Cell Signalling4528gebruik bij 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9R&DAF2045gebruik bij 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbitJackson Immunoresearch711-175-152gebruik bij 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgGJackson Immunoresearch715-066-150gebruik bij 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgGabcamab150133gebruik bij 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidinAmershamPA43001gebruik bij 3 µg/mL
negative control mouse IgG1DakoX0931gebruik bij 2 µg/mL
IgG from goat serumSigma-aldrichI5256gebruik bij 3 µg/mL
IgG from rabbit serumSigma-aldrichI5006gebruik bij 4µg/mL

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

Gerelateerde artikelen