Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immune cellen zijn belangrijke componenten van de communicatie van de tumor en tumorgroei en evolutie beïnvloeden in alle stadia van carcinogenese. Met name nu ook vaststaat dat de immuun infiltreren in menselijke tumoren met de prognose en respons op therapie correleren kan. De analyse van de immuun infiltreren in de communicatie van de tumor is uitgegroeid tot een grote uitdaging voor de classificatie van patiënten en de reactie op behandeling.
De co uitdrukking van remmende receptoren zoals programma cel dood eiwit 1 (PD1; ook bekend als CD279), cytotoxische T-lymfocyten geassocieerde eiwit 4 (CTLA-4), T-cel Immunoglobulin Mucin bevattende eiwitten-3 (Tim-3; ook bekend als CD366) en lymfocyt Activering gen 3 (Lag-3; ook bekend als CD223), is een kenmerk van T cel uitputting. We ontwikkelden een multiparametric in situ immunofluorescentie kleuring te identificeren en te kwantificeren op cellulair niveau de co uitdrukking van deze remmende receptoren. Op een retrospectieve serie van bevroren weefsel van renaal cel carcinomen (RCC), met behulp van een fluorescentie multispectrale imaging technologie in combinatie met de software van de analyse van een afbeelding, bleek dat mede uiting van PD-1 en Tim-3 op tumor infiltreren CD8+ T cellen is gecorreleerd met een slechte prognose in RCC. Om onze kennis, dit is de eerste studie waaruit blijkt dat dit geautomatiseerd multiplex in situ technologie wellicht sommige klinische relevantie.
Inleiding
In de afgelopen jaren, heeft immunotherapie ontpopt als een zeer veelbelovende behandeling voor vele soorten van kanker, met inbegrip van de RCC. Bijzonder, immunotherapie, gebaseerd op de remming van remmende checkpoints als PD-1 en CTLA-4 is gemeld te worden klinisch effectief1,2,3,4,5, 6. monoklonale antilichamen tegen CTLA-4, PD-1, of programma dood Ligand 1 (PD-L1) zijn al goedgekeurd in verschillende kankers en leiden tot langdurige klinische reacties in meer dan 20%....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Geïnformeerde toestemming was verkregen van de deelnemer in de cohorten opgenomen.
1. de weefsels materiaal
- Verzamelen RCC weefselsteekproeven op de dag van de operatie. Omgaan met de chirurgische model bij kamertemperatuur (Afdeling Pathologie).
- Een monster van de tumor van ongeveer 0,5 x 0,5 cm x 0.5 cm grootte in een droge buis verzameld. Module bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C.
- De monsters in optimale scherpe temperatuur samenges....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het algemeen protocol zoals hierboven beschreven, we gericht op het kwantificeren van intratumoral CD8+ T cellen samen uiting geven aan de remmende receptoren PD-1 en Tim-3 in bevroren weefsels van patiënten met RCC, en de resultaten correleren met klinische resultaten25.
Optimalisatie van de kleuring van CD8/PD-1/Tim-3:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wijzigingen en probleemoplossing:
De kwaliteit van het weefsel is een belangrijke parameter; het kan gemakkelijk worden gecontroleerd door de haematoxyline en eosine-kleuring.
Een voordeel van de techniek is de mogelijkheid van multiplexed technieken, maar om te voorkomen dat fluorophore spill-over, het aanbevolen te kiezen emissie golflengten met delta van 10 nm minimum. Hier, omdat we 4 technieken waaronder DAPI hadden, we kozen te spreiden de gol.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door subsidies van het Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-oncologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG werd gefinancierd door een beurs van de Fondation ARC. EV en CD werden gefinancierd door een beurs van APHP (bourse année recherche). ChB wordt gefinancierd door een beurs van de universiteit Sorbonne Paris Cité (contrat promovendi). De auteurs bedanken Bristol-Myers Squibb voor hun financiering in dit project. De auteurs bedanken de afdeling pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% en Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentratie |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentratie |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24x60 mm 100 dekselglasjes |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | gebruik bij 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | gebruik bij 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | gebruik bij 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | gebruik bij 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | gebruik bij 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | gebruik bij 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | gebruik bij 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | gebruik bij 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | gebruik bij 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | gebruik bij 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | gebruik bij 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | gebruik bij 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | gebruik bij 4µg/mL |
Referenties
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
