Methodenartikel

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

DOI:

10.3791/56688

⸱

14 december 2017

 , 
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutaties in leucine-rijke herhalen kinase 2 (LRRK2) hebben aangetoond dat het familiale Parkinson's disease (FPD) worden gekoppeld. Aangezien abnormale activering van het kinaseactiviteit van LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van PD, is het essentieel een methode om te evalueren van de fysiologische niveaus van het kinaseactiviteit van LRRK2 vast te stellen. Recente studies is gebleken dat LRRK2 kinaseenzym leden van de Rab GTPase-familie, waaronder Rab10, onder fysiologische omstandigheden. Hoewel de fosforylatie van endogene Rab10 door LRRK2 in gekweekte cellen kon worden opgespoord door massaspectrometrie, is het moeilijk om het te ontdekken door immunoblotting vanwege de slechte gevoeligheid van momenteel beschikbare fosforylatie-specifieke antilichamen voor geweest Rab10. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het opsporen van de endogene niveaus van fosforylering van de Rab10 door LRRK2 van gebaseerd op immunoblotting met behulp van elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) gecombineerd met een fosfaat-bindende tag (P-tag), die N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-methyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Dit protocol biedt niet alleen een voorbeeld van de methode met behulp van de P-tag maar maakt het ook mogelijk de beoordelingvan hoe mutaties alsmede remmer behandeling/administratie of andere factoren veranderen de stroomafwaartse signalering van LRRK2 in cellen en weefsels .

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PD is één van de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, voornamelijk op het gebied van Dopaminerge neuronen in de veroorzaakt, resulterend in een dysfunctie van de motor systemen in ouderen1. Terwijl de meeste patiënten PD in een sporadische manier ontwikkelen, zijn er gezinnen overnemen van de ziekte. Mutaties in meerdere genen zijn bevonden om te worden gekoppeld aan FPD2. Een van de oorzakelijke genen voor FPD is LRRK2, waarin acht missense mutaties (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S en I2020T) gekoppeld aan een dominant erfelijke FPD genaamd PARK8 dusver gerapporteerde3,4,5. Verschillende genoom-brede vereniging studies (GWAS) van sporadische PD-patiënten hebben ook genomic variaties op de LRRK2 locus geïdentificeerd als een risicofactor voor PD, suggereert dat de afwijking in de functie van LRRK2 een veelvoorkomende oorzaak van neurodegeneratie in beide sporadische is en PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 is een groot eiwit (2,527 aminozuren), die bestaat uit een rijk aan leucine herhalen domein, een Ras van de GTP-bindende van complexe eiwitten (ROC) domein, een C-terminal van ROC (COR) domein, een serine/threonine proteïne kinase domein, en een WD40 herhalen domein9. De acht FPD mutaties zoeken in deze functionele domeinen; N1437H en R1441C/G/H/S in het domein van de ROC, Y1699C in het domein van het CVDR, G2019S en I2020T in het domein kinase. Aangezien de G2019S mutatie, die het vaakst vlindertje mutatie PD patiënten10,11,12, verhoogt het kinaseactiviteit van LRRK2 door 2-3 vouwen in vitro13, is het veronderstelde dat de abnormale toename van fosforylering van de LRRK2 substrate(s) giftig voor zenuwcellen is. Het is echter onmogelijk om te bestuderen of de fosforylatie van fysiologisch relevante LRRK2 substraten is gewijzigd in familiale/sporadische PD-patiënten als gevolg van het gebrek aan methoden evalueren het in patiënt afgeleide monsters.

Proteïne Fosforylatie is over het algemeen herkend door immunoblotting of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met behulp van antilichamen specifiek herkennen de gefosforyleerd staat van eiwitten of door massaspectrometrische analyse. Echter, de voormalige strategie niet soms worden toegepast wegens de moeilijkheden bij het creëren van fosforylering-specifieke antilichamen. Metabole labeling van cellen met radioactieve fosfaat is een andere optie te onderzoeken fysiologische niveaus van fosforylering fosforylering-specifieke antilichamen niet dadelijk beschikbaar zijn. Echter het vereist een grote hoeveelheid radioactief materiaal en daarom gaat sommige gespecialiseerde apparatuur voor stralingsbescherming14. Massaspectrometrische analyse is gevoeliger in vergelijking met deze immunochemical methoden en werd populair in het analyseren van proteïne fosforylatie. Echter, de bereiding van de monsters is tijdrovende en dure instrumenten nodig zijn voor de analyse.

Een subset van de familie van de Rab GTPase met inbegrip van Rab10 en Rab8 werd onlangs gemeld als directe fysiologische substraten voor LRRK2 op basis van het resultaat van een grootschalige phosphoproteomic analyse15. We toonden dan dat Rab10 fosforylering door FPD mutaties in muis embryonale fibroblasten en in de longen van knockin muizen16werd verhoogd. In dit verslag, kozen we om een polyacrylamide-gelelektroforese voor natrium dodecyl sulfaat (SDS-pagina) in dienst-op basis van de methode waarbij een P-tag molecuul mede gepolymeriseerde in SDS-pagina gelen (P-tag SDS-PAGE is) voor het opsporen van de endogene niveaus van fosforylering van de Rab10, omdat een hooggevoelige antilichaam specifiek voor gefosforyleerd Rab10 ontbrak nog. We hebben gefaald om te ontdekken de fosforylatie van endogene Rab8 te wijten aan de slechte selectiviteit van momenteel beschikbare antilichamen voor totale Rab8. Daarom besloten hebben we om zich te concentreren op de Rab10 fosforylering. LRRK2 kinaseenzym Rab10 op Thr73 zoeken in het midden van de regio zeer geconserveerde "Wissel II". Hoge instandhouding van de fosforylatie sites onder Rab eiwitten misschien wel een van de redenen waarom phosphospecific antilichamen herkennen van afzonderlijke Rab eiwitten zijn moeilijk om te maken.

De fosforylering van de Rab8A door LRRK2 remt de binding van Rabin8, een guanine nucleotide uitwisseling factor (GEF), die Rab8A activeert door de afhankelijke BBP met GTP15uit te wisselen. Fosforylering van de Rab10 en Rab8A door LRRK2 remt ook de binding van BBP-dissociatie-remmers (GDIs), die essentieel voor de activering van Rab eiwitten zijn door winning van BBP-gebonden Rab eiwitten uit membranen15. Collectief, is het veronderstelde dat de fosforylatie van Rab eiwitten door LRRK2 hen activering verhindert hoewel de exacte moleculaire mechanisme en fysiologische gevolgen van de fosforylatie onduidelijk blijven.

P-tag SDS-pagina werd uitgevonden door Kinoshita et al. in 2006: bij deze methode wordt acrylamide covalent gekoppeld is met P-tag, een molecule vastleggen van fosfaten met hoge affiniteit, die copolymerized in SDS-pagina gels17. Omdat de moleculen van de P-tag in een SDS-pagina gel retard selectief elektroforetische mobiliteit van gefosforyleerd eiwitten, P-tag SDS-pagina gefosforyleerd eiwitten kan scheiden van degenen die niet phosphorylated (Figuur 1). Als de eiwit-of-interest is phosphorylated op meerdere residuen, worden een ladder van bands overeenkomt met differentieel gefosforyleerd formulieren nageleefd. In het geval van Rab10 observeren wij slechts één verschoven band, die aangeeft dat de Rab10 is phosphorylated alleen op Thr73. Het grote voordeel van P-tag SDS-pagina over immunoblotting met fosforylatie-specifieke antilichamen is dat gefosforyleerd Rab10 kan worden gedetecteerd door immunoblotting met niet-fosforylatie-specifieke antilichamen (d.w.z., herkennen totale Rab10) Na overgedragen worden op membranen, dat is over het algemeen meer specifieke, gevoelige en beschikbaar uit commerciële/academische bronnen. Een ander voordeel van het gebruik van de P-tag SDS-pagina is dat men benaderende raming van de stoichiometrie van fosforylering verkrijgen kan, wat onmogelijk door immunoblotting met fosforylatie-specifieke antilichamen of metabole labeling van cellen met radioactieve is fosfaten.

Afgezien van het gebruik van goedkope P-tag acrylamide en een aantal kleine wijzigingen daaraan, volgt de huidige methode voor de detectie van Rab10 fosforylering door LRRK2 een algemeen protocol voor immunoblotting.Daarom moet het eenvoudig en gemakkelijk uitvoerbare in de laboratoria waar immunoblotting is een gebruikelijke praktijk, met alle soorten monsters met inbegrip van gezuiverde eiwitten, cel lysates en weefsel homogenates.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. monstervoorbereiding for the P-tag SDS-PAGE

  1. Verwijderen en negeren van de media van 10 cm gerechten waarin de cellen worden gekweekt met behulp van een afzuiging wassen cellen met 5 mL Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) door eerste toevoegen DPBS aan de zijkant van de gerechten te voorkomen van verstoring van de cellaag en handmatig rock de gerechten terug en weer meerdere malen.
  2. Verwijderen en verwijderen van de DPBS met behulp van een zuig Voeg toe 2 mL trypsine van 0,25% (m/v) verdund in DPBS en zachtjes rock de gerechten ter dekking van de cellaag. Zet de gerechten in een CO2 incubator (37 ° C, bevochtigde lucht, 5% CO2) gedurende 5 minuten.
  3. Na pipetteren op en neer met behulp van een wegwerp pipet te breken op vrijstaande cellen, de celsuspensie verzamelen in een tube van 15 mL en meten van de celdichtheid met behulp van een hematocytometer onder een Microscoop18.
  4. Verdun de cellen tot 2,5 × 105 cellen/mL met Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Voeg 2 mL (5 × 105 cellen) van de verdunde celsuspensie aan elk putje van 6-Wells-platen.
  5. Groeien de cellen overnachting in een CO2 incubator (37 ° C, bevochtigde lucht, 5% CO2).
  6. Transfectie in HEK293 cellen
    Opmerking: Als fosforylatie van endogene Rab10 worden onderzocht is, gaat u verder met stap 1.7. Plasmiden gebruikt in dit protocol kunnen worden verkregen van de auteurs op aanvraag. Zie Tabel van materialen voor de beknopte informatie en Figuur S1 voor hun DNA sequenties.
    1. Aliquot 200 µL DMEM in 1,5 mL buizen.
    2. Toevoegen aan elke buis, beide 0.266 µg (eindconcentratie van 1,33 µg/mL) van een plasmide codering HA-Rab10 en 1.066 µg (eindconcentratie van 5,33 µg/mL) van een plasmide coderen 3 × vlag-LRRK2 uit 500 µg Mo/mL plasmide voorraden. Voeg vervolgens 4 µL van 1 mg/mL oplossing van polyethyleneimine (ontbonden in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) en onmiddellijk meng de oplossing door de vortexing voor 5 s.
    3. Laat de buizen staan bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en voeg de inhoud van één buis ontkleuring te goed met behulp van een micropipet. Zachtjes en handmatig rock van de cultuur-platen heen en weer meerdere malen te laat het mengsel van de transfectie diffuus gelijkmatig in de put.
  7. Laat de cellen groeien voor een andere 24-36 h in een CO2 incubator (37 ° C, bevochtigde lucht, 5% CO2).
  8. Als fosforylatie van endogene Rab10 worden onderzocht, cellen met en zonder LRRK2 remmers voor 1 h te behandelen voordat het lysing van cellen.
    1. Bereiden van stamoplossingen van LRRK2 remmers door ontbinding van de remmers in dimethylsulfoxide (DMSO) bij 10 mM. Wij adviseren gebruikend MLi-2 en GSK2578215A, die zeer specifieke en krachtige LRRK2-remmers. Opslaan van stamoplossingen van-80 ° C.
    2. Werkende voorraden van de remmers bereid door verdunning van de stamoplossingen met DMSO: For MLi-2, 10 µM en 30 µM voorbereiden voor endogene en overexpressie LRRK2, respectievelijk. Voor GSK2578215A, bereiden 1 mM en 3 mM voor de endogene en overexpressie LRRK2, respectievelijk.
    3. Voeg 2 µL van de voorraden van de werken van MLi-2 of GSK2578215A naar het midden van een goed met behulp van een micropipet en rock zachtjes de plaat handmatig heen en weer meerdere malen te laten de remmers diffuus gelijkmatig in de put.
    4. Voeg 2 µL van DMSO bij een verschillende bron als een negatieve controle op een gelijkaardige manier aan de Inhibitor van de omwenteling in stap 1.8.3.
    5. Zet de platen terug naar de incubator en cultuur van de cellen gedurende 1 uur.
  9. Lyse de cellen.
    1. Zet de cultuur-platen op ijs. Verwijderen en verwijderen van de media. De cellen door eerste toevoegen 2 mL DPBS aan de zijkant van de gerechten te voorkomen van verstoring van de cel laag en handmatig rock de gerechten heen en weer meerdere malen wassen.
    2. Verwijderen en verwijderen van de DPBS en toevoegen aan de cellen 100 µL van de lysis-buffermengsel (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl ether, 1 mM EGTA (ethyleen glycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur), 1 mM natrium orthovanadate, 50 mM Natriumfluoride, β-glycerophosphate 10 mM, 5 mM natrium pyrofosfaat, 0,1 µg/mL Microcystine-LR, 270 mM sacharose, proteaseinhibitor cocktail).
    3. Kantelen van de platen op ijs en schraap de cellen met behulp van een cel schraper voor het verzamelen van zoveel mogelijk lysate cel. Verzamel de lysates met behulp van een micropipet in 1,5 mL buizen (vooraf gekoeld op ijs).
      Let op: Microcystine-LR fataal kan zijn als slikte of aanraking met de huid.
  10. Laat de buizen staan op het ijs gedurende 10 minuten voor volledige lysis. De cel lysates verduidelijken door middel van centrifugeren (20.000 × g, 10 min bij 4 ° C) en het supernatant overbrengen naar nieuwe 1,5 mL buizen vooraf gekoeld op ijs.
  11. Maatregel eiwitconcentratie (µg/µL) van de gewiste lysates door analyse van Bradford.
    1. Bereiden bovien serumalbumine (BSA) normen (0,2 0,4, 0,6, 0,8 en 1 mg/mL) door verdunning van de stockoplossing met gedestilleerd water. 20-fold de gewiste cel lysates door verdunnen met gedestilleerd water.
    2. Zet 5 µL per putje van de BSA-normen, blank (gedestilleerd water), en elke verdunde cel lysate in een 96-wells-plaat in drievoud.
    3. Voeg 150 µL per putje van het Bradford assay reagens met behulp van de 12-kanaals micropipet en laat de plaat staan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Meet de extinctie op 595 nm op een afleesapparaat en te vergelijken met de normen van de BSA.
  12. Bereiden 100 µL van monsters voor SDS-pagina. De eiwitconcentratie van de monsters is 1 µg/µL voor overexpressie HA-Rab10 en 2 µg/µL voor endogene Rab10.
    1. Met behulp van de gekwantificeerde concentraties vanaf stap 1.11.4, berekenen van het volume (µL) van de cel lysates gelijk aan 100 µg (overexpressie HA-Rab10) of 200 µg (endogene Rab10) door de eiwit-bedrag (100 µg of 200 µg) te delen door de eiwitconcentratie van lysates (µ g/µL).
    2. Voeg toe 25 µL van 4 × Laemmli de SDS-pagina monster buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (m/v) SDS, 40% (v/v) glycerol, 0,02% (m/v) bromophenol blauw, 4% (v/v) β-mercaptoethanol) aan nieuwe 1,5 mL buizen bewaard bij kamertemperatuur.
    3. Toevoegen van de berekende volume worden gecontroleerd van de cel lysates aan elke buis en meng door de vortexing voor 5 s bij kamertemperatuur.
    4. Zodat het totale volume 100 µL met de lysis-buffermengsel en meng door de vortexing voor 5 s bij kamertemperatuur.
  13. MnCl2 te quench de chelaatvormer te vullen met 10 mM. Voeg 1 µL van 500 mM MnCl2. Meng door de vortexing voor 5 s bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Monsters met MnCl2 mogelijk niet geschikt voor normale SDS-pagina.
Deze stap is vereist wegens de aanwezigheid van de chelaatvormer (zoals ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), EGTA, etc.) in de lysis-buffermengsel. Anders Mn2 + ionen gekoppeld aan P-tag acrylamide zal worden losgekoppeld van de chelaatvormers en P-tag SDS-pagina werkt niet goed.
  • Alle monsters bij 100 ° C gedurende 5 minuten koken en bewaren van de monsters hieronder-20 ° C tot gebruik. De gekookte monsters kunnen tot ten minste 6 maanden worden opgeslagen.

    • 2. casting voor P-tag SDS-pagina gelen

    Opmerking: Gels moeten plaatsvinden op dezelfde dag als het uitvoeren van de gels. Gels kunnen worden gemaakt onder omgevingslicht.

    1. 5 mM P-tag acrylamide stamoplossing bereid door het eerste ontbinding van de 10 mg poeder/effen P-tag acrylamide compleet met 100 µL van methanol en breng vervolgens tot 3,3 mL door dubbel gedestilleerd water toe te voegen.
      Opmerking: P-tag acrylamide is lichtgevoelig. De bereide oplossing moet worden opgeslagen in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
    2. Schoon duidelijke zowel ingekeepte platen door spuiten van 70% ethanol en vegen met een papieren handdoek. De gel-platen te monteren. De afmetingen van de platen van de gel gebruikt in dit bijzondere protocol zijn 80 of 100 mm lang door 100 mm breed. Schone silicon afstandhouders worden gebracht tussen vlakte en ingekeepte platen en de gemonteerde platen worden geklemd met bindmiddel clips.
      Opmerking: Elk soort gel platen die voor gewone SDS-pagina werken kan worden gebruikt.
    3. Zet een kam om te worden gebruikt (17-well kunststof kam) in de geassembleerde gel platen en mark op de gel plaat de positie van de onderkant van de putten met een permanent marker.
    4. Bereiden van 10 mL 10% acrylamide gel mengsel (10% (m/v) acrylamide (acrylamide:bis-acrylamide = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (g/v) SDS) in een tube van 15 mL.
      Opmerking: De optimale concentratie van acrylamide kan variëren afhankelijk van de gebruikte reagentia. Tetramethylethylenediamine (TEMED) en ammonium persulfate (APS) mag niet op dit punt worden toegevoegd.
    5. Voeg 100 µL van 5 mM P-tag acrylamide en 10 µL van 1 M MnCl2 oplossingen op de eindconcentraties van 50 µM en 100 µM, respectievelijk.
      Opmerking: De optimale concentraties van de P-tag acrylamide en MnCl2 kunnen ook variëren afhankelijk van de gebruikte reagentia.
    6. Voeg 15 µL van TEMED aan het mengsel van de gel met een eindconcentratie van 0,15% (v/v) en vervolgens 50 µL van 10% (m/v) APS op een eindconcentratie van 0,05% (m/v). Meng goed door de buis voor 5 s en giet voorzichtig te zwenken in de geassembleerde platen onmiddellijk tot op een hoogte dat is 2 mm hieronder de positie gemarkeerd in stap 2.3.
    7. Zachtjes laag 2-propanol op de oplossing van de gel voor het afvlakken van de bovenkant van het scheiden van gels.
    8. Laat de gels staan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Het is niet noodzakelijk zijn ter bescherming van de gels van licht.
      Opmerking: Het duurt langer voor gels instellen onder koude kamer temperatuur. Het gel mengsel alvorens toe te voegen TEMED en APS ontgassing helpt versnellen van deze stap. Voor dit doel, kan de gel mengsel bereid worden in een erlenmeyer van 100-200 mL verbonden met het een zuiging. Ontgas de oplossing gedurende 10 minuten.
    9. Verwijder de gelaagde 2-propanol door het absorberen van met een papieren handdoek.
    10. De bovenste ruimte van de gels wassen door de ruimte te vullen met gedestilleerd water uit een fles wassen en gooi het water door gieten af in het bekken. Herhaal 3 keer wassen.
    11. Verwijder Residuele water nog in de bovenste ruimte van de gels door het absorberen van met een papieren handdoek.
    12. 3 mL 4% acrylamide gel mengsel te bereiden (4% (m/v) acrylamide (a: crylamide:bis-acrylamide = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0,1% (g/v) SDS) in een tube van 15 mL.
      Opmerking: Voeg geen P-tag acrylamide of MnCl2 oplossing aan de stapelvolgorde gel-mengsel.
    13. Voeg 7,5 µL van TEMED en 24 µL van 10% (m/v) APS op eindconcentraties van 0,25% (v/v) en 0,08% (m/v), respectievelijk. Meng goed door de buis voor 5 s en giet het mengsel op de top van de scheiding gel voorzichtig te zwenken. Zet onmiddellijk passende kammen (17-well plastic kammen die geschikt voor maximaal 25 µL van monsters, bijvoorbeeld).
    14. Laat de gels staan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Het is niet noodzakelijk zijn ter bescherming van de gels van licht. Nadat de stapelvolgorde gels hebt ingesteld, kunt u ze uitvoeren zonder verdere opslag.

    3. SDS-pagina en Immunoblotting

    1. Verwijder de kammen van de gels. Verwijder de silicon spacers en vervolgens de clips uit de gels.
    2. De gegoten gels gestoken gel tanks en monteren van de gel naar de tank vloeit door klemmen met het bindmiddel clips.
    3. Giet de lopende buffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (g/v) SDS) aan de onderkant en de bovenkant van de gels. Schone wells door te spoelen van de lopende buffer met behulp van een spuit 5 mL en een naald 21G te verwijderen gel stukken.
    4. Luchtbellen uit de ruimte van de onderkant van de gels met behulp van een gebogen naald gekoppeld aan een spuit verwijderen. Als u wilt een gebogen naald, buig handmatig een naald 21G in het midden van de naald zodat de hoek tussen de tip en de boekwaarde van de naald 30-45 wordt °.
    5. Spin down precipitaten veroorzaakt door de toevoeging van MnCl2 bij 20.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te verkrijgen van duidelijke monsters.
    6. Laden van 10 µg eiwitten voor het opsporen van de fosforylatie van overexpressie Rab10 en 30 µg eiwitten voor endogene Rab10.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het laden van gelijk volume voor samples in alle putjes. Lege rijstroken moeten worden geladen met 1 × Laemmli SDS-pagina monster buffer. Als de monsters MnCl2 bevatten, voegt u dezelfde concentratie van MnCl2 toe aan de dummy monsters.
    7. De goed geladen met een molecuulgewicht marker (MWM) moet ook worden aangevuld met 1 × Laemmli de SDS-pagina monster buffer dus de omvang van de monsters geladen hetzelfde in alle putjes is.
      Opmerking: Nogmaals, als de monsters MnCl2 bevatten, dezelfde concentratie van MnCl2 aan toevoegen de MWM. U kunt ook kan een MWM EDTA-gratis worden gebruikt.
    8. Gelen op 50 V bij stapelen (ongeveer 30 min) tot de voorkant van de kleurstof steekt over naar de scheiding gel uitvoeren.
    9. Nadat de monsters stapelen, wijzigt de spanning in 120 V voor scheiding totdat de kleurstof voorkant de bodem van de gels bereikt (ongeveer 50 en 80 min voor 80 en 100 mm lang gels, respectievelijk).
      Opmerking: Het patroon van de migratie van de MWM moeten afwijken van die op normale SDS-pagina gelen. Het mag niet worden gebruikt voor het schatten van het molecuulgewicht van eiwitten op P-tag SDS-pagina gelen maar kan worden gebruikt voor het controleren van de reproduceerbaarheid van P-tag gels. Raadpleeg voor meer informatie.
    10. Wassen van de gels Schakel MnCl2 van de gels.
      1. Giet de overdracht buffer (48 mM Tris, 39 mM Glycine, 20% (v/v) methanol) met 10 mM EDTA en 0.05% (m/v) SDS in een container (bijvoorbeeldgrote wegen van boten).
    Het volume van de buffer moet voldoende zijn ter dekking van een gel.
  • Verwijder van de scheiding gels van de gel-platen en zet een gel in een container. Gooi de stapelvolgorde gel.
  • Laat de gels op een rockende shaker (~ 60 rpm) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  • Herhaal de stappen wassen in totaal 3 keer.
    Opmerking: Gebruik verse buffer voor elk wassen.
  • De gels eenmaal gedurende 10 minuten wassen met de buffer van de overdracht met 0,05% (m/v) SDS verwijderen van EDTA. Het volume van de buffer moet voldoende zijn ter dekking van een gel.
  • Electro-overdracht aan nitrocellulose of Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membranen met natte tanks.
    1. Plaats een filtreerpapier (10 x 7 cm) op een spons-pad voor de overdracht. Plaats de gel op het filtreerpapier. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het koffiefilter en de gel.
    2. Een membraan (10 x 7 cm) zetten de gel en zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de gel en het membraan.
    3. Een ander filtreerpapier (10 x 7 cm) op het membraan en, nogmaals, zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het membraan en het koffiefilter.
    4. Zet een andere spons pad op het filtreerpapier. Zet de stack van membraan/filtreerpapier in een cassette voor overdracht.
    5. De cassette wordt gestoken door een overdracht tank, ervoor te zorgen dat het membraan gelegen tussen de gel en de positief geladen anode is.
    6. Verbinding maken met de tank op een stroomvoorziening en zet de tank in een styreen schuim doos gevuld met ijskoud water. Start overdracht bij 100 V voor 180 min.
      Let op: Langdurige doorgifte is noodzakelijk, omdat de overdracht van eiwitten van P-tag SDS-pagina gelen zijn niet zo efficiënt als die van normale SDS-pagina gelen. Efficiënte koeling is essentieel om te voorkomen dat smelten gels tijdens de overdracht.
  • Controleer de overdracht
    1. Verwijderen van de membranen van de gels met pincet en geniet van de membranen in een Ponceau S oplossing (0,1% (g/v) Ponceau S, 5% (v/v) azijnzuur) vlek overgedragen eiwitten op de membranen in een kunststoffles. Het volume van de oplossing moet voldoende zijn ter dekking van een membraan.
    2. Incubeer de membranen voor 1 minuut bij kamertemperatuur door het handmatig schommelen.
      Opmerking: Een ladder van banden moet worden zichtbaar in elke baan.
    3. Het membraan halen uit de kleurstofoplossing met een pincet en zie als de ladder van bands uniform patroon en intensiteit heeft in elke baan waar de monsters zijn geladen.
    4. Na het controleren van de kleuring, verwijder de kleurstofoplossing en voeg van TBST buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, van 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan Propyleenglycolmonolauraat). Het volume van de buffer moet voldoende zijn ter dekking van een membraan.
      Opmerking: De Ponceau S oplossing kan worden verzameld en opnieuw meerdere malen gebruikt.
    5. Rock de membranen in TBST op een rockende shaker (~ 60 rpm) bij kamertemperatuur totdat er geen zichtbare banden blijven op de membranen.
    6. Herhaal de stap wassen met verse TBST voor 5 min.
  • Verwijder en verwerp de TBST. Blokkeren door het toevoegen van 5% (m/v) afgeroomde melk opgelost in TBST en schommelen op een shaker (~ 60 rpm) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het volume van de blokkerende oplossing moet voldoende zijn ter dekking van een membraan.
  • Primair antilichaam oplossingen bereid door verdunning van primaire antilichamen (anti-Rab10 antistof voor endogene Rab10) en anti-HA antilichaam voor overexpressie HA-Rab10 in 10 mL per membraan van de blokkerende oplossing (Zie Tabel van materialen voor concentraties).
  • Verwijder en negeren de blokkerende oplossing en voeg het primaire antilichaam. Na de membranen op een rockende shaker (~ 60 rpm) een nacht bebroeden bij 4 ° C.
  • Het primaire antilichaam-oplossing verwijderen en toevoegen van TBST om te wassen van de membranen. Het volume van de buffer moet voldoende zijn ter dekking van een membraan.
  • Incubeer de membranen voor 5 min op een rockende shaker (~ 60 rpm) bij kamertemperatuur. Het wassen (stap 3.16) in totaal 3 keer herhalen met vers TBST telkens.
  • Bereiden secundair antilichaam oplossingen door verdunnen secundair antilichaam aangeduid met horseradish peroxidase (HRP) 10 ml per membraan van de blokkerende oplossing. Gebruik anti-konijn IgG antilichamen gelabeld met HRP voor membranen gesondeerd met het antilichaam van de anti-Rab10 en anti-muis IgG antilichamen gelabeld met HRP voor die peilden met de anti-HA antilichaam (Zie Tabel van materialen voor concentratie).
  • Verwijder en negeren de TBST na de derde wassen en voeg de secundair antilichaam-oplossing. Incubeer de membranen op een rockende shaker (~ 60 rpm) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  • De membranen in TBST wassen gedurende 10 minuten herhalen het wassen stap in totaal 3 keer, vergelijkbaar met stap 3.17.
  • Ontwikkelen van de membranen met behulp van Verbeterde Chemiluminescentie (ECL).
    Opmerking: Belichtingstijd kan variëren afhankelijk van de oplossing van het ECL en het systeem dat wordt gebruikt voor de detectie van Chemoluminescentie.
    1. Zet een imager uitgerust met een camera van de charge - coupled apparaat (CCD) en een computer die is verbonden met de imager. Start de controle-software voor de imager. Wacht totdat de temperatuur van de CCD-camera heeft bereikt-25 ° C.
    2. 1 mL van de oplossing van ECL voor één membraan zetten een plastic wrap verspreid op een bankje.
    3. Zet een membraan gel-side-up op het ECL-oplossing en vervolgens snel wegknipt het over zodat de beide zijden van de membraan zijn bekleed met de oplossing.
    4. Het membraan halen en het afvoer door te laten van één kant van het membraan touch een papieren handdoek voor 5 s.
    5. Zet de membraan tussen duidelijk films (b.v., duidelijke papieren zakken).
      Opmerking: Plasticfolie wordt niet aanbevolen voor het verpakken van de membranen. De duidelijke films gebruikt voor het verpakken van het membraan moeten zo plat mogelijk zonder zichtbare rimpels te voorkomen van ongelijke achtergrond.
    6. Plaats het membraan op een zwarte dienblad. Zet de lade in de imager en sluit de deur.
    7. Klik op de "Bundeling" knop in het venster van de besturingssoftware. Controleer dat het membraan juist gepositioneerd is. Klik op de "Terug" knop.
    8. Selecteer "Precisie" voor "Type van de blootstelling". Selecteer "Handleiding" voor "blootstellingstijd" en de blootstellingstijd ingesteld op 1 s.
    9. Selecteer 'Hoog' voor "Gevoeligheid/oplossing". Laat "Digitalisering afbeelding toevoegen" uitgevinkt. Klik op de "Start" knop om een afbeelding.
    10. Het beeld dat verscheen op het display in de computer opslaan als een TIFF-bestand.
    11. Herhaal opnamen met de belichtingstijd van 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s en maximaal 180 s. Bij het nemen van de laatste afbeelding, check "Digitalisering afbeelding toevoegen" zodat het digitale beeld, niet de Chemoluminescentie, van het membraan kan gelijktijdig worden gehouden.
    12. Selecteer het beste beeld met de grootste dynamisch bereik en zonder enige saturating pixels (afgebeeld in het rood) in de bands van belang.
      Opmerking: Conventionele röntgenfoto films kunnen ook worden gebruikt voor detectie van19.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Overexpressie systeem: Fosforylatie van HA-Rab10 door 3 × vlag-LRRK2 in de HEK293 cellen:

    HEK293 cellen werden transfected met 0.266 µg HA-Rab10 wild-type en 1.066 µg 3 × vlag-LRRK2 (wild-type, kinase-inactieve mutant (K1906M) of FPD mutanten). Rab10 fosforylatie werd onderzocht door P-tag SDS-pagina gevolgd door immunoblotting met behulp van een anti-HA antilichaam (Figuur 2). 10 µg van eiwitten zijn ...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Hier beschrijven we een facile en robuuste methode voor het opsporen van Rab10 fosforylering door LRRK2 endogene niveau op basis van de methodologie van de P-tag. Omdat het op dit moment beschikbare antilichaam tegen gefosforyleerd Rab10 alleen met overexpressie eiwitten15 werkt, is de huidige methode met behulp van P-tag SDS-pagina de enige manier om te beoordelen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering. Bovendien kan de huidige methode de schatting van de stoichiometrie van fosforylering va...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Wij bedanken Dr. Takeshi Iwatsubo (Universiteit van Tokyo, Japan) voor het vriendelijk verstrekken de plasmiden codering van 3xFLAG-LRRK2 WT en mutanten. Wij danken ook Dr. Dario Alessi (Universiteit van Dundee, UK) voorzien van kandidatuur MLi-2 en de plasmide codering HA-Rab10. Dit werk werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI Grant nummer JP17K08265 (G.I.).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    ```html

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Reagents
    Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS)zelfgemaakt150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ water en gesteriliseerd door autoclaving
    NatriumchlorideNacalai Tesque31320-34
    Natriumdisodiumwaterstoffosfaat 12-WaterWako196-02835
    KaliumchlorideWako163-03545
    KaliumdiwaterstoffosfaatWako169-04245
    2,5% Trypsine (10X)Sigma-AldrichT4549Verdun 10-voudig met steriele DPBS voor het bereiden van werkoplossing
    Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium
    (DMEM)    		Wako044-29765
    Foetaal runderserumBioWestS1560Verhit geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min
    Penicilline-Streptomycine (100X)Wako168-23191
    HEPESWako342-01375
    NatriumhydroxideWako198-13765
    Polyethyleenimine HCl MAX, Lineair, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)PolySciences, Inc.24765-1Staloplossing werd bereid in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,0 bij 1 mg/mL en de pH werd vervolgens aangepast tot 7,0 met NaOH
    DimethylsulfoxideWako045-28335
    TrisSTARRSP-THA500G
    ZoutzuurWako080-01066
    Polyoxyethyleen(10) OctylfenyletherWako160-24751Equivalent aan Triton X-100
    Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)Wako346-01312
    Natriumorthovanadate(V)Wako198-09752
    NatriumfluorideKanto Chemical37174-20
    β-Glycerofosforzuur Dinatriumzout PentahydraatNacalai Tesque17103-82
    Natriumpyrofosfaat decahydraatKokusan Chemical2113899
    Microcystine-LRWako136-12241
    SucroseWako196-00015
    Complete EDTA-vrije proteaseremmercocktailRoche11873580001Los een tablet op in 1 mL water, die kan worden bewaard bij -20 °C gedurende een maand. Gebruik het bij 1:50 verdunning voor cellyse
    Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
    NatriumdodecylsulfaatNacalai Tesque31607-65
    GlycerolWako075-00616
    BroomfenolblauwWako021-02911
    β-mercaptoethanolKanto Chemical25099-00
    EthanolWako056-06967
    MethanolWako136-01837
    Fosfaatbindende tag acrylamideWakoAAL-107P-tag acrylamide
    40% (w/v) acrylamideoplossingNacalai Tesque06119-45Acrylamid:Bis = 29:1
    Tetramethylethyleendiamine (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    Ammoniumpersulfaat (APS)Wako016-0802110% (w/v) oplossing werd bereid door het poeder van ammoniumpersulfaat op te lossen in MilliQ water
    2-propanolWako166-04831
    Mangaanchloride tetrahydraatSigma-AldrichM3634
    Precision Plus Protein Prestained StandardBio-Rad1610374, 1610373, 1610377Molecuulgewichtmarker gebruikt in het protocol
    WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker IIIWako230-02461
    GlycineNacalai Tesque17109-64
    Amersham Protran NC 0.45GE Healthcare10600007Nitrocellulosemembraan
    Durapore MembraanfilterEMD MilliporeGVHP00010PVDF-membraan
    Filterpapieren nr. 1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    AzijnzuurWako017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379polyoxyethyleensorbitanmonolauraat
    Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Wako345-01865
    MelkeiwitpoederDifco Laboratories232100
    ImmunostarWako291-55203ECL-oplossing (Normale gevoeligheid)
    Immunostar LDWako290-69904ECL-oplossing (Hoge gevoeligheid)
    CBB-kleuroplossingzelfgemaakt1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) azijnzuur in 1 L MilliQ water
    CBB R-250Wako031-17922
    CBB-ontkleuringsoplossingzel

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    SDS PAGE analyseWestern blottingHEK293 cellenonderzoek naar Parkinsonkinase assayP tag systeemendogeen Rab10

    Gerelateerde artikelen